RNA M6 A Reader YTHDF2 kontrollerer NK-celle antitumor og antiviral immunitet del 6

Metastatisk melanommodell og MCMV-utfordring

B16F10-celler (105) ble injisert iv i mus. 14 d etter injeksjon ble musene avlivet for postmortem analyse. Metastatiske knuter i lungen ble analysert makroskopisk og talt. B16F10-cellelinjen ble levert av Hua Yu (City ofHope, Los Angeles, CA). Ythdf2ΔNK- og Ythdf2WT-mus ble infisert med en ip-injeksjon av Smith-stamme MCMV (2,5 × 104 PFU), som ble kjøpt fra American Type Culture Collection (VR-1399). Perifere blodprøver ble tatt gjennom submandibulær punktering på dag 0, 4 og 7 etter infeksjon.

Lungemetastaseknuter refererer til knuter dannet av ondartede tumorceller fra andre steder som migrerer til lungene gjennom blodet eller lymfesystemet. For mange pasienter er dette en vanlig manifestasjon av lungekreft.

Men selv om lungemetastaseknuter utgjør en trussel mot pasientens fysiske helse, er det ingen direkte sammenheng mellom den og hukommelsen. Derfor bør vi aktivt møte utfordringene med lungekreft og lungemetastaseknuter, og ikke la negative følelser og angst påvirke vår fysiske og mentale helse.

Samtidig kan vi opprettholde og forbedre hukommelsen gjennom noen positive metoder. Utfør for eksempel litt hukommelsestrening, som matematiske utregninger, lesing, hør på musikk, spille spill osv. I tillegg kan det å følge gode levevaner, som regelmessig mosjon, få nok søvn, spise sunt osv. forbedre hukommelsen vår.

Det viktigste er å beholde en positiv holdning. Uansett hvilke vanskeligheter du møter, må du tro på styrken din og fleksibiliteten til nervesystemet ditt, og gjennom positive justeringer og responser vil du til slutt overvinne vanskelighetene.

Kort sagt, selv om metastatiske knuter i lungene utgjør en trussel mot fysisk helse, er de ikke direkte relatert til hukommelsen. Vi bør møte det positivt og opprettholde og forbedre hukommelsen vår ved å justere livsstilen vår og opprettholde en god holdning. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balansen av nevrotransmittere, som å øke nivåene av acetylkolin og vekstfaktorer. Disse stoffene er svært viktige for hukommelse og læring. I tillegg kan Cistanche deserticola også forbedre blodstrømmen og fremme oksygentilførsel, noe som kan sikre at hjernen får tilstrekkelig med næringsstoffer og energi, og dermed forbedre hjernens vitalitet og utholdenhet. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balansen av nevrotransmittere, som å øke nivåene av acetylkolin og vekstfaktorer. Disse stoffene er svært viktige for hukommelse og læring. I tillegg kan Cistanche deserticola også forbedre blodstrømmen og fremme oksygentilførsel, noe som kan sikre at hjernen får tilstrekkelig med næringsstoffer og energi, og dermed forbedre hjernens vitalitet og utholdenhet.

Klikk vet kosttilskudd for å øke hukommelsen

For å måle viral belastning i perifert blod, milt og lever, ble DNA isolert ved hjelp av et QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit for qPCR-analyse. Følgende primere ble brukt: MCMV-IE1,59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (fremover) og MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (revers).

In vivo musebehandling med IL-15

For in vivo musebehandling med IL-15 ble Ythdf2ΔNK og Ythdf2WTmus injisert med 2 µg ip rekombinant human IL-15 (kat.nr. 745101; National Cancer Institute) i 5 dager. De behandlede og kontrollmusene ble deretter avlivet for en flowcytometrisk analyse.

Flowcytometri

Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt fra BM, blod, milt, lever og lunge fra Ythdf2ΔNK og Ythdf2WT mus som beskrevet tidligere (Wang et al., 2018b). Flowcytometrianalyse og cellesortering ble utført på henholdsvis et LSRFortessa X-20 og et FACSAriaFusion Flow Cytometer (BD Biosciences).

Data ble analysert ved hjelp av NovoExpress-programvare (Agilent Technologies).

