Induksjon av perifert trent immunitet i bukspyttkjertelen stimulerer antitumoraktivitet for å kontrollere progresjon av bukspyttkjertelkreft Del 1

Til tross for den bemerkelsesverdige suksessen med immunterapi i mange typer kreft, har duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen ennå til gode. Medfødte immunceller er kritiske for anti-tumor immunovervåking, og nyere studier har avslørt at disse populasjonene har en form for hukommelse, kalt trent medfødt immunitet, som oppstår gjennom transkriptomisk, epigenetisk og metabolsk omprogrammering.

Her demonstrerer vi at gjær-avledet partikkelformig -glukan, en induser av trent immunitet, transporterer til bukspyttkjertelen, noe som forårsaker en CCR2-avhengig tilstrømning av monocytter/makrofager til bukspyttkjertelen som viser trekk ved trent immunitet. Disse cellene kan aktiveres ved eksponering for tumorceller og tumoravledede faktorer, og viser økt cytotoksisitet mot bukspyttkjertelsvulstceller. I ortotopiske modeller av duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen, viser -glukanbehandlede mus betydelig redusert tumorbyrde og forlenget overlevelse, som forsterkes ytterligere når de kombineres med immunterapi. Disse funnene karakteriserer de dynamiske mekanismene og lokaliseringen av perifert trent immunitet og identifiserer en anvendelse av trent immunitet mot kreft.

Immunitet har mange funksjoner, som å rydde gamle og skadede celler: Immunsystemet kan også rydde gamle og skadede celler, inkludert tumorceller, for å beskytte kroppen mot sykdommer. Det kan også opprettholde kroppens balanse: Immunsystemet kan også balansere det indre miljøet i kroppen, opprettholde balansen mellom immunceller og unngå fremveksten av sykdommer som overreaksjon eller immunsvikt, så immunitet er veldig viktig for menneskekroppen.

Samtidig fant vi ut at Cistanche deserticola også kan forbedre immuniteten. Cistanche er rik på en rekke biologisk aktive ingredienser, som polysakkarider, flavonoider, steroler osv. Disse ingrediensene kan stimulere aktiviteten til immunceller i kroppen, forbedre cellulær immunitet og humoral immunitet, og hemme vekst og reproduksjon av virus og bakterie. Forbedre kroppens motstand og immunitet. I tillegg har Cistanche også antioksidanter, antiinflammatoriske og beroligende effekter, som kan bidra til å lindre fysisk tretthet og eliminere stress for å forbedre immuniteten.

Klikk for å vite cistanche deserticola supplement

Diagnosen pankreas duktalt adenokarsinom (PDAC) er ødeleggende, med bare 10 prosent av pasientene som har overleve de siste 5 årene1. Selv om overlevelsesraten siden 2014 har økt fra 6 til 10 prosent, er kreft i bukspyttkjertelen fortsatt motstandsdyktig mot de fleste tilgjengelige terapier.

I tillegg, ettersom demografien til USA endrer seg, anslås det at kreft i bukspyttkjertelen vil bli den nest største årsaken til kreftrelatert dødelighet innen 2030 og dermed utgjøre en betydelig fremtidig utfordring for klinikere2. Bukspyttkjertelkreft er spesielt dødelig fordi det i tidlige stadier sjelden er kliniske symptomer, noe som resulterer i at 75–80 prosent av pasientene får diagnosen avansert, ikke-opererbar sykdom3,4. Selv hos pasienter som er kvalifisert for reseksjon, er 5-årsoverlevelsen bare 20–25 prosent 4. Videre har kreft i bukspyttkjertelen vist liten respons på immunterapier som har vist bemerkelsesverdige effekter i andre solide svulster5–9. De kliniske fase I- og II-studiene med CTLA-4- og PD-1-hemmere både alene og i kombinasjon har blitt ansett som ineffektive for behandling av PDAC, noe som sannsynligvis forklares av den ikke-immunogene naturen til PDAC10– 12.

En stor utfordring for vellykket anvendelse av immunterapi i PDAC er å overvinne det immunsuppressive bukspyttkjertelsvulstmikromiljøet (TME). PDAC er preget av et tett protumorigent desmoplastisk stroma, en overflod av immunsuppressive celleundergrupper i dette stromaet, slik som tumorassosierte makrofager (TAM), regulatoriske T-celler (T-regs) og myeloid-avledede suppressorceller (MDSCs) , mangel på aktiverte anti-tumor immunceller, og hypervaskularitet som gir et hypoksisk mikromiljø13–16. Sammen gjør disse forholdene det eksepsjonelt utfordrende å effektivt levere immunterapi til bukspyttkjertelen og for disse terapiene å lykkes med å aktivere antitumorimmunresponser hvis de kommer dit. Derfor er det desperat behov for nye terapeutiske midler som ikke bare spesifikt kan målrette seg mot bukspyttkjertelen, men også kan infiltrere det tette desmoplastiske stromaet, og som er i stand til å stimulere til robuste antitumorimmunresponser til tross for den immunsuppressive TME.

Opplært medfødt immunitet er et evolusjonært eldgammelt program for immunologisk hukommelse som nylig har vært under dyptgående vitenskapelig undersøkelse. Trente medfødte immunceller har vist seg å gjennomgå transkriptomisk, epigenetisk og metabolsk omprogrammering ved eksponering for spesifikke initiale stimuli, og når disse medfødte immuncellene gjeneksponeres for en sekundær heterolog stimulus, blir de "trent" til å være mer responsive på den stimulansen som manifesterer seg i en forsterket inflammatorisk respons17–19. Mange biologiske legemidler kan indusere trent immunitet, inkludert Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaksinen og den naturlige forbindelsen -glukan. Selv om de fleste studier angående trent immunitet fokuserer på patogener som bakterier og virus som en sekundær stimulus, tyder nye studier på at tumorceller også kan reaktivere trente immunceller. All forskning til dags dato har brukt subkutane kreftmodeller, derfor er det ikke kjent om tilstedeværelsen av trente medfødte immunceller kan påkalle antitumoreffekter på svulster i faste organer, som kreft i bukspyttkjertelen20,21.

I denne studien oppdaget vi uventet at intraperitonealt (IP) injisert gjær-avledet partikkelformig glukantrafikk i stor andel av bukspyttkjertelen. Den direkte trafikken av -glukan til bukspyttkjertelen fremhever en tidligere ukarakterisert vei for induksjon av perifert trent immunitet. I tillegg testet vi hypotesen om at denne handelen kan føre til induksjon av antitumorimmunitet mot kreft i bukspyttkjertelen. Gitt svikt i flertallet av terapeutika og immunterapi alene og i kombinasjon for å behandle PDAC og vanskeligheten med å målrette disse terapeutika mot bukspyttkjertelen, gir funnene våre samlet et potensielt gjennombrudd i ikke bare målretting mot bukspyttkjertelen direkte, men også når det gjelder å rekruttere anti-tumor, medfødte immunceller til den immunologisk kalde PDAC TME.

Resultater

Gjær-avledet partikkelformig glukan transporteres fortrinnsvis til bukspyttkjertelen.

Det er godt dokumentert at administrering av -glukaner fra bakterier og sopp øker antall og frekvenser av hematopoietiske stamceller og multipotente stamceller som er forutinntatt mot myeloid avstamning, som til slutt fungerer som et viktig skritt i induksjonen av sentral og perifert trent immunitet22 . Det er imidlertid ennå ikke vist hvor nøyaktig -glukan trafikkerer etter administrering for å ha disse effektene.

