Rollen til nyremakrofager, AIM og TGF-b1-uttrykk i nyrefibroseprogresjon hos IgAN-pasienter

For mer info. ta kontakt medtina.xiang@wecistanche.com

Objektiv: For å analysere uttrykket av makrofager, AlM og TGF- 1 i nyrene til lgAN-pasienter, og å utforske rollen til makrofager, AlM og TGF- 1 i progresjonen av nyrefibrose hos lgAN-pasienter .

Metoder: Parafinprøvene av nyrevev fra 40 lgAN-pasienter ble valgt som observasjonsgruppe. Samtidig ble parafinprøver av normalt nyrevev fra 11 pasienter behandlet med nefrektomi valgt som normal kontrollgruppe. Vi observerte fordelingen av makrofager og ekspresjonen av AlM og TGF - 1 ved immunhistokjemisk farging og/eller immunfluorescens.

Resultat: Antall MO-, M1- og M2-makrofager kan bli funnet å øke hos lgAN-pasienter. M0 makrofager er hovedsakelig polarisert mot M2 makrofager. Ekspresjonen av AlM og TGF- 1 var signifikant høyere hos lgAN-pasienter enn i NC. M2 makrofag, AlM og TGF- 1 var positivt korrelert med serumkreatinin og 24-times proteinuri, men negativt korrelert med eGFR. M2-makrofager, AlM og TGF- 1 var positivt korrelert med det fibrotiske området.

Konklusjon: M2-makrofager, AlM og TGF- 1 spiller viktige roller i prosessen med lgAN-fibrose, og de tre påvirker hverandre.

Nøkkelord: IgAN, nyrefibrose, makrofager, AlM, TGF- 1

Bli kjent med cistanche hvor du kan kjøpe og effekten av cistanche ved lenken 

INTRODUKSJON

IgA nefropati(IgAN) er en vanlig systemisk immun glomerulonefritt, som er karakterisert ved avsetning av IgA eller IgA-baserte immunkomplekser i mesangialområdet med mesangial celleproliferasjon og mesangial matriseekspansjon(1,2). Selv om IgAN utvikler seg sakte, utvikler opptil 50 prosent av pasientene til sluttstadiet, og det er hovedtypen som forårsaker ESRD(3).Nyrefibroseer den vanlige veien i progresjonen avKronisk nyre sykdom(CKD)(4). I de siste årene har det blitt funnet at makrofager, apoptoseinhibitor av makrofag (AIM) og transformerende vekstfaktor- 1(TGF- 1) alle spiller viktige roller i nyrefibrose.

Makrofager er involvert i utviklingen av mange nyresykdommer. Noen forskere mener at avsetningen av makrofager i nyrene kan brukes som en viktig indikator for å bedømme utviklingen og prognosen av nyresykdommer. Makrofager er delt inn i M0-, M1- og M2-typer(5). Ml-makrofager fremmer typen inflammatorisk respons og fjerner bakterier eller tumorceller ved å skille ut inflammatoriske faktorer som IL-1, IL-6, IL-12, TNF-, reaktive oksygenarter (ROS), og nei. Men hvis betennelsen vedvarer, vil den spre seg ytterligere og til slutt føre til vevsfibrose (6). Ved å uttrykke Arginase 1 (Argl), Kitinase-lignende 3 protein (Yml) og hypoksi-indusert mitogen faktor (HIMF) for å motstå stimulering av patogene mikroorganismer og allergener, begrenser M2 makrofager inflammatorisk respons og type I adaptivimmunitet, eliminere rester, fremme angiogenese, spille en anti-inflammatorisk rolle, redusere celleapoptose, fremme celleproliferasjon og fremme vevsreparasjon(7,8). Nøyaktig hvilken type makrofag som spiller en viktig rolle i nyrefibrose av IgAN er fortsatt kontroversielt . Studier viste at CD68 og CD80 kan brukes som spesifikke overflatemarkører av MO- og M1-makrofager(9); CD163 er en svært spesifikk mannosereseptor uttrykt i M2-makrofager, som ikke er uttrykt i M1-makrofager. Dermed kan CD68, CD80 og CD163 brukes som markører for å representere tilstedeværelsen av forskjellige typer makrofager (10-12).

