Forholdet mellom cyklo-oksygenase (COX-2) og hypoksi-indusert sykdom

for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com

Intracellulært prostaglandin E2 bidrar til hypoksi-indusert proksimal tubulær celledød

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proksimale tubulære celler (PTC) er spesielt sårbare for hypoksi-indusert apoptose, en relevant faktor fornyresykdom. Vi antok her at PTC-død under hypoksi er mediert av syklooksygenase (COX-2)-avhengig produksjon av prostaglandin E,(PGE,), som ble bekreftet i humane proksimale tubulære HK-2celler på grunn av hypoksi (1 prosent O,)-indusert apoptose (i) ble forhindret av en COX-2(syklo-oksygenase) inhibitor og av antagonister av prostaglandin (EP)reseptorer og (ii) var assosiert med en økning i intracellulær PGE,(iPGE,)på grunn av hypoksi-induserbar faktor-1 -avhengig transkripsjonell oppregulering av COX{{3 }}(cyclo-oksygenase). Apoptose ble også forhindret av hemmere av prostaglandinopptakstransportøren PGT, som indikerte at iPGE, bidrar til hypoksi-indusert apoptose (tvert imot, hypoksi/reoksygenering-indusert PTC-død var utelukkende på grunn av ekstracellulær PGE). Dermed er iPGE en ny aktør i patogenesen av hypoksi-indusert tubulær skade, og PGT kan være et nytt terapeutisk mål for forebygging av hypoksi-avhengige lesjoner ved nyresykdommer.

Det er godt etablert at tubulær hypoksi er en relevant faktor for både akutt og kronisknyresykdom'2 Proksimale tubulære celler (PTC) er svært aktive når det gjelder oksygenforbruk på grunn av deres energikrevende aktiviteter for reabsorpsjon, og følgelig er de sårbare for hypoksi. Det har blitt vist at apoptose spiller en relevant rolle i dyrket PTC som er utsatt for hypoksi, men signalveiene som er ansvarlige for aktiveringen av det apoptotiske maskineriet er ikke undersøkt. Vi og andre har funnet ut at prostaglandin E, (PGE,), en viktig lipidmediator for en rekke fysiologiske og patologiske prosesser inyre, spiller en relevant rolle i signaleringen som fører til PTC-apoptose ved behandling med cisplatin7, albumin8eller leptin og gentamycin. I alle tilfellene ble økningen i PGE funnet å være avhengig av økt ekspresjon av cyclo-oxygenase-2(COX-2)(cyklo-oksygenase), et induserbart enzym som sammen med COX-1l ​​er det hastighetsbegrensende trinnet i syntesen av prostaglandiner. I mennesketnyre, basal COX-2(cyklo-oksygenase)uttrykket er mindre intenst enn det for COX-1. COX-2(cyklo-oksygenase)har blitt identifisert i podocytter og deler av løkken til Henle og renal vaskulatur under fysiologiske forhold10. I patologiske tilstander kan imidlertid COX-2-immunreaktivitet finnes i mange flere celletyper innenfornyreinkludert PTC, og bidrar muligens til nyreskade. Interessant nok øker hypoksi uttrykket av COX-2(cyklo-oksygenase)og/eller produksjon av PGE,12-i7 i mange celletyper. Faktisk har vi tidligere funnet at hypoksi forbedrer det intracellulære innholdet i PGE, så vel som dets frigjøring til det ekstracellulære mediet8. Derfor er det teoretisk mulig at PGE medierer den apoptotiske effekten av hypoksi på PTC.

De fleste studier på PGE,-avhengig apoptose har i hovedsak vært fokusert på mekanismer som involverer ekstracellulær PGE fordi det er allment akseptert at PGE, utøver sine biologiske effekter gjennom aktivering av plasmamembranomspennende G-proteinkoblede PGE-reseptorer (prostaglandinreseptorer i E-serien). EP1-4)1. Likevel, i noen modeller er intracellulær PGE,(iPGE,) relevant ved apoptotisk celledød720-22. Dette innebærer at for å indusere apoptose, må PGE nå det intracellulære mediet igjen og aktivere en undergruppe av EP-reseptorer, som er lokalisert inne i cellen (iEP-reseptorer). Fordi oppgaven med å fange PGE, hovedsakelig gjøres av prostaglandinopptakstransportøren (PGT)23-26, resulterer PGT-hemming i forebygging av iPGE-mediert apoptotisk celledød7.

Med denne bakgrunnen i betraktning, undersøkte vi i dette arbeidet om en COX-2(cyklo-oksygenase)-avhengig økning i iPGE, nivåer medierer hypoksi-indusert apoptose i PTC.