Følgende fluorescensfargestoffmerkede antistoffer fra BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen eller Cell Signaling Technology ble brukt: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46 }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), granzyme B (QA16A02), perforin(S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), anneksin V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) og Eomes (WD1928), fosfo-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), fosfo-Akt (Ser473, #5315), fosfo-S6 ribosomalt protein ,phospho-Stat3 (Tyr705, #9145), og phospho-Stat5 (Tyr694, #9539).

For evaluering av NK-celleproliferasjon ble celler merket med 5 µM CTV (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll før de ble overført til mottakermus. Intracellulær farging av Ki67, Tbet og Eomes ble utført ved å fikse og permeabilisere med Foxp3/Transcription Factor Staining Kit (eBioscience).

For påvisning av fosforylerte proteiner ble rensede milt-NK-celler forbehandlet med rekombinant human IL-15 (50 ng/ml) i 1 time og deretter fiksert med Phosflow Fix Buffer I etterfulgt av permeabilisering med Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) og farging med antistoffer.

Adoptiv celleoverføring

For å vurdere effekten av Ythdf2-mangel på NK-cellemodning, ble en blanding av 5 × 106 BM-celler i et 1:1-forhold fra CD45.1 eller Ythdf2ΔNK CD45.2 mus overført til Rag2-/-Il2rg-/-mus. Rekonstituering av mottakere ble vurdert ved flowcytometri8 uker etter transplantasjon.

For lymfopeni-induserte homeostatiske proliferasjonseksperimenter ble like antall rensede miltNK-celler fra CD45.1- eller Ythdf2ΔNK CD45.2-mus samoverført til Rag2−/−Il2rg−/−-mus etterfulgt av vurdering av de relative prosentene av overført WT og Ythdf2ΔNK-cellene i NK-pleiensΔ. av Rag2−/−Il2rg−/− mottakere ved flowcytometri på angitte tidspunkter.

For den metastatiske melanommodellen ble 106 IL-2-ekspanderte NK-celler fra Ythdf2ΔNK eller Ythdf2WTmus injisert iv i Rag2−/−Il2rg−/− mus. 1 d senere ble B16F10-celler (105) injisert iv i mus. 14 d etter injeksjon ble mus avlivet for postmortem analyse. I noen eksperimenter ble celler merket med CTV (5 µM, Invitrogen) for å spore celleproliferasjon før overføring.

In vivo trafficking-analyse

For å påvise NK-cellehandel fra BM til perifert blod ble 1 µg iv APC-merket anti-CD45-antistoff injisert i C57BL/6-mus. To minutter etter antistoffinjeksjonen ble temaene avlivet umiddelbart, og BM-cellene ble samlet for flowcytometri etter at cellene ble farget med CD3- og NK1.1-antistoffer. Parenkymale NK-celler ble identifisert ved mangel på CD45-farging, mens sinusformede NK-celler ble identifisert ved tilstedeværelse av CD45-merking. Derfor indikerer forholdet mellom NK-celler i sinusoidene (CD45+) og det i de parenkymale områdene (CD45−) NK-celletrafikken fra BM-topifert blod under en steady state.

Sanntids RT-qPCR og immunblotting

RNA ble isolert ved bruk av et RNeasy Mini Kit (QIAGEN) og deretter revers transkribert til cDNA med PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Takara Bio) i henhold til produsentens instruksjoner. mRNA-ekspresjonsnivåer ble analysert ved bruk av SYBRGreen PCR Master Mix og et QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR-system (begge fra Thermo Fisher Scientific). Primersekvenser er oppført i tabell S1.

Immunblotting ble utført i henhold til standardprosedyrer, som tidligere beskrevet (Denget al., 2015; Yu et al., 2006). Følgende antistoffer ble brukt: METTL3 (kat.nr. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (kat.nr.26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (kat.nr. 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (kat.nr. RN123PW; MBL), YTHDF3 (kat.nr.25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (kat.nr. ab195377; Abcam),FTO (kat.nr. ab124892; Abcam), MDM2 (kat.nr. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (kat.nr. PA5-29949; Invitrogen), og -actin(kat.nr. {{20 }}Ig; Proteintech).

siRNA knockdown-analyse

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90 % målt ved flowcytometri. Geneknockdown-effektivitet ble bestemt ved qPCR og immunoblotting. 3 dager etter transfeksjon ble celleapoptose og proliferasjon analysert ved flowcytometri som beskrevet ovenfor.