I tillegg ble AIM opprinnelig oppdaget som et utskilt protein fra makrofager og ble derfor kalt Spa(13). Den ble senere kalt AIM etter at dens antiapoptotiske effekt på hvite blodlegemer ble funnet(14), eller CD5L i henhold til nomenklaturen for menneskelig genomorganisasjon. AIM har et bredt spekter av funksjoner og spiller en viktig rolle i å regulere leukocyttmigrasjonsbalansen, metabolisme oginflammatoriskrespons. Mange typer litteratur har nevnt at AIM spiller en rolle i immun-inflammatorisk respons(15), lipidhomeostase, alkoholfrileversykdom(16), autoimmun sykdom, aterosklerose(17) og andre sykdommer. De siste årene har det vært en rekke studier på rollen til AIM ved nyresykdom. For eksempel, Tadashi Uramat et al. (18) funnet i den hypertensive utsatte musemodellen at reduksjon av ekspresjonen av AIM og oxLDL (oksidert lavdensitetslipoprotein, som har effekten av å oppregulere uttrykket av AIM) effektivt kan redusere fibrose av nyrevev. Tilsvarende har Megumi Oshima et al. (19) fant at området for AIM og makrofagavsetning i nyrevev var positivt korrelert med alvorlighetsgraden av proteinuri og eGFR-reduksjon hos pasienter med CKD. Alle de ovennevnte studiene tyder på at AIM også spiller en viktig rolle i prosessen med nyrefibrose. Imidlertid eksisterer det for øyeblikket motsatte resultater: Det er funnet i modellen for akutt nyreskade at AIM kan fremme fjerning av apoptotiske cellerester av renale tubulære epitelceller (20).

For tiden har mange studier utdypet rollen til makrofager, AIM og TGF- 1 i nyresykdom, men det er få studier på rollen til de tre i utviklingen av IgAN, fibroseprosessen og korrelasjonen mellom de tre. Hvis patogenesen for progresjonen av IgAN-fibrose kan avklares, kan det åpne et nytt vindu for behandling og prognose av IgAN. For å undersøke rollen til makrofager, AIM og TGF- 1 i progresjonen av IgAN-fibrose, oppdaget vi infiltrasjon av makrofager i nyrevev hos IgAN-pasienter og ekspresjonsnivået og egenskapene til AIM og TGF- 1 og analyserte deretter forholdet mellom de tre og klinisk relaterte indikatorene og nyrefibroseområdet til IgAN-pasienter.

METODER

Emner

Førti pasienter med IgAN bekreftet via nyrebiopsi ble rekruttert fra Subei People Hospital. Pasienter med kroniske systemiske sykdommer (systemisk lupus erythematosus, diabetes mellitus, Henoch-Schönlein purpura, levercirrhose, etc.), (behandling av glukokortikoid, immunsuppresjon, ACEI, ARB, etc.), eller avansert nyresvikt (estimert glomerulær filtrasjonshastighet( eGFR) Mindre enn eller lik 15ml/min/1,73m2) ble ekskludert.eGFR-nivåer ble beregnet ved å bruke ligningen Modification of Diet in Renal Disease (MDRD). Klinisk informasjon (kjønn, alder, vekt, sykdomshistorie) og laboratoriedata ( serumalbumin, serumkreatinin, røde blodlegemer i urin, 24 timers urinprotein og eGFR-nivåer) ble samlet ved tidspunktet for biopsi. Histologisk normalt nyrevev dissekert ved siden av nyretumorer ble brukt som kontroller (n=11). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersoner, og studien ble godkjent av den etiske komiteen ved Subei People Hospital.