Klikk til organisk Cistanche for nyresykdom

Metoder

Reagenser.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, krystallfiolett, trypanblå oppløsninger, bromosulfoftalein (BRS), 3-(5'-hydroksymetyl2'-furyl)-1-benzylindazol (YC1), og actinomycin D ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Z-VAD-FMK og celecoxib var fra henholdsvis Calbiochem (Darmstadt, Tyskland) og Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). TriReagent ble kjøpt fra Vitro (Madrid, Spania), og PVDF-membraner og Western blotting luminol-reagens ble anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. USA). ProLong Gold antifade-reagens med 4,6-diamidino{{14 }}fenylindol (DAPI), annexin-V-FITC(fluorescein-isotiocyanat)/propidiumjodid (PI) apoptosedeteksjonssett og 2',7'-diklorfluoresceindiacetat(DCFH-DA)-probe ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), henholdsvis Molecular Probes (Oregon, USA). Antistoffer ble hentet fra følgende kilder: anti-PGE og anti-COX-2(cyklo-oksygenase)antistoffer var fra Abcam (Cambridge, UK); anti-Bax og anti-Bcl-2 var fra Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la-antistoff og -kanin-Alexa-Fluor 488 var fra henholdsvis BD Biosciences (Palo Alto, CA, USA) og Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); anti- -aktin og kanin-anti-muse-IgG-peroksidasekonjugat ble kjøpt fra Sigma (St.Louis, MO, USA).

Cellekultur og eksperimentelle forhold.

Humane proksimale rørformede HK-2-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection(ATCC) (Rockville, MD, USA). Cellene ble opprettholdt i 5 prosent CO, ved 37 grader Cin DMEM/F12 supplert med 10 prosent føtalt storfe serum(FBS), 1 prosent penicillin/streptomycin/amfotericin B og 1 prosent glutamin (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) og 1 prosent insulin-transferrin-selen (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA).I alle eksperimenter, celler ble belagt med 70-90 prosent konfluens, og når de var fullstendig festet, ble de dyrket under hypoksiske (1 prosent oksygen) eller normoksiske forhold (21 prosent oksygen).Hypoksieksperimenter ble utført i en In vivo200hypoksiarbeidsstasjon (Ruskin Technology, West Yorkshire, Storbritannia). Tilhypoksi/reoksygeneringseksperimenter ble celler utsatt forhypoksii 24 timer, og deretter ble cellene inkubert under normoksiske forhold i opptil 3 timer (reoksygeneringsperiode).

Immunfluorescensanalyse av iPGE og Western blot-analyse av COX-2(cyklo-oksygenase)og HIF-1 .

Celler for immunfluorescensanalyse og Western blot-analyse ble henholdsvis delt på glassdekkglass (4×104 celler/glassdekkglass) eller i seks-brønns plater (15×104 celler/brønn) og inkubert som beskrevet i "Resultater". Deretter ble immunfluorescens- og immunoblotting-analyse utført i hovedsak som beskrevet tidligere. Antikroppsarbeidsfortynninger var: 1/50 for PGE,,1/1000 for COX-2(cyklo-oksygenase)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 og 1/5000 for -actin. Immunfluorescensdeteksjon ble utført ved bruk av et Leica SP5 konfokalt mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland), gjennom Confocal Microscopy Service (ICTS 'NANBIOSIS'U17) til Biomedical Research Networking Center on Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN ved Universitetet i Alcal, Madrid, Spania)

Forbigående transfeksjon.

Forbigående transfeksjon med siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), pattedyrekspresjonsvektoren pcDNA3 som inneholder cDNA til villtype human 15-hydroksy-prostaglandin dehydrogenase (p15-PGDH) eller luciferase reporter plasmid konstruksjoner for human COX-2(cyklo-oksygenase)phPES2-Luc, menneskehypoksiresponselement (HRE)p9HIF1-Luc og R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) og bestemmelse av luciferaseaktivitet ble utført som beskrevet andre steder27,28.

Celletall og celle/kjernemorfologi.

Antall adherente celler ble bestemt spektrofotometrisk med en modifisert krystallfiolettfargingsmetode2. For å oppdage bevis på apoptose ble cellemorfologi observert ved bruk av fasekontrastmikroskopi. Cellekjerner ble visualisert etter DNA-farging med DAPI som tidligere beskrevet 0. Typisk apoptotisk morfologi som ble undersøkt inkluderte cellulær krymping, kjernefysisk kondensasjon og fragmentering, og dannelse av apoptotiske legemer. For kvantifisering ble seks felt undersøkt i hver eksperimentell tilstand på en blind måte for å estimere prosentandelen av kjerner med apoptose-lignende utseende.

Flowcytometri apoptoseanalyse og cellelevedyktighetsanalyse ved trypanblått fargeeksklusjonstest.

Vedheftende celler til platen ble løsnet ved trypsinisering og ble, sammen med de løsrevne cellene som tidligere var utvunnet fra kulturmediet, brukt for analysen.