I disse studiene ble hele -glukanpartikler (WGP) avledet fra Saccharomyces cerevisiae brukt, som er 2–4 mikron hule gjærceller laget av høykonsentrerte (1,3) -glukaner. Den detaljerte karakteriseringen av WGP-glukan er beskrevet i en av våre andre studier. I motsetning til andre former for -glukan som brukes i trent immunitet, er denne formuleringen unik ved at den er partikkelformet og krever aktiv fagocytose for å utøve sine effekter. For å vurdere handelen med dette partikkelformede -glukanet, ble WGP merket med (5-(4,6- Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein) (DTAF) og injisert IP i villtype (WT) C57BL/6-mus. Tre dager etter IP-administrering (3-dag WGP), ble lunge, milt, inguinale og mesenteriske lymfeknuter, bukhuleceller og bukspyttkjertel høstet, vasket med iskald PBS for å vaske bort DTAFWGP fra bukhinnen som kan har blitt festet til overflaten av organet, og tilstedeværelsen av DTAF-WGP i hvert organ ble vurdert ved flowcytometri. Mens det var noe trafikk av DTAF-WGP til milten, mesenteriske lymfeknuter og gjenværende DTAF-WGP i bukhulen, viste bukspyttkjertelen en slående og uventet tilstedeværelse av DTAF-WGP (fig. 1a).

For ytterligere å vurdere denne trafikken og for å sikre at DTAF-merket ikke var involvert i menneskehandelsmekanismen, ble WGP radiomerket med 89Zr og injisert IP (fig. 1b) eller inkubert med peritoneale makrofager som deretter ble injisert IP (fig. 1c). Mus ble først avbildet ved hjelp av en PET/CT-skanning 48 timer etter injeksjon og grønne sirkler brukes for å indikere den observerte preferanseakkumuleringen av 89Zr-WGP i bukspyttkjertelen. En nekroskopi ble deretter utført og den radioaktive signaturen til hvert organ ble målt. Ut fra flowcytometridataene ble 89Zr-WGP transportert i store mengder til bukspyttkjertelen og ble funnet i lavere nivåer i milten, leveren og tarmsystemet. Peritoneale makrofager som ble dyrket med 89Zr-WGP og deretter injisert IP hadde lignende, men litt mer diversifisert trafficking enn den rene 89Zr-WGP, og akkumulerte også mest fremtredende i bukspyttkjertelen (fig. 1d). Trafficking av peritoneale makrofager lastet med WGP til bukspyttkjertelen indikerer at både nakne WGP så vel som makrofager som har fagocytert WGP viser tropisme til bukspyttkjertelen.

For å vurdere rollen som den kjente reseptoren til WGP spilte i handel med WGP, ble mus som manglet C-type lektinreseptoren, Dectin-1, (Dectin-1-/− mus) injisert med IP med DTAF-WGP. Sammenlignet med WT-mus, viste Dectin-1-/−-mus en femdobling i mengden WGP som ble transportert til bukspyttkjertelen, vurdert ved flowcytometri (fig. 1d). 89ZrWGP har også injisert IP i WT-mus og Dectin-1-/−-mus. Sammenlignet med WT-dyr, var det signifikant mindre trafikk av 89Zr-WGP til bukspyttkjertelen til Dectin{10}}-/− mus (fig. 1e). For å sikre at denne prosessen var -glukanspesifikk, ble en polystyrenbasert lateks 3 μm fluorescerende partikkel, samme størrelse som en WGP-partikkel, injisert IP og ble ikke funnet å akkumulere i bukspyttkjertelen (Supplerende Fig. 1a). Sammen fremhever disse dataene en tidligere ukarakterisert dektin-1-avhengig tropisme der -glukan transporteres til bukspyttkjertelen.

Fig. 1 Partikkel-glukan transporterer til bukspyttkjertelen på en dektin-1-avhengig måte. en DTAF-WGP ble injisert IP og 3 dager senere ble forskjellige vev (n=3) høstet og vurdert for tilstedeværelsen av DTAF-WGP ved flowcytometri. Representative punktplott og oppsummerte data vises. *p=0.032, **p=0.0057, ****p < 0,0001. b WGP ble merket med 89Zr-WGP eller c peritoneale makrofager ble inkubert med 89Zr-WGP og vasket, etterfulgt av IP-injeksjon. PET/CT-avbildning viser trafikken av 89Zr-WGP etter 48 timer. Organer ble individuelt vurdert for radioaktivitet etter en nekroskopi ved bruk av en gammateller. I c rapporteres signifikans sammenlignet med bukspyttkjertelen (n=3). ****p < 0,0001. d Dectin-1-/− mus eller WT-mus ble injisert med DTAF-WGP og akkumulering av DTAF-WGP i bukspyttkjertelen ble vurdert ved flowcytometri (WT PBS n=3, WT WGP n {{ 27}}, KO pluss PBS n=3, KO pluss WGP n=4). e Dectin-1-/− mus eller WT-mus (n=4) ble injisert med 89Zr-WGP og 48 timer senere ble en PET/CT brukt for å vurdere mengden i bukspyttkjertelen. Signalet ble kvantifisert ved å rapportere prosentandelen av injisert dose (prosent ID) i bukspyttkjertelen. *p=0.046. En enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligninger ble brukt i a–d, og en uparret, tosidet elevs t-test ble brukt i f.eks. Data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. ns ikke signifikant; Hver prøve representerer et biologisk uavhengig dyr oppnådd over et enkelt uavhengig eksperiment som ble gjentatt minst to ganger for verifisering av resultatene.

-Glukan som transporterer til bukspyttkjertelen stimulerer til en tilstrømning av medfødte immunceller som viser en fenotype av trent immunitet.

Etter å ha oppdaget at -glukan viser tropisme mot bukspyttkjertelen, ble det også observert at immunlandskapet til bukspyttkjertelen ble betydelig endret etter WGP-behandling. Ankomsten av WGP til bukspyttkjertelen ble ledsaget av en tydelig tilstrømning av CD11b pluss myeloidceller til bukspyttkjertelen på dag 3, hvorav noen hadde fagocytert WGP (fig. 2a).

Dette funnet førte til at vi undersøkte hvordan den generelle immunpopulasjonen i bukspyttkjertelen påvirkes etter IP WGP-behandling. Siden det tidligere har blitt observert at immunforandringene assosiert med trent immunitet i BM er mest uttalt 1-uke etter eksponering for -glucan22, ble immunprofilen til bukspyttkjertelen undersøkt hos mus behandlet med en 3 μm polystyrenmikropartikkel eller WGP 7 dager etter administrering. For det første ble det observert at det var omtrent syv ganger økning i det totale absolutte antallet CD45 pluss immunceller i bukspyttkjertelen etter WGP-behandling (fig. 2b). 3 μm polystyren mikropartikkelkontrollen hadde ikke slike effekter (Supplerende Fig. 1b), noe som indikerer at denne immuncelletilstrømningen er WGP-spesifikk. I tillegg ble det observert en økning i prosentandelen av CD45 pluss immunceller (tilleggsfigur 1c).

For ytterligere å klassifisere hvilke celletyper som var ansvarlige for denne utvidelsen av CD45 pluss immunpopulasjonen, det absolutte antallet (Fig. 2b) og relative prosent (Supplerende Fig. 1c) av myeloide celler (CD11b pluss), T-celler (CD3 pluss) , B-celler (CD19 pluss) og NK-celler (NK1.1 pluss) ble evaluert. De kumulative endringene i bukspyttkjertelen er representert av kakediagrammer som viser at ekspansjonen av myeloidrommet er ansvarlig for den relative reduksjonen i prosentandelen av andre cellepopulasjoner og den totale økningen i CD45 pluss-populasjonen etter WGP-behandling (fig. 2c). . Vi undersøkte deretter om denne tilstrømningen av CD11b pluss immunceller var forbigående, så prosentandelen av totale CD45 pluss celler og CD11b pluss celler i bukspyttkjertelen etter IP-injeksjon ble målt etter 7, 10, 18 og 30 dager.

