Rollen til genetisk testing i diagnostikkarbeidet til pediatriske pasienter med nyresykdommer: opplevelsen av en enkelt institusjon

AbstraktHensiktArvelige nyresykdommer er blant de viktigste årsakene til nyresvikt hos barn, noe som resulterer i økt dødelighet, høye helsekostnader og behov for organtransplantasjon. Neste generasjons sekvenseringsteknologier kan hjelpe til med diagnostisering av sjeldne monogene tilstander, noe som muliggjør optimalisert medisinsk behandling og terapeutiske valg.

Metoder Klinisk eksomsekvensering (CES) ble utført på en kohort av 191 pediatriske pasienter fra en enkelt institusjon, etterfulgt av Sanger-sekvensering for å bekrefte identifiserte varianter og for familiesegregeringsstudier. Resultater Alle pasienter hadde en klinisk diagnose av nyresykdom: hovedsykdomskategoriene var glomerulære sykdommer (32,5 %), ciliopatier (20,4 %), CAKUT (17,8 %), nefrolithiasis (11,5 %) og tubulær sykdom (10,5 %). 7,3 % av pasientene hadde andre tilstander. En avgjørende genetisk test, basert på CES- og Sanger-validering, ble oppnådd hos 37,1 % av pasientene. Den høyeste påvisningsraten ble oppnådd for ciliopatier (74,4 %), etterfulgt av nefrolithiasis (45,5 %) og tubulære sykdommer (45 %), mens de fleste glomerulære sykdommer og CAKUT forble udiagnostisert. Konklusjoner Resultatene indikerer at genetisk testing konsekvent brukt i den diagnostiske arbeidsflyten til barn med kronisk nyresykdom kan (i) bekrefte klinisk diagnose, (ii) gi en tidlig diagnose i tilfelle av arvelige tilstander, (iii) og den genetiske årsaken til tidligere ukjente. sykdommer og (iv) skreddersy transplantasjonsprogrammer.

Nøkkelord Klinisk eksomsekvensering, Neste generasjons sekvensering,Nyresykdommer, Genetisk testing, Pediatrisk kohort

KLIKK HER FOR Å FÅ CISTANCHE FORSLUTSTEDE NYRESYKDOM

Introduksjon

Pediatriske nefropatier omfatter vidt forskjellige sykdomsenheter når det gjelder klinisk presentasjon, evolusjon og terapeutiske alternativer [1–4]. Omtrent 30 % av barn med kronisk nyresykdom (CKD) lider av en monogen tilstand, en prosentandel øker når man vurderer barn med terminal nyresykdom (ESRD) [5, 6]. Mange av disse barna forblir udiagnostisert på tidspunktet for transplantasjon [4, 6, 7]. Å nå en diagnose for disse pasientene innebærer ikke bare slutten på en diagnostisk odyssé, men gir flere fordeler for prognose, behandling og behandling

Banebrytende studier har konsekvent vist at implementeringen av neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS) har betydelig forbedret det diagnostiske utbyttet hos pasienter med arvelige nyresykdommer (IKD) [8]. Nylig har den utbredte bruken av NGS gjort den tilgjengelige genetiske diagnosen tilgjengelig på rimelig tid og til rimelige kostnader, noe som reiser spørsmålet om og når den bør integreres i den rutinemessige diagnostiske arbeidsflyten [5].

Genetisk diagnose hos barn er av største betydning for ulike aspekter. Den første er at den kan være relevant i den kliniske tilnærmingen til sykdommen, det typiske eksempelet er nefrotiske syndromer hvor identifisering av strukturelle varianter i podocyttrelaterte gener argumenterer mot immunsuppressive terapier som ellers ville blitt rutinemessig brukt over en periode på flere måneder [9]. Det andre er at det kan være svært relevant for barnets familie og for identifisering av andre medlemmer som bærer varianten som muligens kan overføres til fremtidige generasjoner. Når en patogen variant er identifisert i en proband, representerer kaskadetesting av familiemedlemmer og genetisk rådgivning hos variantbærere standard praksis innen klinisk genetikk [5]. Den tredje er at det er essensielt å kjenne til den patogene varianten i transplantasjonssammenheng der giveren kan være en slektning. Det er faktisk avgjørende å utelukke tilstedeværelsen av samme variant(er) i organdonoren, så vel som det er avgjørende å identifisere alle familiemedlemmer som potensielt har behov for en transplantasjon. Den fjerde er at noen sykdommer gir høy risiko for tilbakefall etter organtransplantasjonen, slik som fokal segmentell glomerulosklerose [10] eller deres utfall kan forbedres ved et mer skreddersydd valg av transplantasjonen som skal utføres, for eksempel ved primær hyperoksaluri hvor en kombinert nyre-levertransplantasjon kan gi et bedre resultat [11]. Til slutt kan det å ha en klar sykdomsdiagnose være nyttig for pasienten å ta del i kliniske studier og dra nytte av nye behandlingsalternativer [12, 13].