Immunfluorescerende og immunhistokjemisk farging

Humane nyrevevsseksjoner ble analysert med immunhistokjemisk og immunfluorescerende farging. Masson-farging ble utført på alle humane nyrevevsseksjoner. Seksjonene ble avparafinisert og behandlet med 3% hydrogendioksyd. Etter antigeninnhenting og blokkering ble seksjoner inkubert over natten med et humant CD68-antistoff (fortynnet 1:600, Abcam), humant CD80-antistoff (fortynnet 1:600, Abcam), humant CD163-antistoff (fortynnet 1:600, Abcam), humant AIM antistoff (fortynnet 1:150, Abcam) eller et humant TGF- 1-antistoff (fortynnet 1:500, Abcam). Etter behandling med et pepperrotperoksidase-merket biotin-konjugert sekundært antistoff (fortynnet 1:200, Biosynthesis Biotechnology, Kina) og DAB-farging (ZSGB-Bio, Kina), ble snitt observert under et mikroskop. 10 tilfeldig valgte felt (400×) ble avbildet per seksjon. Ekspresjonen av makrofager i glomeruli og tubuli ble kvantifisert ved bruk av Image-Pro Plus Image Analysis Software (Meyer Instruments, Inc., Houston, TX, USA); uttrykk for AIM og TGF- 1 i glomeruli ble kvantifisert på samme måte. Den integrerte optiske tettheten (IOD) ble målt for hvert bilde av to patologiske eksperter uavhengig. Gjennomsnittlig IOD/positivt farget område (AIOD) ble deretter beregnet. Makrofager, AIM og TGF- 1-ekspresjonsnivåer i IgAN-nyrebiopsier og normale nyrebiopsier ble sammenlignet ved å beregne AIOD. Kjerner ble farget med DAPI ved romtemperatur i 5 min. Bilder av fluorescerende merkede seksjoner ble oppnådd ved bruk av et fluorescerende mikroskop (ZEISS, Axioimager.Z2).

Masson-farging for fibrosevurdering

Fibroseområdet var grønt, og vi beregnet prosentandelen av det grønne området i synsfeltområdet for å reflektere graden av fibrose. Tre felt med høy forstørrelse ble tilfeldig valgt for hver seksjon (Alle prøver ble fotografert under de samme forholdene), og unngikk de store karene. IPP6.0 bildeanalysesystem ble brukt til å statistisk analysere arealforholdet til fibroseområdet (alle prøver ble analysert på samme måte).

Statistiske analyser

Statistisk analyse ble utført ved bruk av SPSS 22.0. Dataene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD eller som medianer (område). Signifikante forskjeller ble vurdert ved bruk av enten at-test eller enveis ANOVA. En ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test ble utført for å sammenligne den integrerte optiske tettheten mellom eksperimentelle grupper. En tohalet P<0.05 was="" considered="" statistically="">

RESULTATER

Distribusjon av makrofager i nyrene Immunfluorescens og immunhistokjemi (figur 1,2) viste at makrofager i IgAN-gruppen hovedsakelig ble distribuert i den renale tubulære interstitialen, og noen ganger i den glomerulære kapillære plexus og renal tubulær lumen, mens makrofager ikke ble distribuert i normalen. nyrevev.

Dessuten var antallet M{{0}}, Ml og M2 makrofager i nyrenes interstitium til IgAN forskjellig, og det var mer polarisering av M0 mot M2(P)<0.05, figure="">

Uttrykk av AIM, TGF- 1 i nyrevev I IgAN-gruppen uttrykkes AIM hovedsakelig i glomerulære kapillærløkker og renale tubulære epitelceller, så vel som i renal tubulær lumen; TGF- 1 uttrykkes hovedsakelig i renale tubulære epitelceller, men også i renal interstitium. Imidlertid var uttrykk for AIM og TGF - 1 sjeldne eller fraværende i normalt nyrevev (figur 4,5).