Annexin-V-FITC/PI apoptosedeteksjonssett tillot flowcytometrideteksjon av apoptotiske og nekrotiske HK-2-celler, som tidligere beskrevet7. Tidlige og sene apoptotiske celler var henholdsvis positive til annexin V-farging og begge og annexin V farging. Nekrotiske celler var bare positive til PI og levende HK-2-celler viste ingen farging.

Trypanblått fargeeksklusjonstest ble brukt for å vurdere cellelevedyktighet. Levedyktige celler (hvite) og døde celler (blå) ble talt ved bruk av et lysmikroskop og et hemocytometer.

Statistisk analyse.

Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ±SEM. De ble utsatt for en enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Bonferronis test for flere sammenligninger. Signifikansnivået ble satt til P Mindre enn eller lik 0.05.

Resultater

Hypoksi induserer proksimal tubulær HK-2 celledød.

Hypoksireduserte antallet HK-2-celler, vurdert ved krystallfiolett-analyse (fig. la), og induserte også celleavrunding og løsrivelse fra platen (fig. lb, øvre panel). Som forventet,hypoksiutløste en modell for celledød med klare morfologiske karakteristikker av apoptose (se kjernefysisk farging med DAPI i Fig. lb, nedre panel, venstre) slik som cellekrymping med betydelig kjernefysisk kondensasjon, fragmentering og dannelse av apoptotisk-lignende legemer.Hypoksi-indusert apoptose ble ytterligere bekreftet av økningen av annexin V-FITC-farging, vurdert ved flowcytometri, og dens forebygging med pan-caspase-hemmer Z-VAD-FMK (fig. lc).Hypoksibestemte også en reduksjon i antall levedyktige celler, men induserte ikke statistisk signifikante endringer i antall nekrotiske celler (fig. lc, innfelt).

Figur 1. Hypoksi induserer proksimal tubulær HK-2 celledød.(a) Redusert celletall (krystallfiolett analyse). (b) Morfologiske egenskaper ved apoptose. Representative mikrofotografier med fasekontrast (øvre panel, original forstørrelse, 10×) DAPI-fargingsfotografier (nedre panel, original forstørrelse, 40×). (c) Økning i apoptose (flowcytometristudier). Annexin V pluss-celler omfatter Annexin V pluss /propidiumjodid-celler (dvs. tidlige apoptotiske celler med bevart plasmamembranintegritet) og annexin V pluss /propidiumjodid pluss-celler (dvs. sene apoptotiske celler). Innfelt: Typer av cellepopulasjoner (Annexin V-/propidiumjodid pluss-celler er nekrotiske celler og annexin V-/propidiumjodid-er levende celler). Resultatene er uttrykt i prosent i forhold til det totale antallet hendelser. Generell informasjon:(1) Celler ble inkubert i 24 timer i normoksiske (21 prosent O2) eller hypoksiske (1 prosent O,) forhold, som angitt i "Metodes?. pan-caspase-hemmer Z-VAD-FMK (25 μM) var legges til 1 time før eksponeringen påbegynneshypoksi. (2) Mikrofotografier er representative eksempler på tre uavhengige eksperimenter. Søyler og feilstreker i grafer: Hver søyle representerer gjennomsnittet±SEM for 3 forskjellige eksperimenter *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hypoksi;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hypoksipluss ZVAD.

COX-2(cyklo-oksygenase)/iPGE,/EP-reseptorvei medierer proksimal tubulær HK-2-celledød indusert av hypoksi.

For å vurdere rollen til COX-2(cyklo-oksygenase)/iPGE2/EP-reseptorvei ihypoksi-indusert HK-2 celledød, pre-inkuberte vi først celler med celecoxib, en COX-2(cyklo-oksygenase)inhibitor1; AH6809, en antagonist av EP1-, EP2- og EP3-reseptorer eller GW627368X, en antagonist av EP4-reseptor33; eller med bromocresol green eller bromosul-fophthale i begge inhibitorer av PGT435.PGT ble også slått ned gjennom transfeksjon med siRNA.