På slutten av 2018, i et samarbeid mellom pediatriske nefrologer og genetikere, begynte vi å utføre genetiske tester for monogene tilstander som potensielt kan føre til ESRD og dermed transplantasjon. Sykehuset vårt er det største i Nordvest-Italia, og drenerer fra et område på rundt 5 millioner mennesker. Vi valgte en "one size fits all" type analyse, med sekvensering av det kliniske eksomet, dvs. omtrent 6700 gener som er assosiert med monogene tilstander, med fokus på analyse på genpaneler skreddersydd til den kliniske mistanken og derfor begrenset tilfeldige funn og redusere tid for sekvensanalyse.

Totalt sett, ved å bruke denne rørledningen, oppnådde vi et diagnostisk utbytte i tråd med publiserte data, med en viss heterogenitet mellom de forskjellige kliniske mistankene, som forventet. Resultatene som er oppnådd bekrefter relevansen av å inkludere rutinemessig genetisk testing og rådgivning i den diagnostiske arbeidsflyten til pediatriske pasienter påvirket av nefropatier. Faktisk er identifiseringen av årsaksvarianter avgjørende for deres kliniske behandling, og potensielt for optimalt utvalg av levende donorer.

Materialer og metoder

Pasientrekruttering

Studien var basert på en diagnostisk kohort på 191 påfølgende pediatriske pasienter (alder ved rekruttering < 18 år), rekruttert av enhetene for pediatrisk nefrologi, dialyse og transplantasjon ved Regina Margherita barnesykehus og henvist til immunogenetikk og transplantasjonsbiologitjenesten for genetisk analyse. Alle pasienter inkludert i studien ga et skriftlig informert samtykke signert av begge foreldrene, når det var mulig.

Prøveforberedelse, sekvensering og bioinformatikkanalyser

Nukleinsyreekstraksjon fra perifert blod, analyse av DNA-kvalitet, bibliotekpreparering og sekvensering ble utført som tidligere rapportert [14]. Rådata innhentet fra sekvensering ble konvertert til FASTQ-filer og deretter justert med Enrichment 3.1.0 eller DRAGEN Enrichment-verktøy (Illumina) og kartlagt på TruSight One Expanded v2.0-manifest ved å bruke Homo Sapiens UCSC GRCh37-genom som en referanse for å få enkeltnukleotidvarianter, kopinummervarianter (CNV) og strukturelle varianter av filer. For identifikasjon av kopinummer ble en baseline laget av sekvenseringsdata fra 5 forskjellige pasienter, alle negative for CNV (i henhold til komparative genomiske hybridiseringsdata) brukt. Denne tilnærmingen gjør det mulig å påvise CNV selv i seksuelle kromosomer siden referansegruppen var laget av både kvinnelige og mannlige individer, og kjønnet til forsøkspersonen som skulle analyseres ble alltid spesifisert under justeringsfasen. Variantoppkalling og prioritering ble gjort etter definerte kriterier. Lesejustering og eksondekning av gen av interesse ble sjekket og vist av Integrative Genomics Viewer IGV, fritt tilgjengelig fra UC San Diego—University of California og Broad Institute of MIT og Harvard University—Boston (https://software.broadinstitute. org/ software/igv/). Varianter som skal inkluderes i den endelige genetiske rapporten ble klassifisert i henhold til American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) kriterier.

Generering av in silico-gen-sykdomsliste

Gener som skulle vurderes for variantidentifikasjon og prioritering ble definert basert på de kliniske mistankene. I silico-genlister ble det generert matchende (i) data fra forskjellige databaser, korrelerende genotype til fenotype (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards), og (ii) data fra litteraturen. De tilgjengelige genlistene oppdateres en gang i året basert på nye bevis på gen-sykdomsassosiasjon.

