RNA M6 A-leseren YTHDF2 kontrollerer NK-celle antitumor og antiviral immunitet del 2

YTHDF2 er nødvendig for den antivirale funksjonen til NK-celler

For å bestemme om Ythdf2-mangel påvirker antiviralaktiviteten til NK-celler, injiserte vi 2,5 × 104 PFU av MCMV i Ythdf2WT-mus og Ythdf2ΔNK-mus.

Resultatene viste at Ythdf2ΔNK-mus var mer mottakelige for MCMV-infeksjon, som vist ved betydelig vekttap og økte virale titere i blod, milt og lever sammenlignet med Ythdf2WT-mus (fig. 3, A og B; og fig. S2, A og B) .

Vi observerte også en signifikant reduksjon i prosent og absolutt antall totale NK-celler i milten og blodet til Ythdf2ΔNK-mus sammenlignet med de i Ythdf2WT-mus etter infeksjon (fig. 3, C og D; og fig. S2, C og D). Ytterligere analyse viste at NK-celler fra Ythdf2ΔNK-mus hadde betydelig lavere ekspresjon av Ki67 enn Ythdf2WT-mus (fig. 3, E-G).

Imidlertid var NK-cellelevedyktighet lik mellom Ythdf2WT-mus og Ythdf2ΔNK-mus, som vist ved annexin V-farging (fig. S2 E). Disse dataene indikerer at mangelen på YTHDF2 i NK-celler resulterer i en defekt i celleproliferasjon i stedet for celleoverlevelse under virusinfeksjon. NK-celler hemmer MCMV-infeksjon gjennom de aktiverende reseptoreneLy49H og Ly49D, og ​​prosessen er preget av en perforin- eller IFN-mediert antiviral respons (Arase et al., 2002; Lee et al., 2009; Loh et al., 2005; Orr et al., 2010; Sumaria et al., 2009).

Vi fant at Ythdf2ΔNK-mus hadde signifikant reduserte Ly49H+ og Ly49D+ NK-celler i milten og blodet sammenlignet med Ythdf2WT-mus etter infeksjon (fig. 3, H-J; og fig. S2, F-K).

Ytterligere analyse viste at selv om per prosent bare Ly49D+Ly49H+-celler viste en forskjell i Ythdf2ΔNK-mus sammenlignet med den for Ythdf2WT-mus, viste det absolutte celletallene til Ly49D-Ly49H+ NK-celler, Ly49D+Ly49H-Ly49D-cellene og Ly4NK-cellene, og Ly49D-cellene, milt og blod ble alle signifikant redusert i Ythdf2ΔNK-mus sammenlignet med Ythdf2WT-mus etter infeksjon (fig. S2, L-W).

Våre data tyder på at kontroll av MCMV-infeksjon av YTHDF2 ser ut til å være hovedsakelig mediert av Ly49D+Ly49H+ NK-celler. Granzyme B- og IFN-produksjonen av NK-celler i Ythdf2ΔNK-mus var sammenlignbar med Ythdf2WT-musene (fig. S2, X og Y).

Vi fant signifikant redusert perforinproduksjon hos Ythdf2ΔNK-mus sammenlignet med Ythdf2WT-mus i både milt og blod 7 dager etter infeksjon (fig. 3, K–M), noe som indikerer at YTHDF2 hovedsakelig påvirker sperforin-mediert antiviral aktivitet mot MCMV i NK-celler. antyder at YTHDF2 er kritisk for NK-celleutvidelse og effektorfunksjon under MCMV-infeksjon.

YTHDF2 kontrollerer NK-cellehomeostase og terminal modning i en stabil tilstand

Funnene ovenfor om at Ythdf2-mangel i NK-celler forsterket tumormetastaser og svekket NK-cellekapasitet til å kontrollere MCMV-infeksjon oppmuntret oss til å undersøke om YTHDF2 er nødvendig for vedlikehold av NK-celler i en stabil tilstand.

Som vist i fig. 4A var frekvensen og det absolutte antallet NK-celler signifikant redusert i perifert blod, milt, lever og lunge, men ikke i benmarg (BM) til Ythdf2ΔNK-mus sammenlignet med Ythdf2WT-mus.

Imidlertid var det ingen signifikante endringer mellom vanlige lymfoide stamceller, pre-NK celle stamceller og raffinerte NK celle stamceller (NKP) i BM (Fathman et al., 2011) mellom Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK mus (fig. S3 A), noe som indikerer at YTHDF2 påvirker kanskje ikke tidlig utvikling av NK-celler i vår modell.

For å utforske de potensielle mekanismene som er ansvarlige for reduksjonen av NK-celler i Ythdf2ΔNK-mus, undersøkte vi celleproliferasjon, levedyktighet og handelsevne til NK-celler etter Ythdf2-sletting i en jevn tilstand. Prosentandelen av prolifererende NK-celler var sammenlignbar mellom Ythdf2WT- og Ythdf2ΔNK-mus, som vist ved Ki67-farging (fig. S3 B).