Figur 2. COX-2(cyklo-oksygenase)/iPGE,/EP-reseptorvei medierer hypoksi-indusert proksimal tubulær HK-2-celledød.(a) Forebygging av celledød ved inhibitorer av banen. Øvre panel; Søylene viser prosenten av total celledød (til venstre) eller prosentandelen av apoptotisk anneksin V pluss celler (høyre). Før du blir utsatt forhypoksi, ble cellene pre-inkubert i 1 time med 3 μM celecoxib (COX-2(cyklo-oksygenase)inhibitor); 10 μuM AH6809, （EP1-3 reseptorantagonist）, 10 μM GW627368X (EP4-reseptorantagonist); eller med 50 μM bromokresol grønn (BG) eller 25 μM bromosulfoftalein (BrS), to PGT-hemmere. Nedre panel: Venstre: Forebygging av celledød ved å slå ned PGT gjennom transfeksjon med siRNA (trypan blue dykkeeksklusjonstest). Innfelt: Effektiviteten av knockdown av PGT (Western blot-analyse) Høyre: Konsentrasjonsavhengighet av den forebyggende effekten av bromokresolgrønn (BG). (b)Forebygging av celledød ved transfeksjon med en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder prostaglandin-inaktiverende enzym 15-hydroksy-prostaglandin dehydrogenase(15-PGDH) cDNA(trypanblått fargeeksklusjonstest). Innsetting: Ekspresjon av {{ 11}}PGDH (Western blot-analyse) i transfekterte celler. (c)Hypoksiinduserer en PGT-sensitiv økning i iPGE, Venstre: PGE, avhengig immunfluorescens alene eller slått sammen med kjernefysisk farging med DAPI vises (original forstørrelse, 40×) Høyre: Kvantitativ tilnærming til bildene presentert i venstre panel ved bruk av Image J-programvare. (d) Hemmer av EGFR-aktivering AG1478 forhindrer ikke HK-2 celledød EGFR. Celler ble pre-inkubert i 1 time med l μM AG1478 før de ble utsatt forhypoksi. （e） PGT-hemmer BG modifiserer ikke uttrykket av Bax og Bcl-2 i HK-2-celler underhypoksi(Western blot-analyse). (f) Forebygging avhypoksi/reoksygeneringsindusert celledød av inhibitorer av banen (trypanblått fargeeksklusjonstest). Celler ble pre-inkubert med inhibitorer av banen og utsatt forhypoksisom i (a). Deretter ble cellene utsatt for normoksi i 3 timer. Generell informasjon:(1) Celler ble inkubert i 24 timer i normoksiske (21 prosent O,) eller hypoksiske (1 prosent O,) forhold, som angitt i "Metodes". (2) Mikrofotografier er representative eksempler på tre uavhengige eksperimenter. (3) Løsemidler av inhibitorene (luL/ml medium) endret ikke effekten avhypoksipå celledød (resultatene vises ikke). (4) Western blot-analyse: Lik protein ble bekreftet ved å sondere med et anti- -aktin eller et anti-GAPDH-antistoff. (5)Søyler og feilstaver i grafer: Hver søyle representerer gjennomsnittet±SEM for 3 forskjellige eksperimenter.*P<0.01><0.01>hypoksiellerhypoksi/reoksygenering.

Som vist i fig. 2a,hypoksi-indusert proksimal tubulær celledød ble forhindret i alle tilfeller. Hemming av apoptose av celecoxib indikerte at COX-2(cyklo-oksygenase)spiller en relevant rolle ihypoksi-indusert apoptotisk celledød (fig. 2a, øvre panel, høyre). Mer spesifikt viser det faktum at apoptose ble forhindret av antagonisme av EP-reseptorer at apoptose medieres av COX-2(cyklo-oksygenase)-avhengig produksjon av PGE. På den annen side er det mest sannsynlig at iPGE, bidrar tilhypoksi-indusert HK-2 celledød fordi den ble forhindret av;(i) hemming av PGT(fig.2a) eller(i) overekspresjon av 15-PGDH(fig. 2b), som inaktiverer iPGE2 gjennom sin oksidasjon25 (bemerk at transfeksjonsprosedyren i seg selv økte følsomheten til HK-2-celler forhypoksi: celledød var 45-55 prosent for transfeksjon under kontrollforhold sammenlignet med 15-20 prosent i ikke-transfekterte celler). Ytterligere støtte til bidraget til iPGE, tilhypoksi-indusert HK-2 celledød, er våre tidligere funn somhypoksibestemmer en økning i celleinnholdet til iPGE,1 og at denne økningen ble forhindret av PGT-hemmere (fig. 2c).

MAPK-signalveier kan indusere apoptose, fordi iEP-reseptorer transaktiverer epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR)36, noe som fører til aktivering av MAP-kinaser ERK1/2 og p38 i HK-2-celler0, spurte vi om pre -inkubasjon av HK-2-celler med inhibitoren av EGFR-aktivering AG1478 forhindrethypoksi- indusert celledød. Vi fant negative resultater (fig.2d) og derfor er det usannsynlig at transaktivering av EGFR medierer HK-2 celledød underhypoksi.