Uttrykk av makrofager, AlM, TGF- 1 med klinisk manifestasjon av lgAN

The infiltration of MO and M1 macrophages in the renal tissue of the IgAN group was not significantly correlated with age, sex, urinary red blood cell count,24-hour proteinuria, and eGFR (P>{{0}}.05). Antall M2-makrofaginfiltrasjon var positivt korrelert med serumkreatinin og 24-times proteinuri(r=0.447, P=0.004; r=0.436, P{ {10}}.005), og negativt korrelert med eGFR(r=-0.332, P=0.004)(Figur 6).24-times urinprotein, serumkreatinin og eGFR var korrelert med AIM og TGF- 1, blant annet var 24-timers urinprotein og serumkreatinin positivt korrelert med AIM og TGF- 1, mens eGFR var negativt korrelert med AIM og TGF-B1 (Tabell 1). Siden det ikke var noen signifikant korrelasjon mellom M0- og M1-makrofager og kliniske indikatorer, telte påfølgende data bare M2-makrofager. Ytterligere statistisk analyse viste at uttrykkene til M2-makrofager, AIM og TGF-B1 var forskjellige i forskjellige patologiske typer, og det var en korrelasjon mellom M2-makrofager, AIM og TGF- 1(tabell 2).

Korrelasjon av M2-makrofager, AlM, TGF- 1 og fibrotisk område

Statistisk analyse av korrelasjonen mellom fibrotisk område og M2-type makrofager, AIM og TGF- 1 i vevet til IgAN-pasienter viste at M2 makrofager var positivt korrelert med det fibrotiske området (Figur 7,r{ {4}}.777, s<0.01);aim was="" positively="" correlated="" with="" the="" fibrotic="" area(figure="" 8,r="0.768,"><0.01); tgf-β1="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" fibrotic="" area="" (figure="" 9,="" r="0.853,"><>

DISKUSJON

IgAN er den vanligste primære glomerulonefritten, og ca. 40 prosent av pasientene vil utvikle sluttstadium nyresykdom (ESRD) innen 20-30 år (21). Nyrefibrose er en nødvendig prosess for at all CKD skal utvikle seg til ESRD. De patologiske manifestasjonene er dannelsen av et stort antall fibroblaster og myofibroblaster og akkumulering av et stort antall ekstracellulær matrise, noe som fører til glomerulosklerose og renal tubulær interstitiell fibrose. Til syvende og sist mister nyrefunksjonen på grunn av tap av et stort antall normale nefroner(4). For tiden er nyrefibrose hovedsakelig delt inn i fire stadier:1. Aktivering av renale tubulære epitelceller og infiltrasjon av monocytter/makrofager på grunn av det inflammatoriske. 2. Frigjøring av cytokiner, vekstfaktorer og andre pro-fibrogene faktorer.3. Dannelsen av fibrose har hovedsakelig manifestert seg i avsetning av matriseproteiner. 4. Avsetningen av ekstracellulær matrise (ECM), er et stort stadium av strukturell og funksjonell svekkelse av nyrene (betydelig reduksjon av effektive nefroner og ytterligere nedgang i glomerulær filtrasjonshastighet).

Myeloide stamceller differensierer til monocytter og kommer inn i sirkulasjonen fra benmargen. Monocytter i sirkulasjonen migrerer og infiltrerer inn i vevene under forskjellige stimuli som betennelse og traumer, og differensierer deretter til makrofager. Makrofager er heterogene celler i det naturlige immunsystemet, som dynamisk kan regulere deres fenotyper for å tilpasse seg det lokale mikromiljøet. Monocytter i sirkulasjonen, drevet av inflammatoriske signaler, går inn i nyrene og fester seg til vaskulære endotelceller, og induserer frigjøring av kjemokiner og kroniske inflammatoriske faktorer samtidig. Dette resulterer i omfattende lokal aggregering av monocytter i nyrenes interstitial, som differensierer til klassisk aktiverte makrofager (M1) eller selektivt aktiverte makrofager (M2) via forskjellige veier. Til å begynne med aktiverer patogener og nekrotiske celler Toll-lignende reseptorer og andre medfødte immunreseptorer, og fremmer polariseringen av M0 makrofager til M1 makrofager. M1-makrofager avsettes gjennom kjellermembranen på et tidlig stadium av nyreskade, noe som fremmer en rekke inflammatoriske responser og fører til ytterligere nyreskade. Som utvikling av skade, fremmer de apoptotiske og nekrotiske cellene fagocytert av makrofager, samt den påfølgende generasjonen av antiinflammatoriske faktorer, polariseringen av makrofager mot M2-makrofager. M2-makrofager spiller hovedsakelig rollen som anti-inflammatorisk, fremmer nyreparasjon og forårsaker fibrose(6,22-26). Derfor indikerer den dynamiske balansen til M1- og M2-makrofagene prosessen med betennelse og vevsreparasjon, som bestemmer prognosen for nyrene og driver anstrengelser for terapier rettet mot makrofager.