Fig. {{0}}glukan stimulerer en tilstrømning av trente myeloidceller inn i bukspyttkjertelen. en prosent av CD45 pluss CD11b pluss DTAF pluss celler i bukspyttkjertelen 3 dager etter at WT mus mottok IP DTAF-WGP. b Syv dager etter PBS- eller WGP-injeksjon, absolutte tall for CD45 pluss (n=15), CD11b pluss (n=18), CD3 pluss (n {{1{{30} }}}), CD19 pluss (n=10) og NK1.1 pluss (n=14) celler vises. ****p < 0.0001. c Sektordiagram som representerer frekvensendringer av store immuncellepopulasjoner etter WGP-behandling. d WT-mus ble injisert med PBS (n=5) eller WGP (n=5) og prosentandelen av CD45 pluss og CD45 pluss CD11b pluss celler ble målt 7, 10, 18 og 30 dager senere ( n=3). **p=0.0034, ****p < 0.0001 (CD45), **p=0.0023 (CD11b). e Absolutte tall på F4/80 pluss (n=10), Ly6C pluss (n=10) og Ly6G pluss (n=8) innenfor CD11b pluss-populasjonen. **p=0,003, ****p < 0,0001. f Syv dager etter IP PBS eller WGP ble bukspyttkjertelen restimulert med LPS. TNF-produksjon i CD11b pluss (n=28), CD11b pluss F4/80 pluss (n=9), og CD11b pluss Ly6C pluss (n=8) celler ble målt. *p=0.024, ***p=0.0001, ****p < 0.0001. g Syv dager etter PBS eller WGP ble CD45 pluss CD11b pluss-populasjonen beriket (n=4). Celler ble restimulert med eller uten LPS i 24 timer. TNF- og IL-6-produksjon ble målt ved bruk av ELISA. ****p < 0,0001. h Pankreas CD11b pluss celler fra PBS og WGP-trente mus ble sortert. RT-qPCR ble gjort for å kvantifisere TNF (n=4), IL-6 (n=4), iNOS (PBS n=4, WGP n=3) , og IL-10 (PBS n=4, WGP n=5) mRNA-ekspresjonsnivåer. *p=0.028, **p=0.0018, ****p < 0,0001. I CD11b pluss-celler fra PBS eller WGP-injiserte mus (24 timer) ble sortert (n=4). Histoner ble isolert og utsatt for western blot-analyse (øverst) eller ELISA (nederst) for H3K4me3, H3K27Ac, ​​H3K27me3 og totalt H3. ****p < 0,0001. j Syv dager etter IP WGP eller PBS ble populasjoner av pankreas CD45 pluss CD1b pluss sortert. RNA-Seq-analyse ble utført (PBS n=3, WGP n=3).

Fordelingen av p-verdier (–log10(p-verdi)) og foldendringer (log2 FC) av differensielt uttrykte gener er representert. k t-SNE-plott av CD11b pluss-populasjonen i mus trent med PBS eller WGP 7 dager før og analysert med CyTOF (PBS n=3, WGP n=3). Uparede, to-halede elevs t-tester ble brukt i b, e, f og h. En enveis ANOVA med flere sammenligninger ble brukt i d, g og i. Data representert som gjennomsnitt ± SEM. ns ikke signifikant. Hver prøve representerer et biologisk uavhengig dyr oppnådd over et enkelt uavhengig eksperiment.

Mens prosentandelen av CD11b pluss-celler nådde en topp på dag 7, så prosentandelen av CD45-plussceller ut til å toppe seg på dag 10, noe som kan indikere at etter tilstrømningen av CD11b pluss-celler til bukspyttkjertelen, kan en tilstrømning av andre immuncelletyper følge. Prosentandelen av immunceller i bukspyttkjertelen sank til basale nivåer på dag 30, noe som viser at denne tilstrømningen er forbigående (fig. 2d). Innenfor myeloidrommet observerte vi at det absolutte antallet (Fig. 2e) og prosenten (Supplerende Fig. 1c) av makrofager (F4/80 pluss), monocytter (Ly6C pluss) og nøytrofiler (Ly6G pluss) alle var økt. Tilstrømningen av immunceller til bukspyttkjertelen ble også vist å være avhengig av dosen av WGP injisert, der høyere doser av WGP var assosiert med økt tilstrømning av total CD45 pluss CD11b pluss myeloidceller og CD45 pluss CD11b pluss F4/80 pluss makrofager (Supplerende Fig. Id).

Ettersom pankreatitt og ødeleggelse av bukspyttkjerteløyer er assosiert med immuncelleinfiltrering av bukspyttkjertelen, ble H pluss E i bukspyttkjertelen utført for å vurdere integriteten til acini 7 dager etter WGP-administrasjon (tilleggsfig. 1e). Serumamylase, en diagnostisk markør for pankreatitt, ble også målt i WGP vs PBS-behandlede mus 7 dager etter injeksjon (tilleggsfigur 1f). Verken øyene eller serumamylasen ble negativt påvirket av WGP-behandling og den observerte immuntilstrømningen, noe som indikerer at immuncelletilstrømningen i denne mekanismen ikke forårsaker ødeleggelse av bukspyttkjertelen.

For å undersøke om cellene som ble funnet å infiltrere musebukspyttkjertelen etter WGP-behandling viste en fenotype av trent immunitet, brukte vi en standard treningsprotokoll der mus ble behandlet med WGP eller PBS og 7 dager senere ble bukspyttkjertelen høstet og deretter restimulert med LPS. TNF-produksjon har blitt brukt som en surrogatmarkør for å evaluere den trente responsen. Totalt ble CD11b pluss myeloidceller, CD11b pluss F4/80 pluss makrofager, og CD11b pluss Ly6C pluss monocytter alle vist å produsere mer TNF- på grunn av tidligere eksponering for WGP, vurdert av prosenten av TNF-pluss-celler og MFI (fig. . 2f). For ytterligere å vurdere disse funnene ble CD11b pluss-celler sortert fra bukspyttkjertelen til disse musene og restimulert ex vivo med LPS, og TNF- og IL-6-nivåene i supernatantene ble målt ved hjelp av ELISA. Sammenlignet med CD11b pluss-celler fra PBS-mus, produserte celler fra WGP-trente mus som ble restimulert med LPS signifikant mer TNF- og IL-6 (fig. 2g), noe som indikerer at WGP-behandlede pankreas-CD11b plus-celler ble trent.

Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved bruk av RT-PCR, hvor pankreas CD11b pluss-celler sortert fra PBS eller WGP-trente mus ble vist å produsere mer TNF-, IL-6, iNOS og mindre IL-10 pga. WGP-behandling (fig. 2h). Siden trent immunitet er assosiert med metabolsk og epigenetisk omprogrammering23, målte vi laktatnivåer for å undersøke om glykolyse er involvert. Faktisk utskilte WGP-trente CD11b pluss-celler mer laktat sammenlignet med utrente celler (Supplerende Fig. 1g). Vi målte også histonmodifikasjoner av WGP-trente CD11b pluss-celler. Som vist i fig. 2I, ble ekspresjonsnivåene til H3K4me3 og H3K27Ac betydelig forbedret i WGP-trente CD11b pluss-celler. Dette ble avslørt ved både western blot-analyse (fig. 2i, øverst) og ELISA kvantitativ analyse (fig. 2i, nederst). Sammen indikerer disse funnene at WGP ikke bare stimulerer en trent fenotype i cellene som trafikkerer inn i bukspyttkjertelen, men at de også gjennomgår metabolsk og epigenetisk omprogrammering.

RNA-sekvensering (RNA-Seq) ble deretter utført på FACS-sorterte CD45 pluss CD11b pluss-celler 7 dager etter PBS- eller WGP-administrasjon for å oppnå en objektiv og omfattende karakterisering av myeloide populasjoner i bukspyttkjertelen. Totalt 1459 differensielt uttrykte gener (DEGs) ble oppdaget, med 661 oppregulerte og 798 gener nedregulert i WGPtrained-innstillingen (fig. 2j). Gensettanrikningsanalyser (GSEA) bekreftet ytterligere tidligere undersøkte oppreguleringer i veier relatert til TNF- og IL-6-produksjon (tilleggsfigur 2a). Ved den observerte tilstrømningen av immunceller ble DEG-ene relatert til leukocyttkjemotaksi, leukocyttmigrasjon (tilleggsfigur 2a), monocyttkjemotaksi, makrofagmigrasjon og myeloid leukocyttmigrasjon (tilleggsfigur 2b) alle betydelig beriket i WGP-gruppen. I tillegg ble reaktomveiene CLEC7A dektin-1-signalering og C-type lektinreseptorveier betydelig beriket, noe som ytterligere bekrefter Dectin{17}}-involveringen i denne prosessen (tilleggsfig. 2c).