I flere eksperimentelle modeller, reduksjonen av mitokondrie-avledet ATP underhypoksiforårsaker en økning i det pro-apoptotiske proteinet Bax til anti-apoptotisk protein Bcl-2 ekspresjonsforhold, noe som fører til cytokrom C-frigjøring i cytosolen, aktivering av caspase 9, og påfølgende spaltning og aktivering av nedstrøms effektor caspases37,38. Imidlertid pre-inkubasjon med PGT-hemmer BG i HK-2 celler underhypoksiresulterte ikke i endringer forenlig med et anti-apoptotisk skift i balansen mellom ekspresjonen av Bc-2 og Bax(fig.2e), som ikke støtter en rolle for disse proteinene i HK-2-cellen død underhypoksi.

Etter hypoksisk eksponering kan episoder med reoksygenering (iskemi/reperfusjonsskade) indusere ytterligere celleskade. "Paradokset" med reoksygeneringsskade kan forstås ved å ta i betraktning at celler gjennomgår spesifikke endringer i enzymaktiviteter, mitokondriefunksjon, cytoskjelettstruktur, membrantransport og antioksidantforsvar som respons påhypoksi, som deretter kollektivt disponerer for reoksygeneringsskade39. Reoksygenerering bidrar til akutt nyreskade under iskemisk slag, nyretransplantasjon, sirkulasjonssvikt eller nyre- og kardiovaskulær kirurgi. I denne sammenhengen er den potensielle terapeutiske verdien av hemming avhypoksi/reoksygeneringsindusert proksimal tubulær celledød gjennom intervensjon i COX-2(cyklo-oksygenase)/iPGE,/iEP-reseptorveien er tydelig. Derfor spurte vi om iPGE spesifikt formidlerhypoksi-indusert celledød eller også mediererhypoksi/reoksygeneringsindusert celledød (en in vitro-modell som etterligner in vivo nyreiskemi/reperfusjonsskade). Som vist i Fig.2f ble celledød (som vurdert ved trypanblått dykkeekskluderingstest) forhindret av COX-2(cyklo-oksygenase)hemmer celecoxib samt av EP-reseptorantagonister AH6809 eller GW627368X. Samme som for Fig.2a, disse resultatene tyder på at COX-2 spiller en relevant rolle ihypoksi/reoksygeneringsindusert celledød og mer spesifikt at celledød medieres av COX-2(cyklo-oksygenase)-avhengig produksjon av PGE, siden den ble forhindret av antagonisme av EP-reseptorer. Men fordi celledød ikke ble forhindret av PGT-hemmere bromokresolgrønn eller bromosulfoftalein (fig.2f og tilleggsfigur 2d), er det mer sannsynlig athypoksi/reoksygeneringsindusert HK-2-celledød medieres utelukkende av ekstracellulær PGE.

HIF-1 -avhengig transkripsjonsregulering av COX-2(cyklo-oksygenase)genuttrykk bidrar til enhypoksi-indusert økning i iPGE, i proksimale tubulære HK-2-celler. PGE, biosyntese involverer frigjøring fra membranglyserofosfolipider av arakidonsyre ved fosfolipase A, etterfulgt av omdannelse av COX-isoenzymer av arakidonsyre til prostaglandin H, og til slutt, ved isomerisering av prosta kjertel i H, til PGE, av syntastaglandin E slik som mikrosomal PGE-syntase-1 (mPGES-1)19. Det har vi funnethypoksi-indusert apoptose i HK-2-celler er mest sannsynlig mediert av en COX-2(cyklo-oksygenase)-avhengig økning i produksjonen av PGE,(fig.2). Gitt at COX-2(cyklo-oksygenase)er et enzym hvis uttrykk kan induseres avhypoksi, vi antok at enhypoksi-indusert økning i PGE, produksjon i HK-2-celler kan være konsekvensen av en økning i ekspresjonen av COX-2(cyklo-oksygenase). For å bekrefte hypotesen vår studerte vi (i) effekten avhypoksipå uttrykket av COX-2(cyklo-oksygenase)protein og mRNA og (ii) effekten av COX-2(cyklo-oksygenase)hemmer celecoxib påhypoksi-indusert økning i iPGE, Resultatene våre indikerte dethypoksibestemt på en forbigående måte transkripsjonell oppregulering av COX-2(cyklo-oksygenase)uttrykk(fig. 3a,b)og at COX-2(cyklo-oksygenase)inhibering sløvet økningen i iPGE, i HK-2-celler underhypoksi(Fig. 3c). Interessant nok,hypoksibestemte også forbigående oppregulering av mPGES-1-proteinekspresjon (fig, 3a, innfelt), men påvirket ikke mPGES-1 mRNA-ekspresjon (fig, 3b. innfelt). Disse resultatene indikerte at økt ekspresjon av COX-2(cyklo-oksygenase)og mPGES-1 er ansvarlig forhypoksi-indusert økning i iPGE.