Sanger-sekvensering og multipleks ligasjonsavhengig probeamplifikasjon (MLPA)

Sanger-sekvensering og/eller MLPA-analyser ble utført for å validere varianter identifisert av NGS og for familiesegregeringsstudier. Kort fortalt ble DNA ekstrahert fra en andre uavhengig aliquot av proband perifert blod og fra foreldrene. DNA-regionene av interesse ble amplifisert ved PCR ved bruk av spesifikke eksperimentelle forhold. Renheten og spesifisiteten til de amplifiserte områdene ble kontrollert med 0,8 eller 1,5 % agarosegel. Amplifiserte PCR-produkter ble deretter Sanger-sekvensert ved bruk av de samme primerne. For PKD1-varianter ble validering utført ved bruk av en langdistanse-PCR etterfulgt av en nestet PCR for å unngå slutninger fra pseudogenene.

Resultater

Definisjon av kriterier for returnering av genetiske analyseresultater

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 gener alle involvert i ulike former for nyresykdommer [14]. For denne studien implementerte vi analyse med underpaneler fokusert på den spesifikke kliniske kategorien av mistanke (f.eks. CAKUT, glomerulopati, tubulopati, etc.) og prioriterte en spesifikk gruppe gener for analyse. Denne tilnærmingen begrenset antallet analyserte gener, forenklet analyser og reduserte antall tilfeldige funn. Først når på slutten av analysefeltet med relevante panel(er) det genetiske resultatet var negativt og (i) den kliniske fenotypen ikke klart indikert eller (ii) overlappende ulike sykdomskategorier, ble genetisk analyse utvidet til s.k. "nyre full-list eller kidneyome", et superpanel som omfatter alle genene som er inkludert i underpanelene.

Som et første trinn definerte vi et sett med kriterier for tolkning av NGS-resultater. Etter å ha utført klinisk eksomsekvensering (CES) og datajustering, ble det bestemt en analysepipeline for å filtrere inn de relevante variantene. Spesifikt, basert på klinisk mistanke, ble identifiserte varianter filtrert basert på i silico-genlister, spesifikke for de forskjellige sykdomsmakrokategoriene. Synonyme varianter som ikke påvirker skjøtemekanismen eller introniske varianter som ikke kartlegges innenfor skjøteregionen, ble ekskludert, og tok kun hensyn til de ikke-synonyme, tullete, rammeskift og skjøtepåvirkende varianter. Ti, bare sjeldne varianter (frekvens mindre enn 1 % i populasjonen) og varianter med en allelfrekvens hos pasienten på minst 0.2 og dekning på minst 20 avlesninger ble inkludert. De resterende variantene ble kommentert og ytterligere kuratert basert på (i) arvemåte, (ii) nukleotidkonservering, (iii) proteinpåvirkning, utnyttelse av forskjellige databaser for å sjekke poengsummene og (iv) litteratur, hvis noen. På dette tidspunktet ble innfiltrerte varianter listet opp i en såkalt "teknisk rapport". Den tekniske rapporten ble tolket av en medisinsk genetiker for å produsere den endelige genetiske rapporten for pasienten og hans/hennes familie. Under den genetiske konsultasjonen ble familiesegregeringsstudier foreslått for å (i) bekrefte variantene i probandet, og (ii) å inkludere/ekskludere ikke-årsaksvarianter basert på deres segregering i familien (fig. 1).

Ved å ta i bruk disse kriteriene var vi i stand til å definere tre forskjellige kategorier av genetiske rapporter. Først en "avgjørende rapport" som inkluderte patogene (C5) og sannsynlig patogene (C4) varianter. Rapporter om varianter av ukjent signifikans (C3) ble ansett som avgjørende bare hvis de var fullt forenlige med det kliniske bildet og hvis familiesegregeringsstudier bekreftet deres mulige rolle. For det andre en "usikker rapport" som inkluderte C3-varianter identifisert av CES som ennå ikke er eller ikke kunne valideres i sammenheng med familiesegregeringsstudier eller C4/C5-varianter som ikke var helt i tråd med den kliniske fenotypen. For det tredje en "ikke konklusjonsrapport" som inkluderte (i) en negativ CES-analyse, noe som betyr at ingen varianter ble identifisert av NGS; (ii) enkeltvarianter i recessive gener; og (iii) C3-varianter som ikke er i tråd med den kliniske fenotypen, identifisert da analysen ble utvidet til allenyresykdomsrelaterte gener(Figur 1).