I denne studien valgte vi nyrepatologisk vev fra pasienter som ble diagnostisert med IgAN og observerte polariseringen av forskjellige makrofager. Vi valgte CD68 for å representere M0, CD80 for å representere M1, og CD163 for å representere M2. Resultatene våre viste at antallet M0(CD68*)-makrofager, M1(CD80*)-makrofager og M2(CD163*)-makrofager henholdsvis var signifikant økt sammenlignet med normal nyre, noe som indikerer at det var en relativt åpenbar infiltrasjon av makrofager i nyrevev fra lgAN-pasienter.

It was not only found that the infiltration of macrophages in the renal tissue of IgAN patients increased significantly, but also found that there were differences in the number of M0, Ml, and M2 macrophages in the interstitium of lgAN patients, with more polarization of M0 towards M2. In other words, the infiltration of M2 macrophages is mainly found in the renal tissue of IgAN patients. There was a positive correlation between M2 macrophages and fibrotic area; The distribution of M0 and M1 macrophages in the lgAN group had no significant correlation with age, sex, urinary red blood cell count, 24-hour proteinuria, and eGFR(P>0.05); Imidlertid er antallet M2-makrofaginfiltrasjon positivt korrelert med serumkreatinin og 24-times proteinuri; Det er bevist at M2-makrofager spiller en viktigere rolle i progresjonen av IgAN-fibrose.

AIM spiller også en viktig rolle ved mange sykdommer, som åreforkalkning, ikke-alkoholisk leversykdom(16), insulinresistens (27), autoimmune sykdommer osv. Samtidig er AIM nært beslektet med nyrefibrose. Megumi Oshima et al.(19) tok nyrevev fra 43 nyrebiopsipasienter og fant at avsetningsområdet til AIM og makrofag var positivt korrelert med alvorlighetsgraden av proteinuri og eGFR-reduksjon hos pasienter. Det antydet at AIM kan ha forverret nyreskade. Tadashi Uramat et al.(18) etablerte alvorlig hypertensjon og induserte nyreskade ved å bruke en modell for spontan hypertensjonstendens (SHRsp) hos mus. Etter behandling av hypertensjon med relaterte legemidler, ble det funnet at antallet makrofager som infiltrerte glomeruli og interstitium ble betydelig redusert. Sammenlignet med kontrollgruppen var uttrykkene for AIM og oxLDL betydelig redusert. Dessuten var graden av fibrose i nyrevev mindre enn i den ubehandlede gruppen.

I vår studie var det signifikante forskjeller i uttrykket av AIM i hver patologisk grad, og uttrykket var signifikant positivt korrelert med M2-makrofager, TGF- 1 og graden av nyrefibrose. Dette eksperimentet og de ovennevnte forholdene tyder alle på at AIM er relatert til nyrefibroseprosessen ved CKD, som kan være relatert til den anti-apoptotiske effekten av AIM på makrofager, og deretter fremmer de kontinuerlige inflammatoriske signalene den videre utviklingen av fibrose. Takako Tomita et al.(28) ekstraherte nekrotiske celler fra mus med peritonitt indusert av gjærpolysakkarider in vitro og fant at AIM kunne fremme fagocytose av Ml- og M2a-makrofager til nekrotiske celler. Det ble også funnet i IgAN-modellen og modellen for akutt nyreskade for iskemi-reperfusjon (IRI) at AIM kunne fremme clearance av IgAl og apoptotiske celler som forårsaker nefritt av makrofager. Fra studiene ovenfor er det funnet at AIM, i likhet med makrofager, kan spille forskjellige roller i ulike stadier av sykdommen, mens rollen til AIM ved nyresykdom kan være lik makrofager.