Figur 3. HIF-la-avhengig transkripsjonsregulering av COX-2(cyklo-oksygenase)genuttrykk bidrar til hypoksi-indusert økning i iPGE, i proksimale tubulære HK-2-celler.(a)Uttrykket av COX-2(cyklo-oksygenase)protein økes forbigående medhypoksi(Western blot-analyse). Innsatt: Expression mPGES-1-protein er også forbigående oppregulert avhypoksi. (b)Uttrykk COX-2(cyklo-oksygenase)mRNA økes forbigående medhypoksi. Innsatt: Uttrykk av mPGES-1 mRNA er upåvirket avhypoksi. (c) Forebygging av celecoxib, en COX-2(cyklo-oksygenase)hemmer, av økningen i iPGE, indusert avhypoksi. Celler ble preinkubert i 1 time med 3 μM celecoxib. Venstre∶PGE, avhengig immunfluorescens alene eller slått sammen med kjernefysisk farging med DAPI vises (opprinnelig forstørrelse, 40×). Høyre: Kvantitativ tilnærming til bildene presentert i venstre panel ved hjelp av programvaren Image J. (d) Bidrag av transkripsjonsmekanismer. Til venstre: Transkripsjonshemmer actinomycin D(Act. D) forhindrer enhypoksi-indusert økning i COX-2(cyklo-oksygenase)proteinekspresjon (Western blot-analyse). Celler ble forbehandlet i lh med 1 ug/ml Act. D før du blir utsatt forhypoksii 3 timer. Høyre: Økning i aktiviteten til en COX-2(cyklo-oksygenase)reporterkonstruksjon. (e) Hemmer av HIF-la YC-1 forhindrerhypoksi-indusert transkripsjonell COX-2(cyklo-oksygenase)oppregulering. Celler ble preinkubert i 1 time med 0.5 uM YC-1. Til venstre: Forebygging av COX-2(cyklo-oksygenase)oppregulering. Celler ble utsatt forhypoksii 8 timer. Senter: Forebygging av økningen i aktiviteten til en COX-2(cyklo-oksygenase)reporterkonstruksjon. Høyre: Hemming av aktiviteten til en HRE-drevet reporterkonstruksjon. Celler ble utsatt forhypoksii 8 timer.(f) øker HIF-la-hemmer YC-1 apoptotisk celledød (flowcytometristudier). Før du blir utsatt forhypoksi, ble cellene pre-inkubert i 1 time med 0.5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 hemmerhypoksi-indusert økning i HIF-1et uttrykk (Western blot-analyse). Generell informasjon:(1)Cellene ble inkubert i 24 timer i normoksiske (21 prosent O,) eller hypoksiske (1 prosent O,) forhold, som angitt i "Metodes". (2) Mikrofotografier er representative eksempler på tre uavhengige eksperimenter. (3) Western blot-analyse: Lik protein ble bekreftet ved å sondere med et anti- -aktin-antistoff (4) Søyler og feilstreker i grafer: Hver søyle representerer gjennomsnittet±SEM av 3 forskjellige eksperimenter *P<0.01 vs.="" other="">

For ytterligere å undersøke bidraget fra transkripsjonsmekanismer til økningen i COX-2(cyklo-oksygenase)proteinuttrykk underhypoksi, uttrykk for COX-2(cyklo-oksygenase)ble vurdert i HK-2-celler, som ble pre-inkubert med transkripsjonshemmeren actinomycin D før de ble utsatt forhypoksii 5 timer. Som vist i fig. 3d,hypoksi-indusert økning i COX-2(cyklo-oksygenase)proteinekspresjon ble forhindret av actinomycin D. Videre,hypoksihar også bestemt en økning i aktiviteten til en COX-2(cyklo-oksygenase)promoterkonstruksjon tidligere transfektert i HK-2-celler (fig. 3d til høyre). Samlet antyder resultatene vist i fig. 3d at transkripsjonsmekanismer bidrar til enhypoksi-indusert økning i COX-2(cyklo-oksygenase)proteinuttrykk. Ikke desto mindre var det et avvik mellom tidspunktet for aktiveringen av COX-2-promoteren og tidspunktet for maksimal COX-2(cyklo-oksygenase)mRNA-uttrykk: mens den forbigående økningen i COX-2(cyklo-oksygenase)mRNA-ekspresjon var maksimal etter 2 timer (fig.3b), COX-2-promotoren ble aktivert etter 3 timer (fig.3d), noe som sannsynligvis reflekterer bidraget fra post-transkripsjonelle mekanismer til økningen i COX{{6 }}(cyklo-oksygenase)uttrykk4. Derfor spekulerer vi i at COX-2(cyklo-oksygenase)mRNA er stabilisert underhypoksi, noe som vil resultere i økte nivåer av COX-2(cyklo-oksygenase)mRNA-ekspresjon uten noe bidrag (i det øyeblikket) av økt aktivitet av COX-2(cyklo-oksygenase)promotør. Det er imidlertid også mulig at en tidsforsinkelse mellom aktivering av promoteren og akkumulering av målbart substrat også kan bidra til avviket mellom tidspunktet for aktiveringen av COX-2-promotoren og tidspunktet for maksimal COX{{1 }}(cyklo-oksygenase)mRNA uttrykk.