Hovedtrekk ved den rekrutterte kohorten

Denne studien beskriver en kohort på 191 pediatriske pasienter (0–18 år) som fortløpende ble henvist av Pediatric Nephrology Unit for genetisk analyse fra november 2018 til mai 2022, med et gjennomsnitt på 50 nye pasienter registrert hvert år . Kriterier for genetisk testing var (i) nefropati assosiert med en positiv familiehistorie med nyresykdom eller (ii) klinisk mistanke om en monogen tilstand eller (iii) behov for å utelukke en monogen tilstand (som i tilfellet med nefrotisk syndrom, der man skiller monogene versus ikke-monogene sykdommer har klinisk betydning for prognose og behandling).

Kohorten ble delt på grunnlag av den kliniske mistanken, og tok for seg 6 forskjellige sykdomsmakrokategorier: medfødte avvik i nyre og urinveier (CAKUT; n=34), ciliopatier (n=39), glomerulopati (n=62), nefrolithiasis (n=22), tauopatier (n=20) og andre sykdommer som også inkluderte syndromiske fenotyper (n=14). Bortsett fra CAKUT og tubulopatier som viste lik fordeling mellom kvinner og menn, i alle de andre kategoriene, var det en prevalens av mannlige forsøkspersoner (fig. 2a). Når man ser på rekrutteringsalderen, ble det ikke fremhevet noen signifikant forskjellig fordeling blant de ulike gruppene, med gjennomsnittsalder fra 6,7 ​​til 10 år i henholdsvis «Andre sykdommer» og glomerulopatier. Men når man ser på medianalderen, viste CAKUT-sykdommer den laveste verdien (4,6 år gammel), i tråd med en medfødt fenotype. Fra etnisitetssynspunkt, uavhengig av sykdomsmakrokategorien vurdert, var de fleste pasienter europeiske, etterfulgt av afrikanske, med bare noen få pasienter som var asiatiske, latinamerikanske eller kryssede (fig. 2b). Blant kohorten var det kun 8 pasienter som hadde slektninger.

Fig. 1 Genetisk dataanalysepipeline og kriterier for variantinkludering. Skjematisk representasjon av den analytiske rørledningen brukt for variantidentifikasjon og prioritering, inkludert alle inn- og utfiltreringskriteriene. De resulterende variantene ble inkludert i den endelige genetiske rapporten. Når det var mulig, ble variant(er) validering og familiesegregeringsstudier utført. Genetiske rapporter ble klassifisert som konkluderende, usikre eller inkonklusive basert på de angitte kriteriene. Basert på denne klassifiseringen ble diagnosehastigheten for neste generasjons sekvenseringsarbeidsflyt (NGS) beregnet. 1 kg: 1000 genom database; Alt fr: endret frekvens; C3: variant av ukjent betydning; C4: sannsynlig patogen variant; C5: patogen variant; AR: autosomal recessiv

Til slutt, når man tar hensyn til familiehistorie for nyresykdommer med tanke på mannlige og kvinnelige forsøkspersoner separat, var heterogenitet i fordelingen mellom positive og negative tilfeller tydelig med tanke på de forskjellige sykdomskategoriene. Totalt sett var det meste av den rekrutterte kohorten og uavhengig av kjønn ikke preget av en positiv familiehistorie, som vist for CAKUT, glomerulopatier, tauopatier og andre nyresykdommer. Men i ciliopatier og nefrolithiasis, viste en betydelig andel av tilfellene en positiv familie med en annen fordeling mellom kvinner og menn (13 tilfeller av 22 for ciliopatier, og 5 av 12 for nefrolithiasis; fig. 2c).

Fra et klinisk synspunkt var kohorten ganske heterogen med forskjellige primærsykdommer inkludert (fig. 2d). Blant dem var de mest tilbakevendende kliniske mistankene polycystisk nyresykdom (n=27), CAKUT (n=25), nefrotisk syndrom (n=19), fokal segmentell glomerulosklerose (FSGS; n) =14) og Alports syndrom (n=13; fig. 2d).

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKK HER FOR Å FÅ NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 25 % ECHINACOSIDE OG 9 % ACTEOSIDE FOR NYRESINFEKSJON