Tatt i betraktning at myeloidpopulasjonen ble observert å være ansvarlig for utvidelsen av CD45 pluss-populasjonen og at myeloide celler er en mangfoldig populasjon, ble CyTOF-analyse utført på pankreata fra mus behandlet med PBS eller WGP 7 dager før. Cellepopulasjoner i bukspyttkjertelen ble identifisert og sammenlignet mellom behandlingsgrupper; t-SNE-plott indikerte at etter WGP-behandling var det en relativ reduksjon i den bosatte makrofagpopulasjonen som sterkt uttrykker M2-markører som CD206. Vi observerte også utseendet til flere myeloide populasjoner i bukspyttkjertelen som ble definert som Ly6C pluss makrofagavledede monocytter, infiltrerende inflammatoriske monocytter, aktiverte makrofager og CD206 pluss aktiverte makrofager (fig. 2k og tilleggsfigur 2d). viSNE-plott gated på CD11b pluss-populasjonen viste en tydelig utvidelse av monocytter og makrofager, med ytterligere økninger av dendritiske cellen (DCs), nøytrofile og NK-populasjoner etter WGP-behandling (tillegg Fig. 2e).

I tillegg fremhever disse analysene at etter WGP-trening og LPS-stimulering ble TNF primært produsert av makrofager og monocytter, IL-6 og iNOS ble primært produsert av makrofager, Granzyme-B ble produsert av NK-celler og makrofager, og IFN ble produsert av makrofager. hovedsakelig produsert av nøytrofiler (Supplerende Fig. 2f). Dette avslører at mens mange cellepopulasjoner endres på grunn av WGP-behandling, er de primære cellene trent av WGP, vurdert ved økt TNF-ekspresjon, makrofager og monocytter, og at det ikke er en enkelt celletype som er ansvarlig for fenotypen til den trente immuniteten som var observert.

For å vurdere om dette fenomenet med myeloide celletilstrømning og aktivering var avhengig av andre immunpopulasjoner eller drevet helt av myeloidcellene selv, utarmet vi spesifikke immunpopulasjoner og observerte den trente fenotypen. AntiCD4 og anti-CD8 mAbs ble brukt alene og i kombinasjon for å tømme T-celler, effektiviteten av uttømming ble vurdert (Supplerende Fig. 3a), og den trente fenotypen av myeloide celler ble observert (Supplerende Fig. 3b, c). NK-celler ble også utarmet ved bruk av mAb PK136, uttømmingseffektiviteten ble evaluert (Supplerende Fig. 3d) og den trenede fenotypen ble observert (Supplerende Fig. 3e, f). I fravær av T-celler og NK-celler ble myeloide celler fortsatt observert å bli trent av WGP. Den trente fenotypen ble også vurdert i NSG-mus som mangler B-celler, T-celler og NK-celler (Supplerende Fig. 3g, h). Disse musene viste fortsatt en klar fenotype av trent immunitet.

Til slutt tømte vi nøytrofiler ved å bruke Ly6G mAb. Til tross for uttømming av granulocytter, observerte vi fortsatt WGP-indusert trening i CD11b pluss myeloide avdelingen (Supplerende Fig. 3i–k). Samlet sett støtter dataene våre at de infiltrerende myeloidcellene i bukspyttkjertelen trenes av -glukan uten hjelp eller påvirkning fra adaptive immunpopulasjoner, NK-celler eller granulocytter.

Encellet RNA-sekvensering avslører spesifikke populasjoner av proinflammatoriske makrofager/monocytter som transporteres til bukspyttkjertelen ved -glukanbehandling.

Ettersom våre CyTOF-analyser har avslørt utseendet til flere tidligere ukarakteriserte populasjoner i bukspyttkjertelen etter WGP-behandling, for å få en mer dyptgående forståelse av cellepopulasjonene som er tilstede i bukspyttkjertelen, ble en enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-Seq) utført. på sorterte CD45 pluss-celler fra PBS-behandlede mus og mus behandlet med WGP tre (3-dagers WGP) og syv dager før (7-dagers WGP). Todimensjonal UMAP-representasjon av 11 132 celler aggregert fra tre prøver med klynger som er et resultat av k-nærmeste naboer og Louvain-algoritmer delt inn i 19 forskjellige klynger (fig. 3a, b). Den relative frekvensen av hver klynge i hver eksperimentell gruppe ble vurdert.

Her ble signifikant økning i frekvensen av klynge 3,4 og 10 observert på dag 7 etter WGP-behandling, sammen med en nesten forsvinning av klynge 5 (fig. 3c). Den relative frekvensen til flere andre populasjoner ble også vist å avta over tid. Imidlertid er denne tilsynelatende trenden sannsynligvis på grunn av den relative økningen i frekvensen til andre populasjoner. Totalt sett virker klyngene 3,4,10 og 5 mest signifikant endret på grunn av WGP-behandling (fig. 3d).

Populasjonene som tidligere ble notert å være mest signifikant endret over tid på grunn av WGP-behandling, var en del av myeloidrommet, identifisert ved CSF1R-ekspresjon (fig. 3d, e). Siden disse dataene sammen med tidligere funn tyder på at myeloide populasjoner driver immunforandringene forbundet med WGP-behandling, ble de dynamiske CSF1R pluss-klyngene 3,4,10 og 5 undersøkt mer detaljert som vist med fiolinplott (fig. 3f) og prikk plott som representerer de 12 beste markørgenene etter gjennomsnittlig Z-score for hver klynge (fig. 3g). Klynge 5, som var til stede i PBS-mus, men praktisk talt forsvant etter at WGP-behandling ble identifisert som residente makrofager24,25. Denne klyngen uttrykte også spesielt MAF og APO som begge er relatert til M2 makrofagpolarisering26–28. Klynge 19 var stort sett uendret over tid, så den ble ikke beskrevet mer detaljert, men viste en ekspresjonsprofil som ligner på klynge 5, og representerer dermed også en undergruppe av vevsresidente makrofager. Klynge 10, Ly6Clo-makrofagpopulasjonen, hadde også en lignende ekspresjonsprofil som resident makrofagklynge 5, og bemerkelsesverdige ekspresjonssignaturer av ARG1 og FABP. Vi antar at denne populasjonen er repolariserte fastboende makrofager gitt mangelen på Ly6C-uttrykk, likhet med den fastboende makrofagpopulasjonen og forsvinningen av den fastboende befolkningen etter WGP-behandling. Klynger 3 og 4 delte generell fenotypisk karakterisering som Ly6CHi-infiltrerende monocytter/makrofager. Klynge 4 hadde et bemerkelsesverdig uttrykk for Chil3 og Plac8, som sammen har blitt identifisert av en annen gruppe for å identifisere Ly6Chi-infiltrerende makrofager29.

Til slutt uttrykte klynge 3, som var fraværende i naive mus og viste den største økningen i relativ frekvens blant alle klyngene etter WGP-behandling, betydelige signaturer av TNFAIP2, IL1B, SOD2 og PRDX5, noe som indikerer en sterkt pro-inflammatorisk fenotype. Klynge 3 ble dermed identifisert som Ly6CHi inflammatorisk infiltrerende monocytter/makrofager. Interessant nok er populasjonene som har vist seg å øke på grunn av WGP-behandling de eneste som uttrykker TNFAIP2, noe som indikerer at cellene som kommer inn i bukspyttkjertelen sannsynligvis er trente myeloide celler.