HIF-1 er en heterodimer transkripsjonsfaktor som består av den oksygenavhengige -underenheten og den konstitutivt uttrykte -underenheten. Underhypoksi, HIF-l akkumuleres og går inn i kjernen, hvor den genererer transkripsjonsfaktoren HIF-1 etter dimerisering med HIF-1. HIF-1 fremmer deretter uttrykket av målgenene ved å binde seg tilhypoksi-responsive elementer (HRE) tilstede i deres regulatoriske region og orkestrerer deretter cellulære adaptive responser for å bekjempehypoksi 3. Gitt athypoksikan aktivere COX-2(cyklo-oksygenase)uttrykk på en HIF-1-avhengig måte gjennom en funksjonell HRE tilstede i COX-2-promotersekvensen2, undersøkte vi rollen til HIF-l i enhypoksi-indusert økning i COX-2(cyklo-oksygenase)uttrykk. Vi så også på aktiviteten til en COX-2-promoterkonstruksjon transfektert i HK-2-celler. Som vist i fig. 3e, pre-inkubasjon med HIF-1a-hemmeren YC-1, som ble sløvethypoksi-indusert økning i HIF-la-ekspresjon og aktivitet av en HRE-reporterkonstruksjon, resulterte i forebygging av økningen i både ekspresjon av COX-2(cyklo-oksygenase)og aktiviteten til COX-2(cyklo-oksygenase)promoterkonstruksjon i HK-2 utsatt forhypoksi. Oppsummert er resultatene vist i figur 3a-e støtter oppfatningen om at HIF-1 -avhengig transkripsjonell oppregulering av COX-2(cyklo-oksygenase)er ansvarlig forhypoksi-indusert økning i iPGE2.

Selv om konsekvensene av aktiveringen av HIF-1a påhypoksi-indusert apoptose er kontroversielle (sannsynligvis fordi de kan være kontekstavhengige), analyserte vi (på en foreløpig måte) rollen til HIF-1a i vårt eksperimentelle system. Siden vi tidligere har funnet denne intervensjonen i COX-2(cyklo-oksygenase)/iPGE, EP-reseptorvei hemmer økningen i HIF-la-ekspresjon utløst avhypoksi8,56 spurte vi om hemming av HIF-la resulterer i forebygging avhypoksi-indusert HK-2 celleapoptose. Som vist i fig. 3f, økte faktisk pre-inkubasjon med YC-1, en HIF-l-hemmerhypoksi-indusert apoptose. Derfor er det lite sannsynlig at HlF-la

Diskusjon

Vevhypoksiantas å være kritisk relevant i patofysiologien av både kronisk nyresykdom og akutt nyreskade, og er PTC den mest utsatte delen av nyretubuli mothypoksi. Her undersøkte vi rollen til PGE, i skaden påført avhypoksitil human PTC og fant at økt produksjon av iPGE stammet fra HIF-la-avhengig oppregulering av COX-2(cyklo-oksygenase)genuttrykk og økt ekspresjon av mPGES-1, bidrar tilhypoksi-indusert apoptotisk celledød i HK-2-celler. Gitt at tubulær hypoksi er en relevant faktor for både akutt og kronisk nyresykdom-2, peker disse resultatene på prostaglandintransportør PGT som et nytt terapeutisk mål ved nyresykdommer.

Hypoksiøker ikke bare iPGE, men også frigjøringen til det ekstracellulære mediet8, slik at utskilt (ekstracellulært) PGE også kan spille en rolle ihypoksi-indusert apoptose (for eksempel utløser apoptotiske kaskader gjennom kanonisk aktivering av EP-reseptorer lokalisert ved cellemembranen). To tidligere studier har vist at celledød underhypoksiskyldtes også COX-2(cyklo-oksygenase)-avhengig produksjon av PGE,1345. På den annen side, i visse celletyper (fibroblaster, mikroglia, nevroner og akutte lymfoblastiske leukemi-cellelinjer), medieres PGE.-indusert apoptose av PGE, avhengig aktivering av EP-reseptorer46-48. Det har vi funnet herhypoksi-indusert HK-2-celleapoptose ble også forhindret av antagonisme av EP-reseptorer (fig.2a, øvre panel, høyre). Men fordi EP-reseptorer klassisk har blitt beskrevet som plasmamembranreseptorer – slik at de er utilgjengelige for iPGE2-, spekulerer vi i at EP-reseptorene som medierer den apoptotiske effekten av iPGE, i hypoksiske HK-2-celler er en undergruppe lokalisert intracellulært (dvs. iEP-reseptorer).