Levedyktigheten til NK-celler var også ekvivalent mellom Ythdf2WT- og Ythdf2ΔNK-mus, som vist ved annexin V-farging (fig. S3 C). For å sjekke om YTHDF2 påvirker utgang av NK-celler fra BM til periferien, ble Ythdf2WT- og Ythdf2ΔNK-mus injisert iv med et antiCD45-antistoff for å markere immunceller og ofret etter 2 minutter, og BM-cellene deres ble analysert.

Dette tillot oss å kvantifisere antallet NK-celler i de sinusformede kontra parenkymale områdene av BM, en indikator på NK-cellehandel fra BM til perifert blod under en steady state (Leong et al., 2015). Resultatene viste en signifikant reduksjon i frekvensen av CD45+ NK-celler i Ythdf2ΔNK-mus sammenlignet med Ythdf2WT-mus i sinusoidene (fig. 4 B), noe som indikerer at Ythdf2-mangel svekker utgangen av NK-celler fra BM til sirkulasjonssystemet in vivo .

Immunceller gjennomgår homeostatisk proliferasjon under lymfopeni indusert av visse virusinfeksjoner eller forårsaket av kjemoterapi (Sun et al., 2011). Selv om vi fant ut at YTHDF2 er unødvendig for NK-celleproliferasjon ved en steadystate, observerte vi en signifikant reduksjon i celleproliferasjon under MCMV-infeksjon (fig. 3, EG). Vi undersøkte derfor rollen til YTHDF2 i å regulere NK-celle homeostatisk proliferasjon i en lymfopenisk setting in vivo.

Vi overførte et like stort antall milt-NK-celler fra CD45.2 Ythdf2ΔNK-mus eller CD45.1 medfødte mus intolymfocytt-mangelfulle Rag2-/-Il2rg-/- mus. Resultatene viste at en større andel av NK-celler ble avledet fra CD45.1WT-kontrollmus enn fra CD45.2 Ythdf2ΔNK-mus på dag 3 etter celleoverføring (fig. S3 D).

Ytterligere analyse viste at reduksjonen av NK-celler fra Ythdf2ΔNK-mus skyldtes svekket celleproliferasjon (Fig. S3 E), men ikke celleapoptose (Fig. S3 F), noe som tyder på at YTHDF2 driver NK-celle homeostatisk proliferasjon in vivo under lymfopene forhold.

Ytterligere differensiering av murine NK-celler kan klassifiseres i umodne (CD11b−CD27+), middels modne (CD11b+CD27+), og terminalmodne (CD11b+CD27−) stadier basert på CD11b- og CD27-nivåer ( Chiossone et al., 2009; Geiger og Sun, 2016).

Vi fant at Ythdf2-uttrykk økte med modning og at CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− viste henholdsvis laveste, mellomliggende og høyeste uttrykksnivåer av Ythdf2 (fig. S3 G), som indikerer at YTHDF2 kan være involvert i NK-cellemodning. Vi undersøkte derfor rollen til YTHDF2 i NK-cellemodning definert av celleoverflatemarkørene CD11b og CD27.

Vi fant at tap av Ythdf2 i NK-celler resulterte i en signifikant reduksjon i frekvensen av terminale modne NK-celler og/eller en økning i umodne og middels modne NK-celler i milt, lever, lunge og blod, men ikke i BM (fig. 4 C og Fig. S3 H), som indikerer at YTHDF2 positivt regulerer terminal NK-cellemodning. I samsvar med disse dataene var nivåene av KLRG1, som er en terminal NK-cellemodningsmarkør, signifikant lavere i Ythdf2ΔNK-mus i milten, leveren og lungen, men ikke BM sammenlignet med det til Ythdf2WT-mus i de tilsvarende organene eller vevsrommene (fig. 4 D).

For å bestemme om det reduserte antallet modne NK-celler ved Ythdf2-mangel er celle iboende, skapte vi kimærer i Rag2−/−Il2rg−/− mus ved å injisere BM-celler fra CD45.1 WT og CD45.2 Ythdf2ΔNK mus, blandet i en 1:1 forhold. Som vist ved flowcytometri ved 8 uker etter transplantasjon, ble en redusert andel av terminale modne NK-celler avledet fra CD45.2 Ythdf2ΔNK BM-celler enn de fra CD45.1 WT-kontrollceller (fig. 4 E), noe som tyder på at NK-celleterminalmodning kontrollert av YTHDF2 er celle iboende.

T-boks transkripsjonsfaktorer Eomes og Tbet er kritiske for NKcellemodning (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012). Intracellulær farging avslørte en signifikant reduksjon i proteinnivåene av Eomes i NK-celler fra Ythdf2ΔNK-mus sammenlignet med Ythdf2WT-mus (fig. S3 I). I tillegg fant vi at reduksjonen av protein- og mRNA-nivåer av Eomes spesifikt skjedde i terminale modne (CD11b+CD27−) NK-celler (fig. S3, J–L).

Imidlertid, i motsetning til Eomes, var uttrykket av Tbet ekvivalent i NK-celler mellom Ythdf2ΔNK og Ythdf2WT-mus (fig. S3, I og K), noe som indikerer at YTHDF2 muligens regulerer NKcell-terminalmodning ved å målrette mot Eomes.