For ytterligere å karakterisere aktiveringsstatusen til hver av de fire dynamiske myeloidklyngene, ble punktplott konstruert for å vise det relative uttrykket av gener assosiert med en pro-inflammatorisk status og en anti-inflammatorisk status (fig. 3h). Klynger 3 og 4, de infiltrerende monocyttene/makrofagene, ble vist å være pro-inflammatoriske, de residente makrofagene var anti-inflammatoriske, og makrofagene i klynge 10 viste en mellomliggende fenotype. I samsvar med tidligere CyTOF- og flowcytometridata, karakteriserer disse scRNA-Seq-dataene ytterligere disse nylig identifiserte myeloidcellene i bukspyttkjertelen til å være en heterogen populasjon av transformerte og repolariserte Ly6CLo-residente makrofager og pro-inflammatoriske Ly6CHi-infiltrerende monocyttavledede makrofager som uttrykker signaturer av trent immunitet.

Den WGP-drevne tilstrømningen og treningen av myeloide celler i bukspyttkjertelen er CCR2-avhengig og skjer så tidlig som 24 timer etter WGP-behandling.

Vi undersøkte deretter hvilke mekanismer som var ansvarlige for denne tilstrømningen av celler inn i bukspyttkjertelen. RNA-Seq-data ble brukt til å karakterisere kjemokiner og cytokiner hvis uttrykk ble betydelig oppregulert ved WGP-behandling (fig. 4a). Mens flere kjemokiner og cytokiner ble oppregulert, vekket vår observasjon av makrofag- og monocytttilstrømning i bukspyttkjertelen en spesifikk interesse for CCR2 på grunn av dens involvering i monocytt- og makrofagrekruttering og monocyttutgang fra benmargen30–32. CyTOF-data viste også en fremtredende økning i CCR2-positive celler etter WGP-behandling (fig. 4b) og scRNA-Seq viste et distinkt uttrykk av CCR2 i klyngene 3 og 4, som var de to populasjonene som viste de mest distinkte fenotyper av trent immunitet (fig. 4c). I tillegg, 24 timer etter WGP-behandling, viste hele bukspyttkjertellysater en 30- ganger økning i CCL2, som er liganden for CCR2 og er involvert i mediering av monocyttkjemotaksi (fig. 4d).

RNA-Seq-data hadde vist en klar signatur på rekruttering og trafficking av immunceller, og disse dataene indikerte også at WGP oppregulerte spredningen av leukocytter og mononukleære celler (fig. 4e). For å undersøke om CCR2 pluss myeloide celler prolifererte når de nådde bukspyttkjertelen, ble prosenten av CCR2 pluss celler som uttrykker Ki67 vurdert i PBS og WGP-behandlede mus. Etter WGP-behandling var det en økning i totale prolifererende celler (fig. 4f) og en stor prosentandel av disse prolifererende cellene var CD11b pluss CCR2 pluss (fig. 4g). Vi undersøkte deretter bidraget til CCR2 pluss-celler til den trente fenotypen. 7 dager etter in vivo-behandling med PBS eller WGP, ble CCR2 pluss og CCR2– populasjoner målt for en trent respons (fig. 4h). Disse dataene indikerte at flertallet av cellene som ble trent etter WGP-behandling var CCR2 pluss.

For ytterligere å undersøke rollen til CCR2 i -glukantrente monocytter/makrofager, ble CCR2−/− mus trent med WGP-glukan. CCR2−/− mus gjennomgikk ikke en tilstrømning av CD45 pluss (fig. 4i) eller CD45 pluss CD11b pluss myeloidceller (fig. 4j) inn i bukspyttkjertelen, og viste ikke en trent respons som avslørt av TNF-produksjon (fig. 4k). Disse dataene indikerer at CCR2 spiller en kritisk rolle i migreringen av medfødte immunceller til bukspyttkjertelen og induksjon av perifert trent immunitet i bukspyttkjertelen.

Som tidligere nevnt er CCR2 viktig for tidlig rekruttering av monocytter, men mindre viktig for sen rekruttering33. Så langt hadde vi også observert at 7 dager etter WGP-trening var CCR2 kritisk for rekruttering av trente myeloidceller til bukspyttkjertelen. Vi undersøkte deretter om denne tilstrømningen skjedde tidlig etter WGP-trening og om CCR2 pluss myeloide celler ble rekruttert til bukspyttkjertelen. For dette formål ble mus behandlet med PBS eller WGP, og bukspyttkjertelvev ble analysert 24 og 48 timer senere. Overraskende nok, så tidlig som 24 timer etter WGP-trening, øker CD45 pluss (Supplerende Fig. 4a), CD11b pluss (Supplerende Fig. 4b), F4/80 pluss (Supplerende Fig. 4c), Ly6C pluss (Supplerende Fig. 4d). og CDllb pluss CCR2 pluss (Supplerende Fig. 4e) celler ble observert.

I tillegg ble det vist at disse myeloidcellene ble trent så tidlig som 24 timer etter WGP-behandling (Supplerende Fig. 4f). Denne observasjonen fremhever en divergens mellom disse resultatene og tidligere observerte fenotyper av trent immunitet som vanligvis ikke initieres før minst 3 dager etter trening.

Fig. 4 CCR2 er nødvendig for handel med immunceller inn i bukspyttkjertelen. et varmekart av kjemokiner og cytokiner som ble oppregulert i 7-dag WGP-behandlede CD11b pluss-celler basert på RNA-Seq-data. b viSNE-plott av CD11b pluss bukspyttkjertelpopulasjonen i PBS og 7-dagers WGP-trente mus, som fremhever uttrykket av CCR2. Bilder laget med CyTOF-data. c scRNA-Seq-data som viser en UMAP av myeloidklyngene som uttrykker CCR2. d CCL2-ekspresjon i hele pankreaslysater 24 timer etter WGP-behandling a målt ved RT-PCR (n=6). ****p=0.0001. e GSEA genererte anrikningsplott av gener relatert til leukocyttproliferasjon i CD11b pluss bukspyttkjertelceller fra 7-dag WGP-trent sammenlignet med PBS-mus. PBS ble brukt som kontroll og sammenlignet med WGP. f Oppsummerte data for prosentandelen av CD45 pluss pankreasceller som er Ki67 pluss i PBS og 7-dagers WGP-trente mus (n=4). ***p=0.0007. g Celler ble først gatet på CD45 pluss Ki67 pluss-populasjonen. Plott viser prosentandelen av CD45 pluss Ki67 pluss prolifererende pankreasceller som er CD11b pluss CCR2 pluss i PBS og 7-dagers WGP-trente mus (n=4). *p=0.0261. h Pankreasceller fra PBS og 7-dagers WGP-trente mus (n=5) ble restimulert med LPS og prosentandelen av CCR2 positive og negative celler som produserte TNF ble målt i hver tilstand. Celler ble først portet på CD45 pluss CD11b pluss undersett. Representative punktplott og oppsummerte data ble vist. *p=0.022, **p=0.0073, ***p=0.0007. i–k WT og CCR2−/− mus ble behandlet med PBS eller WGP og prosentandelen av I CD45 pluss celler i bukspyttkjertelen (****p < 0,0001) og j prosenten av CD45 pluss celler som var CD11b pluss ble vurdert . **p=0.0013. k Prosentandelen av CD45 pluss CD11b pluss celler som produserer TNF. Representative flytplott og oppsummerte data vises. Hver prikk representerer data fra én mus. ***p=0.0002. (i–k: WT PBS n=9, WT WGP n=9, CCR2−/− PBS n=8, CCR2−/− WGP n=8).

En uparret, tosidet elevs t-test ble brukt i d, f og g, mens en enveis ANOVA med flere sammenligninger ble brukt i h–k. Data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. ns ikke signifikant. I f–k representerer hver prøve et biologisk uavhengig dyr oppnådd over et enkelt uavhengig eksperiment som ble gjentatt minst to ganger for verifisering av resultater.