I motsetning til rollen til iPGE2 ihypoksi-indusert apoptose i HK-2-celler, fant vi at bare ekstracellulær PGE mediererhypoksi/reoksygenering-indusert HK-2 celledød fordi den ikke ble forhindret av inhibitorer av PGT (fig. 2f). Selv om de patologiske mekanismene for cellulær skade etterhypoksi/reoksygenering ikke er fullstendig forstått, er det akseptert at celledød i stor grad skjer gjennom produksjon av overdreven reaktive oksygenarter (ROS). Dette gjelder spesielt for HK-2-celler49,50. Imidlertid, selv omhypoksikan også øke produksjonen av ROS, så vidt vi vet er det ingen bevis for at ROS spiller en relevant innhypoksi-indusert HK-2 celledød. Dette antyder at de dødelige effektene av hypoksi og hypoksi/reoksygenering i HK-2-celler medieres av forskjellige mekanismer, noe som kan forklare hvorfor BG og BS er beskyttende mothypoksimen ikke mothypoksi/reoksygenering. Følgelig kan hemming av PGT gi terapeutiske fordeler i PTC mot hypoksi-indusert celleskade, men ikke mot den skadelige effekten avhypoksi/reoksygenering.

HIF-1 -avhengig oppregulering av COX-2(cyklo-oksygenase)var en kritisk hendelse forhypoksi-indusert HK-2-celleapoptose (fig.3e). Vår observasjon om at HIF-hemmer YC-1 økte apoptotisk celledød (fig.3f) er imidlertid forvirrende, selv om tidligere rapporter allerede har vist lignende resultater1. En mulig forklaring er et hypotetisk-scenario der HIF-la ikke bare medierer den pro-apoptotiske oppreguleringen av COX-2(cyklo-oksygenase)men også oppregulering av beskyttende molekyler. HIF-1-regulerte faktisk ekspresjon av beskyttende molekyler mothypoksislik som lang ikke-kodende RNA DARS-AS1'og mikroRNA-2103 er spesifikt funnet i HK-2-celler. Men selv om disse bevisene støtter vårt hypotetiske scenario, bør spesifikke eksperimenter utføres for å bekrefte det.

Undersøkelse av nyrecellenes respons påhypoksikan forbedre vår forståelse av nyrepatologi. Vi har studert, selv om det er på en foreløpig måte, rollen til en økning i det pro-apoptotiske proteinet Bax til anti-apoptotisk protein Bcl-2 uttrykksforhold ihypoksi-indusert apoptose i HK-2-celler. Resultatene våre indikerte at inhibering av PGL ikke resulterte i endringer forenlig med et anti-apoptotisk skifte i balansen mellom ekspresjonen av Bcl-2 og Bax(fig.2e), som ikke støtter en rolle for disse proteinene i iPGE-avhengig HK-2 celledød underhypoksi. Så vidt vi vet er det bare to studier på implikasjonen av Bcl{{0}}/Bax-aksen i hypoksi-indusert apoptose i PTC, og begge involverte anoksisk" eller nesten anoksisk O, konsentrasjoner5 . Når PTC ble eksponert for 0,2 prosent O., forble Bax-ekspresjonen uendret og apoptose ble knyttet til redusert Bcl-2-ekspresjonsgrad. Imidlertid var uttrykket av Bcl-2 upåvirket av 1 prosent O, til tross for tilstedeværelse av apoptose, som er sammenfallende med våre resultater. Derfor bør andre mekanismer som ikke nødvendigvis involverer kvantitative endringer i Bcl-2- eller Bax-ekspresjon vurderes: for eksempel krever induksjon av apoptose i dyrkede gliomceller ved iPGE2 bare dens fysiske assosiasjon med Bax, som utløser translokasjonen av Bax til mitokondrier202. Derfor fortjener mekanismen som iPGE bidrar til HK-2-celleapoptose gjennom ytterligere studier.

Gruppen vår har funnet ut at en COX-2(cyklo-oksygenase)-avhengig økning i iPGE, medierer apoptotisk død i HK-2-celler eksponert for cisplatin', apoptotiske legemer7" oghypoksi(våre nåværende resultater). Fordi PGE raskt frigjøres til utsiden av cellen etter å ha blitt svnthesized2, spiller dens innovergående transport av PGl en kritisk rolle i iPGE-indusert apoptose i HK-2-celler. Derfor, når PTC-skaden er mediert av iPGE, kan behandling med hemmere av PGT være en nyttig terapeutisk tilnærming med potensielle bruksområder som forebygging av cisplatinindusert PTC-skade, hemming av forplantningen av tubulær skade gjennom apoptotiske legemer, eller begrensning av skadelig effekt avhypoksipå PTC.