Luciferase reporter analyse

Ythdf2-promoterregionen fra –2,000 bp til +100 bp av TSS ble amplifisert fra murine NK-celler og klonet inn i apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) for å generere apGL{ {5}}Ythdf2-reporterplasmid. HEK293T-celler kjøpt fra ATCC ble kotransfektert med pGL4-Ythdf2-reporterplasmidene samt STAT5a- eller STAT5b-overekspresjonsplasmider eller en tom vektor, sammen med et pRL-TK Renilla-reporterplasmid (Promega) for normalisering av transfeksjonseffektivitet. Cellene ble høstet for lysis 24 timer etter transfeksjon, og luciferaseaktivitet ble kvantifisert fluorimetrisk med Dual-LuciferaseSystem (Promega). Primersekvenser for kloning av Ythdf2-promoteren og STAT5a og STAT5b overekspresjonsplasmider er oppført i tabell S1.

Chip-analyser

ChIP-analyser ble utført ved bruk av et Pierce Magnetic ChIP-sett (kat.nr. 26157; Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble en lik mengde ananti-anti-fosfo-Stat5 (Tyr694, kat. nr. 9351; Cell Signaling Technologies) eller tilsvarende kontroll normal kanin-IgG brukt separat for å utfelle de tverrbundne DNA-proteinkompleksene avledet fra 5 × 106 rensede primære NK-celler fra mus som ble forbehandlet med IL-15 (50 ng/ml) i 1 time. Etter reversering av tverrbinding ble DNA immunutfelt av det indikerte antistoffet testet med qPCR. Sekvensene til allprimere er oppført i tabell S1.

Ex vivo cytotoksisitetsanalyse

Ex vivo cytotoksisitet til NK-celler ble evaluert ved standard 51Crrelease-analyser. Muse lymfom cellelinjer RMA-S (MHC klasse Ideficient) og RMA (MHC klasse I tilstrekkelig) celler, en gave fra Andre'Veillette (McGill University, Montreal, Canada), ble brukt astarget celler. Mus ble behandlet med ip-injeksjon av polyinosin:polycytidylsyre [poly (I:C); 200 ug/mus] i 18 timer. Poly(I:C)-aktiverte NK-celler ble isolert fra milten ved å bruke EasySepMouse NK Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies). Rensede NK-celler ble dyrket sammen med målceller i et forhold på 5:1, 2,5:1 og 1,25:1 i nærvær av IL-2 (50 U/ml).

m6A-seq

Rensede milt-NK-celler ble utvidet med IL-2 (1,000 U/ml, kat.nr. Bulk Ro 23-6019; National Cancer Institute) in vitro i 7 dager. Totalt RNA ble isolert med TRIzol-reagens (Thermo FisherScientific) fra 50 millioner IL-2-ekspanderte NK-celler. Polyadenylert RNA ble ytterligere beriket fra totalt RNA ved å bruke Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen). mRNA-prøver ble fragmentert til 100-nt-lange fragmenter med RNA-fragmenteringsreagenser (Invitrogen).

Fragmentert mRNA (5 µgmRNA) ble brukt for m6A-immunutfelling ved bruk av et m6Aantistoff (202003; Synaptic) etter standardprotokollen til Magna MeRIP m6A-settet (Merck Millipore). RNA ble beriket gjennom RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) for bibliotekgenerering med et KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche). Sekvensering ble utført ved City of Hopes genomics-anlegg på en Illumina HiSeq 2500-maskin med enkeltlest 50-bp-modus. Sekvensavlesninger ble kartlagt til musegenomet ved hjelp av HISAT2 v101-programvare (Kim et al., 2015).

Kartlagte avlesninger av immunutfelling og inngangsbiblioteker ble gitt ved å bruke R-pakken exomePeak (Meng et al., 2014). m6Apeaks ble visualisert ved hjelp av Integrative Genomics Viewersoftware (http://www.igv.org). Det m6A-bindende motivet ble analysert av MEME (https://meme-suite.org) og HOMER(http://homer.ucsd.edu/homer/motif). Kalte topper ble kommentert ved skjæring med genarkitektur ved å bruke Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (fold endring)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

50 millioner IL-2-ekspanderte NK-celler ble høstet og vasket to ganger med kald PBS, og cellepelleten ble lysert med 2 vol. lyseringsbuffer (10 mM Hepes, pH 7,6, 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 mM ditiotreitol, 1:100 proteasehemmercocktail [Thermo Fisher Scientific] og 400 U/ml SUPERase-In RNase-hemmer [Thermo Fisher Scientific]).