WGP-trente bukspyttkjertelinfiltrerende myeloidceller viser trente responser på faktorer utskilt fra kreft i bukspyttkjertelen og forbedret fagocytose og ROS-mediert cytotoksisitet til tumorceller.

Siden vi har vist at bruk av WGP som en initial stimulus resulterer i medfødte immunceller som er trent til å reagere mer robust på sekundær eksponering for LPS og at disse cellene akkumuleres i bukspyttkjertelen etter behandling, ønsket vi å vite om sekundære stimuli relatert til bukspyttkjertelsvulster kan også fremkalle denne trente responsen. For dette formål undersøkte vi først om kreftceller i bukspyttkjertelen selv er i stand til å fremkalle den WGP-induserte trente responsen. For å undersøke dette spørsmålet ble peritoneale makrofager dyrket med PBS eller WGP in vitro og 7 dager senere ble restimulert med LPS, supernatanten fra celler dyrket fra en naiv musebukspyttkjertel, og supernatanten fra dyrkede KPC-celler, som er en cellelinje av en bukspyttkjertelsvulst på en C57BL/6-bakgrunn avledet fra LSL-KrasG12D/plus; LSL-Trp53R172H/ pluss ; Pdx1-Cre (KPC) mus eller Pan02 kreftceller i bukspyttkjertelen i 24 timer. TNF-produksjon i supernatanten ble målt ved ELISA.

Sammenlignet med supernatanten fra dyrkede normale bukspyttkjertelceller som ikke aktiverte tidligere trente makrofager, stimulerte supernatanten fra dyrkede KPC- og Pan02-pankreaskreftceller mer TNF- --produksjon i -glukantrente makrofager (tilleggsfig. 5a). I tillegg, for å kontrollere muligheten for at prosessen med fagocytose i seg selv kan føre til at celler blir aktivert, ble peritoneale makrofager dyrket med 3 μm polystyrenmikropartikkelkuler og ble deretter restimulert med PBS eller LPS (Supplerende Fig. 5b). Resultatene viste at økt produksjon av TNF var spesifikt for WGP-trening.

Dette ble deretter testet i en ex vivo-setting der mus ble behandlet med PBS eller WGP og 7 dager senere ble bukspyttkjertelen høstet, myeloidceller i bukspyttkjertelen ble anriket og deretter restimulert med supernatantene fra dyrket KPC (Supplerende Fig. 5c) eller Pan02 celler (Supplerende Fig. 5d). Den viste at WGP in vivo trente CD11b pluss myeloide celler i bukspyttkjertelen produserte betydelig mer TNF- som respons på tumorkondisjonerte medier. Tumorceller selv utskiller en mengde faktorer som spesifikt kan fungere som den andre stimulansen i trent immunitet. Det er kjent at bukspyttkjertelsvulstceller uttrykker høye nivåer av skadeassosierte molekylære mønstre (DAMPs) og pro-inflammatoriske faktorer, slik som makrofagmigrasjonshemmende faktor (MIF). MIF er et cytokin som er kjent for å utskilles i høye konsentrasjoner av bukspyttkjertelsvulster som kan virke direkte på myeloide celler34,35.

Faktisk var MIF tilstede i supernatanten av KPC- og Pan02-celler som vurdert ved ELISA (tilleggsfigur 5e). Vi antok derfor at MIF kan være en potensiell tumor-utskilt faktor som kan fungere som et andre signal i innstillingen av WGP-indusert trent immunitet. For å undersøke dette ble myeloidceller fra bukspyttkjertelen fra in vivo WGP-trente mus restimulert med en lignende konsentrasjon av rekombinant MIF (rMIF) som tilstede i tumorkondisjonerte medier. Som vist i tilleggsfigur 5f, viste bukspyttkjertelmyeloidceller tidligere trent med WGP økt TNF-produksjon ved rMIF restimulering. Samlet antyder disse dataene konseptet om at bukspyttkjertelsvulstceller, gjennom løselige faktorer som de frigjør, kan tjene som det andre signalet for å aktivere myeloide celler i bukspyttkjertelen som har blitt trent av WGP.

Vi undersøkte deretter om disse WGP-trente medfødte immuncellene har forbedrede iboende antitumoregenskaper. RNA-sekvenseringsdata indikerte at fagocytose-relaterte mekanismer ble oppregulert i WGP-innstillingen (fig. 5a), som vi antok kunne være en mekanisme for antitumorfunksjonalitet. De 20 beste berikede KEGG-banene og biologiske prosesser for Gene Ontology (GO) etter WGP-trening er oppført i tilleggstabeller 1 og 2. CD45 pluss panimmunceller og CD11b pluss myeloidceller fra WGP-trent musebukspyttkjertel ble høstet og analysert for fagocytotisk potensial. WGP-behandling førte til en signifikant økning i fagocyttpotensialet til totale CD45 pluss immunceller (fig. 5b) og i CD11b pluss myeloide celler (fig. 5c).

I tillegg viste in vivo-trente myeloidceller en økning i fagocytose av KPC-tumorceller (fig. 5d). Vi vurderte deretter om myeloide celler trent av WGP viste økt cytotoksisitet til KPC-celler. RNA-Seq-data indikerte at DEG-er relatert til biosyntetiske prosesser for reaktive oksygenarter (ROS) og positiv regulering av ROS-metabolske prosesser ble betydelig beriket i WGP-behandlede myeloidceller (fig. 5e).

Som et resultat antok vi at oppreguleringen av ROS-produksjon ved WGP ville resultere i økt bukspyttkjertelmyeloidcellecytotoksisitet til KPC-tumorceller. For å utforske denne hypotesen ble CD11b pluss-celler fra bukspyttkjertelen isolert fra -glukan-trente eller utrente mus og ble belagt med luciferase-uttrykkende KPC-celler (KPCLuc plus) i 24 timer. WGP-trente myeloidceller viste tre ganger økt cytotoksisitet mot KPC-tumorceller, og hemming av ROS-produksjon ved bruk av ROS-hemmeren N-Acetyl Cystein (NAC) opphevet fullstendig den WGP-fremkalte økningen i cytotoksisitet (fig. 5f). ROS-indusert lipidperoksidasjon spiller en kritisk rolle i apoptose, autofagi og ferroptose36. Vi brukte dermed ytterligere to ROS-hemmere, Trolox og deferoxamine (DFO), for å undersøke deres effekt på cytotoksisitet.Tilsetningen av Trolox og DFO hemmet WGP-trent CD11b pluss cellemediert cytotoksisitet (fig. 5g), noe som tyder påat ROS-indusert lipidperoksidase er involvert, i det minste delvis, i denne ROS-medierte cytotoksisiteten.