I en CKD-modell forårsaket av IRI er M2-makrofager nært korrelert med prosessen med nyrefibrose, som hovedsakelig forårsakes av utskillelse av TGF- 1 (29). TGF- 1 tilhører TGF-superfamilien og spiller en viktig rolle i utviklingen av CKD(30). Tubulær epitelial myofibroblast transdifferensiering (TEMT) er også en viktig mekanisme for nyre interstitiell fibrose, og TGF- 1 er en viktig cytokinregulerende TEMT (31). Ved å bruke TGF- 1-nøytraliseringsantistoffer, hemmere, gen-knockout og andre metoder for å konsumere TGF- 1, kan graden av nyrefibrose effektivt reduseres (32). Til nå har mekanismene til TGF- 1 som forårsaker nyrefibrose hovedsakelig omfattet følgende punkter: 1. Induser syntesen av ekstracellulær matrise, slik som kollagen I og fibronektin(33). 2. Matrisemetalloproteinase (MMP) og vevsinhibitor av metalloproteinase (TIMPs) er ute av balanse, og reduserer dermed nedbrytningen av ekstracellulær matrise.3. Fremme mesangial celleproliferasjon, og kollagensekresjon og forårsake skade på epitel- og podocyttceller, og derved fremme inflammasjon og ytterligere vevsfibrose (34).4. Fremme transdifferensiering og spredning av myofibroblaster fra ulike kilder (som pericytter, epitelceller, endotelceller, fibroblaster, makrofager, etc.), og medierer dermed utviklingen av fibrose(35). Tidligere studier har observert at mRNA og proteinekspresjon av TGF-B1 i IgAN og infiltrasjonsgraden av M2 makrofager i nyrevev var signifikant økt sammenlignet med normalt nyrevev(31), TGF- 1 ble uttrykt sammen med M2 makrofager i nyrebiopsivev av CKD-indusert hypertensjon. Alle disse antydet at M2-makrofager kan spille en rolle i nyrefibrose gjennom TGF- 1.

I dette eksperimentet fant vi at med økningen i patologisk grad, økte også infiltrasjonen av M2-makrofager og ekspresjonsgraden av AIM og TGF- 1. Det var en signifikant forskjell mellom ulike patologiske grupper. Alle de tre var nært beslektet med 24-timers urinprotein, serumkreatinin, eGFR og andre kliniske indikatorer for IgAN-pasienter, og det var en signifikant positiv korrelasjon mellom de tre og området med nyrefibrose, noe som indikerer at M2 makrofager, AIM og TGF-B1 var alle involvert i forekomsten og utviklingen av lgAN og var nært knyttet til fibroseprosessen til IgAN. Resultatene av dette eksperimentet stemte overens med studiet til Braga et al. (36,37), som fant at M2-makrofager er involvert i nyrefibrose av unilateral ureteral obstruksjon (UUO) i en MyD88-signalvei. I motsetning til dette har studier funnet at makrofager spiller en anti-heroisk rolle i restitusjonsfasen av obstruktiv nefropati. Nishida et al. (38) demonstrerte at angiotensin II type 1 reseptor (Agtr1) på interstitielle makrofager fungerer for å redusere nyrefibrose på et senere stadium av UUO. Lopez-Guisa et al.(39) bekreftet at makrofager viste en fibrose-dempende rolle gjennom å aktivere en lysosomal kollagenomsetningsvei ved å uttrykke mannosereseptor 2 (Mrc2) i UUO.

M2-makrofager, AIM og TGF- 1 spiller viktige roller i prosessen med IgAN-fibrose, og de tre påvirker hverandre. På grunn av den lille prøvestørrelsen til dette eksperimentet og interaksjonsmekanismen og forholdet mellom de tre, vil det imidlertid være behov for ytterligere verifisering av relevante dyreforsøk.