Lysatet ble inkubert på is i 5 minutter og sentrifugert i 15 minutter for å klare lysatet. En tiendedel av cellelysat ble lagret som input. Resten av cellelysatet ble inkubert med 5 µg anti-YTHDF2 (kat.nr. RN123PW; MBL) som ble koblet med Protein A Magnetic Beads (kat. nr. 10001D; Invitrogen) ved 4 grader i 2 timer med forsiktig rotasjon. Etterpå ble kulene vasket fem ganger med 1 ml iskald vaskebuffer (50 mM HEPES, pH 7,6 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,05 % NP-40, 0,5 mM ditiotreitol og 200 U/ml RNase inhibitor).

Immunutfelte prøver ble utsatt for Proteinase K-fordøyelse i vaskebuffer supplert med 1% SDS og 2 mg/ml Proteinase K (ThermoFisher Scientific) inkubert med risting ved 1200 rpm ved 55 grader i 1 time. Totalt RNA ble ekstrahert fra både input og immunutfelt RNA ved å tilsette 5 volum TRIzol reagens etterfulgt av Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).

cDNA-biblioteket ble generert med et KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) og sekvensert på en Illumina HiSeq 2500-plattform. Toppanropsresultater med immunutfelling og inngangsbiblioteker ble generert av R-pakken RIPSeeker (Li et al., 2013). HOMER ble brukt til å finne motiver av datafordelingen i toppregioner. Kalte topper ble annotert ved skjæring med gen- og transkripsjonsarkitektur ved bruk av ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010).

mRNA stabilitetsanalyse

Rensede milt-NK-celler fra Ythdf2ΔNK- og Ythdf2WT-mus ble dyrket med IL-15 (50 ng/ml). 3 dager etter dyrking ble cellene behandlet med actinomycin D (5 µg/ml, kat.nr. A9415; Sigma) i den angitte tiden. Celler uten behandling ble brukt etter 0 timer. Celler ble samlet på det angitte tidspunktet, og totalt RNA ble ekstrahert fra cellene for qPCR. mRNA-halveringstiden ble beregnet ved hjelp av metoden tidligere beskrevet av Weng et al. (2018). Primersekvenser er oppført i tabell S1.

Online databaseanalyse

Vi brukte nettressursen BioGPS (http://biogps.org) for å analysere det vevsspesifikke uttrykket til Ythdf2. RNA-seqdatasettene var fra GEO under tilgangsnr. GSE106138,GSE113214 og GSE25672. Normaliserte data fra RNA-seq-analyser ble eksportert, og genuttrykket z-score ble visualisert med Heatmap.2-funksjonen i gplots Rlibrary

Statistikk

Ikke-parede Students t-tester (to-tailed) ble utført ved bruk av GraphPad Prism-programvare. Enveis eller toveis ANOVA ble utført når tre eller flere uavhengige grupper ble sammenlignet. P-verdier ble justert for flere sammenligninger ved å bruke Holm-Sˇ´ıdak-prosedyren. P < 0.05 ble ansett som signifikant. *, P < {{10}}.05; **, P < 0,01; og ***, P < 0,001.

Online tilleggsmateriell

Fig. S1 viser proteinnivåene til YTHDF2 i immunceller, inkludert NK-celler som respons på IL-15-stimulering, MCMV-infeksjon og tumorprogresjon; generasjonen av mus med NKcell-spesifikk sletting av Ythdf2. Fig. S2 viser virale titere i milten og leveren fra mus infisert med MCMV og prosentandelen og det absolutte antallet Ly49H+ og/eller Ly49D+ NK-celler hos mus infisert med MCMV. Fig. S3 viser spredning, overlevelse, modning og ekspresjon av aktiverende og hemmende reseptorer av NK-celler fra Ythdf2WT- og Ythdf2ΔNK-mus. Fig.S4 viser reguleringen av YTHDF2-ekspresjon ved IL-15-STAT5-signalering og uttrykket av komponentene til IL-15-reseptorer, PI3K–AKT-veien og MEK–ERK-veien iNK-celler fra Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK mus. Fig. S5 viser transskriptomomfattende RNA-seq-, m6A-seq- og RIP-seq-analyser i NK-celler. Tabell S1 viser primerne som ble brukt i studien.