Fig. 5 WGP-trente bukspyttkjertelinfiltrerende myeloidceller viser forbedret fagocytose og ROS-mediert cytotoksisitet. Anrikningsplott (GSEA) og varmekart av gener relatert til positiv regulering av fagocytose i CD11b pluss-celler fra 7-dag WGP-trent sammenlignet med PBS-mus. b Prosentandelen av CD45 pluss bukspyttkjertelceller som fagocyterte en pHrodo Green Staph Aureus-partikkel i PBS (n=10) og 7-day WGP (n=9) mus sammen med MFI av pHrodo Grønn Staph Aureus-partikkel. Hver prikk representerer data fra én mus. *p {{10}}.043, ****p < 0,0001. c Prosentandelen av CD11b pluss myeloide bukspyttkjertelceller som fagocyterte en pHrodo Green Staph Aureus-partikkel i PBS (n=13) og 7-day WGP (n=13) mus. Celler ble først lukket på CD45 pluss-populasjonen. MFI for pHrodo Green Staph Aureus-partikkelen er vist. **p=0.0021, ***p=0.0002. d Prosentandelen av CD11b pluss myeloide pankreasceller som fagocyterte KPCGFP pluss tumorceller i PBS (n=5) og 7-day WGP (n=5) mus. *p=0.0103. Celler ble først lukket på CD45 pluss-populasjonen. Den oppsummerte MFI-en til GFP pluss-signalet vises også. *p=0.0379. e Enrichment plots (GSEA) og varmekart av gener relatert til biosynteseprosessene for reaktive oksygenarter og den positive reguleringen av metabolske prosesser for reaktive oksygenarter i CD11b pluss-celler fra 7-dag WGP-trent sammenlignet med PBS-mus. f Oppsummerte resultater fra en cytotoksisitetsanalyse hvor CD11b pluss celler fra PBS og 7-dag WGP-trente mus ble sortert og inkubert i et forhold på 1:20 KPCLuc pluss: CD11b pluss celler i 24 timer. NAC ble brukt til å blokkere ROS-ekspresjon og tumorcytotoksisiteten ble vurdert ved luminescens (PBS n=3, WGP n=4). g Oppsummerte data fra cytotoksisitetsanalyser der CD11b pluss-celler fra 7-dagers WGP-trente mus ble sortert og inkubert i et forhold på 1:20 KPCLuc pluss: CD11b pluss-celler i 24 timer. Trolox eller DFO eller respektive bærerkontroller ble tilsatt og tumorcytotoksisitet ble bestemt ved å måle luminescens (n ​​= 3). *p=0.0255, **p=0.0019. En uparret, tosidet elevs t-test ble brukt i b–d, og g og en enveis ANOVA med flere sammenligninger ble brukt for f. Data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. ns ikke signifikant. I b–g representerer hver prøve et biologisk uavhengig dyr oppnådd over et enkelt uavhengig eksperiment som ble gjentatt minst to ganger for verifisering av resultatene.

Til syvende og sist identifiserer disse dataene at bukspyttkjertelsvulstceller er i stand til å reaktivere WGP-trente infiltrerende myeloidceller i bukspyttkjertelen og at disse cellene viser forbedret fagocytose og ROS-mediert cytotoksisitet.

WGP-indusert trent immunitet reduserer tumorvekst og forlenger overlevelse i ortotopiske modeller av kreft i bukspyttkjertelen.

Vi undersøkte deretter om -glukanmediert trente medfødte immunresponser i bukspyttkjertelen ville resultere i etableringen av et antitumor-mikromiljø som kan være tilstrekkelig til å overvinne den karakteristisk immunsuppressive TME av PDAC. Følgelig ble mus gitt 1 dose av enten PBS eller WGP på dag -7, og på dag 0 ble 1 × 105 KPC eller KPCLuc pluss-celler ortotopisk implantert i halen av bukspyttkjertelen (fig. 6a). På dag 21 ble mus avlivet og tumorvekten ble målt (fig. 6b). Ved injeksjon av KPCLuc pluss-celler ble mus injisert med luciferasesubstrat, og svulster ble avbildet (fig. 6c).

Begge studiene viste en bemerkelsesverdig reduksjon i tumorbelastningen som følge av WGP-behandling, og overlevelsen ble også signifikant forlenget hos mus trent med WGP (fig. 6d). Immunfenotyping av svulstene viste en vedvarende økning i CD45 pluss immunceller, CD11b pluss myeloidceller og F4/80 pluss makrofager i WGP-trente omgivelser (fig. 6e). CD11b pluss myeloidceller (fig. 6f) og CD11b pluss F4/80 pluss makrofager (fig. 6g) i svulsten viste også en signifikant økning i TNF-produksjon på grunn av WGP. Både et økt antall CD11b pluss myeloidceller (fig. 6h, venstre) og en økning i prosentandelen av CD11b pluss-celler som produserer TNF- (fig. 6h, høyre) korrelerte signifikant med redusert tumorbyrde. Verken CD4 pluss eller CD8 pluss T-celler viste økt IFN-, noe som ytterligere støtter at reduksjonen i tumorbyrden ble drevet av de WGP-trente myeloide cellene (fig. 6i). Lignende antitumoreffekter ble også observert hos mus ortotopisk implantert med Pan02-svulster (Supplerende Fig. 6a).

For ytterligere å bekrefte at medfødte immunceller er ansvarlige for de observerte antitumorimmunresponsene, ble ortotopiske KPC-svulster implantert i NSG-mus. I likhet med WT-mus, viste NSG-mus også en signifikant reduksjon i tumorstørrelse på grunn av WGP-trening, noe som bekrefter at antitumoreffektene til WGP ble drevet av medfødte immunceller og fungerte uavhengig av adaptive responser (tilleggsfig. 6b). Kalafati et al. hadde vist at medfødt immuntrening av granulopoiesis fremmer antitumorimmunitet21.

Selv om vi ikke hadde sett et viktig bidrag fra granulocytter til vår fenotype av trent immunitet, undersøkte vi om granulocytter er involvert i WGP-avhengig reduksjon i bukspyttkjertelsvulster ved å tappe nøytrofiler og observere tumorvekst i PBS og WGP-behandlede mus. Uttømmingseffektiviteten til nøytrofiler i bukspyttkjertelen (Supplerende Fig. 6c) sammen med bukspyttkjertelsvulstbelastningen ble vurdert (Supplerende Fig. 6d). Resultatene våre viste en signifikant reduksjon i tumorstørrelse i WGP-gruppen i fravær av nøytrofiler.

Fig. 6 Induksjon av trent immunitet i bukspyttkjertelen har antitumoreffekter. et eksperimentelt skjema. b C57BL/6 mus mottok en enkelt IP-injeksjon av WGP eller PBS og 7 dagers mus ble implantert ortotopisk med KPC pankreaskreftceller. Representative bilder av svulster og kvantitativ analyse av svulstvekt er vist. Tumorvekt ble målt på dag 21 (PBS n=10, WGP n=12). ***p=0.0004. c C57BL/6-mus (n=4) fikk en enkelt ip-injeksjon av WGP eller PBS og ble 7 dager senere implantert ortotopisk med KPC pluss Luc pankreaskreftceller. På dag 21 post-tumor implantasjon, ble mus gitt IP luciferin bioluminescerende substrat og ble plassert i en foton imager for å måle tumorstørrelse in vivo. *p=0.0403. d Overlevelse av mus i det eksperimentelle skjemaet vist i a, ved bruk av KPC-celler (n=5). **p=0.0018. e Fenotyping av svulstene som viser prosenten av levedyktige celler som er CD45 pluss , prosentandelen av CD45 pluss-populasjonen som er CD11b pluss , og prosenten av CD11b pluss-celler som er F4/80 pluss (PBS n=10, WGP n=9). *p=0.0165 (CD45), ***p=0.0001 (CD11b), **p=0.0034 (F4/80). f TNF-produksjon i CD11b pluss-celler fra PBS og 7-dagers WGP-trent som ble restimulert med LPS. Prosent av TNF pluss-celler og MFI for TNF vises (PBS n=10, WGP n=9). **p=0.007, ***p=0.0002. g Oppsummerte data for TNF-produksjon i CD11b pluss F4/80 pluss celler fra PBS og 7-dag WGP-trent som ble restimulert med LPS. Prosent av TNF pluss-celler og MFI for TNF vises (PBS n=10, WGP n=9). *p=0.0155, ***p=0.0001. h Tumorvekt var korrelert med prosentandelen av CD45 pluss immunceller som var CD11b pluss (venstre) og prosentandelen av CD45 pluss CD11b pluss TNF pluss celler (høyre). (PBS n=10, WGP n=9). i Oppsummerte data for prosentandelen av CD4 pluss og CD8 pluss T-celler som uttrykker IFN (PBS n=10, WGP n=9) Data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. Pearson-korrelasjonskoeffisienter ble brukt for å måle styrken til de lineære assosiasjonene og uparede, to-halede student-t-tester ble brukt ellers. ns ikke signifikant. Hver prøve representerer et biologisk uavhengig dyr oppnådd over et enkelt uavhengig eksperiment som ble gjentatt minst to ganger for verifisering av resultatene.

Trente CCR2 pluss myeloidceller er primære effektorceller i antitumormekanismen.

Gitt den fullstendige inhiberingen av medfødt immuncelletrafikk inn i bukspyttkjertelen og trening av myeloidceller i bukspyttkjertelen etter WGP-behandling i CCR2−/− mus, begrunnet vi at CCR2−/− mus heller ikke ville vise de fordelaktige antitumor immuneffektene av WGP trening. . I tråd med denne hypotesen viste ikke CCR2−/− mus som mottok WGP en redusert tumorbelastning (fig. 7a) sammenlignet med WT-mus.

Dette demonstrerte at CCR2 er nødvendig for den WGP-drevne tilstrømningen av trente medfødte immunceller inn i bukspyttkjertelen, og at disse er konsekvensene for antitumoreffektene. Selv om CCL2-CCR2-signalering var blitt identifisert for å være kritisk i rekrutteringen av trente monocytt-avledede makrofager til bukspyttkjertelen, ønsket vi også å vite om tilstedeværelsen av trente HSC-er i benmargen og generering av sentralt trent immunitet alene var tilstrekkelig til å bremse veksten av ortotopiske svulster i bukspyttkjertelen.

For ytterligere å bekrefte den direkte antitumorfunksjonaliteten til de infiltrerende CCR2 pluss myeloidcellene, ble CCR2 pluss og CCR2- myeloidpopulasjonene fra WGP-trente mus sortert, blandet med KPC tumorceller og implantert ortotopisk i mus. Tumorer blandet med CCR2 pluss-celler var mindre enn de som ble blandet med CCR2−celler, noe som ytterligere støtter at de trente CCR2 pluss myeloidcellene selv er en primær effektorcelle i antitumormekanismen (fig. 7b). CyTOF-analyse av disse svulstene viste at CCR2 pluss blandede svulster hadde signifikant færre CD11b pluss myeloidceller og signifikant økte CD8 pluss T-celler tilstede i svulsten (fig. 7c, d). Forholdet mellom CD8 pluss T-celler: CD11b pluss myeloide celler ble også signifikant økt i CCR2 pluss tilsetningstilstanden (fig. 7e).

Fig. 7 Antitumoreffektormekanismene til WGP-behandling og klinisk relevante modeller. a WT og CCR2−/− mus ble behandlet med PBS eller WGP og 7 dager senere ble implantert med ortotopiske KPC pankreas tumorceller. Tumorvekt på dag 21 er rapportert. (WT PBS n=5, WT WGP n=6, CCR2 PBS n=6, CCR2−/− WGP n=6). **p=0.0027 (WT PBS vs WT WGP), *p=0.0118 (WT WGP vs CCR2−/− PBS), **p=0.0034 (WT WGP vs CCR2−/− WGP). b Sorterte CCR2 pluss og CCR2− pankreas CD11b pluss celler fra WGP-trente mus ble blandet med KPC celler og implantert ortotopisk. Tumorstørrelsen ble evaluert 21 dager senere (CCR2 pluss n=5, CCR2− n=5). *p=0.0247. c t-SNE-plott generert ved CyTOF-analyse av tilsetningssvulstene fra b. Klynger som viser signifikante forskjeller mellom grupper er indikert med sirklene. Totale data (til venstre) og representative t-SNE-plott for hver gruppe vises. d Oppsummert prosentandel av CD8 pluss og CD11b pluss celler i blandede svulster (PBS n=4, WGP n=3). *p=0.01, **p=0.007. e Forholdet mellom CD8 pluss:CD11b pluss-celler i blandede svulster (PBS n=4, WGP n=3). *p=0.0474. f Uttrykk av PD-L1 på KPC-svulstceller, CD11b pluss og F4/80 pluss-celler i en KPC-svulst 21 dager etter implantasjon (KPC n=5, CD11b pluss n=6, F4/80 pluss n=6). g Eksperimentelt skjema for WGP og anti-PD-L1 terapi. Mus (n=5) ble behandlet med PBS eller WGP og 7 dager senere ble implantert med ortotopiske KPC-bukspyttkjertelsvulster. På dag 3, 7 og 11 etter implantasjon ble mus gitt anti-PD-L1 mAb eller anti-rotte IgG2b mAb isotypekontroll. Overlevelsen ble overvåket. **p=0.0018 (WGP vs PBS eller PD-L1), **p=0.0021 (WGP vs WGP pluss PD-L1). h Eksperimentelt skjema for WGP brukt i terapeutiske omgivelser. Mus ble implantert med ortotopiske KPC-bukspyttkjertelsvulster og ble gitt WGP når mus hadde kommet seg etter operasjonen på dag 4, og 1 uke senere på dag 11. *p=0.0163. Data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. En enveis ANOVA med flere sammenligninger ble brukt for a og en uparet, to-halet elevs t-test ble brukt for b, d og e. Log-rank test ble brukt for g og h. ns ikke signifikant. Hver prøve representerer et biologisk uavhengig dyr oppnådd over et enkelt uavhengig eksperiment som ble gjentatt minst to ganger for verifisering av resultatene.

WGP synergiserer med anti-PD-L1 mAb-terapi for å forlenge overlevelsen i modeller av PDAC.

Selv om det ble vist en betydelig reduksjon i tumorbyrden på grunn av WGP-trening, er det slik at alle mus utviklet dødelige svulster. Våre studier identifiserte at WGP-behandling drastisk påvirket fenotypen til myeloidpopulasjonene i bukspyttkjertelen.

Selv om vi hadde identifisert at den primære effektorcellen som er ansvarlig for antitumoreffektene av WGP er CCR2 pluss infiltrerende monocytter/makrofager, mente vi at disse immunforandringene også kan påvirke den totale TME på en måte som kan gjøre adaptive immunceller mer responsive overfor sjekkpunktblokkadeterapi. Spesielt fordi vi hadde observert en økning i andelen CD8 pluss T-celler tilstede i CCR2 pluss blandede svulster (fig. 7c) og også hadde observert signifikant PD-L1-ekspresjon på myeloide celler tilstede i KPC-svulster (fig. 7f), vi antok at WGP-behandling kan potensere effekten av anti-PD-L1 mAb-terapi.

For å vurdere om anti-PD-L1 mAb-terapi synergerer med WGP-indusert trent immunitet i bukspyttkjertelen, ble PBS eller WGP-behandlede mus som ble implantert med ortotopiske KCP-svulster gitt enten anti-PD-L1 mAb eller rotte IgG2b isotype kontroll mAb. Som det er vist i flere kliniske studier, mislyktes antiPD-L1-terapi alene i å forlenge overlevelsen selv utover den for IgG2b-isotypekontroll mAb-behandlede mus (fig. 7g). WGP-trente mus overlevde betydelig lenger enn IgG2b-isotype og anti-PD-L1-behandlede mus. Imidlertid forlenget en kombinasjon av WGP og anti-PD-L1 sammen overlevelsen mest effektivt. Dette viser at det er en klinisk fordel ved å kombinere WGP med antiPD-L1 immunsjekkpunktblokkadeterapi.

Så langt har bruken av WGP blitt beskrevet i en setting der WGP administreres før tumorceller implanteres. Tatt i betraktning reduksjonen i tumorstørrelsen til denne modellen, testet vi også en mer klinisk relevant modell der mus ble implantert med ortotopiske KPC-svulster og WGP ble brukt til å stimulere trent immunitet deretter Fig. 7h). I terapeutiske omgivelser ble den WGP-drevne tilstrømningen av trente myeloidceller til bukspyttkjertelen også vist å forlenge overlevelsen. Sammen antyder disse dataene at initiering av trent immunitet i bukspyttkjertelen ved bruk av WGP har relevante kliniske anvendelser for behandling av kreft i bukspyttkjertelen som krever ytterligere translasjonsforskning og undersøkelser.

For more information:1950477648nn@gmail.com