Datatilgjengelighet

RNA-seq-, m6A-seq- og RIP-seq-dataene ble deponert i National Center for Biotechnology Information GEO under tiltredelsesnr. GSE174027. De resterende dataene som støtter funnene i denne studien er tilgjengelig fra de tilsvarende forfatterne på forespørsel.

Anerkjennelser

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 og CA210087), Leukemia and Lymphoma Society (1364-19), California Institute for Regenerative Medicine ({DISC2COVID) 9}}), og Breast Cancer Alliance 2021 Exceptional ProjectAward. Dette arbeidet ble også delvis støttet av en USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843).

Forfatternes bidrag: S. Ma, J. Yu og MA Caligiuri unnfanget og designet prosjektet. S. Ma, J. Yan, J. Zhang og J. Yu utførte eksperimenter og/eller dataanalyser. Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun og J. Chen bidro med reagenser og materialstøtte. S. Ma, J. Yu, J. Chen og MA Caligiuri skrev, anmeldte og/eller reviderte papiret. Alle forfatterne diskuterte resultatene og kommenterte manuskriptet.

Avsløringer: J. Chen rapporterte "annet" fra Genovel BiotechCorp. utenfor det innsendte arbeidet og er en vitenskapelig grunnlegger av Genovel Biotech Corp. og en vitenskapelig rådgiver for raseonkologi. Ingen andre avsløringer ble rapportert.

Referanser

1. Arase, H., ES Mocarski, AE Campbell, AB Hill og LL Lanier. 2002. Direkte gjenkjennelse av cytomegalovirus ved å aktivere og hemmende NKcelle-reseptorer. Vitenskap. 296:1323-1326.

2.Ayala, YM, T. Misteli og FE Baralle. 2008. TDP-43 regulerer retinoblastomproteinfosforylering gjennom undertrykkelse av syklinavhengig kinase 6-ekspresjon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105:3785-3789.

3. Barbieri, I., K. Tzelepis, L. Pandolfini, J. Shi, G. Millan-Zambrano, SC Robson, ´D. Aspris, V. Migliori, AJ Bannister, N. Han, et al. 2017. Promoter-boundMETTL3 opprettholder myeloid leukemi ved m6A-avhengig translasjonskontroll. Natur. 552:126–131.

4. Becknell, B. og MA Caligiuri. 2005. Interleukin-2, interleukin-15 og deres roller i menneskelige naturlige morderceller. Adv. Immunol. 86:209–239.

5. Bertoli, C., JM Skotheim og RA de Bruin. 2013. Kontroll av cellesyklustranskripsjon under G1- og S-faser. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14:518–528.

6. Bezman, NA, CC Kim, JC Sun, G. Min-Oo, DW Hendricks, Y. Kamimura, JA Best, AW Goldrath og LL Lanier. Immunologisk genomprosjektkonsortium. 2012. Molekylær definisjon av identiteten og aktiveringen av naturlige drepeceller. Nat. Immunol. 13:1000–1009.

7.Carson, WE, JG Giri, MJ Lindemann, ML Linett, M. Ahdieh, R. Paxton, D.Anderson, J. Eisenmann, K. Grabstein og MA Caligiuri. 1994. Interleukin (IL) 15 er et nytt cytokin som aktiverer menneskelige naturlige morderceller via komponenter av IL-2-reseptoren. J. Exp. Med. 180:1395–1403.

8.Carson, WE, TA Fehniger, S. Haldar, K. Eckhert, MJ Lindemann, CF Lai, CM Croce, H. Baumann og MA Caligiuri. 1997. En potensiell rolle for interleukin-15 i reguleringen av overlevelse av menneskelige naturlige drepeceller. J. Clin. Investere. 99:937–943.

9. Chan, CJ, MJ Smyth og L. Martinet. 2014. Molekulære mekanismer for aktivering av naturlig drepeceller som svar på cellulært stress. Celledødforskjell. 21:5–14.

10. Chen, X., J. Han, J. Chu, L. Zhang, J. Zhang, C. Chen, L. Chen, Y. Wang, H. Wang, L. Yi, et al. 2016. Kombinasjonell terapi av EGFR-CAR NK-celler og onkolytisk herpes simplex virus 1 for brystkreft hjernemetastaser.Oncotarget. 7:27764-27777.

For more information:1950477648nn@gmail.com