Terapeutisk effekt og mekanisme av cistanche-fenyletanolglykosider på cyklofosfamid-indusert spermatogenese hos mus

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Sammendrag]

Hensikt:Å utforske den terapeutiske effekten avCistanche fenylethanoid glykosiderpå mus med cyklofosfamid-indusert spermatogenese og for å foreløpig avklare virkningsmekanismen.Metode:Etanolekstraksjonsmetode for å ekstrahereCistanche fenylethanoid glykosider. Førti BALB/C-mus ble tilfeldig delt inn i en kontrollgruppe, en modellgruppe, en lavdoseCistanche fenylethanoid glykosidgruppe (50 mg·kg-1), og en høydosegruppe (100 mg·kg-1), med 10 mus i hver gruppe. Med unntak av kontrollgruppen, ble mus i de andre gruppene injisert med cyklofosfamid (80 mg·kg-1) hver dag i 5 påfølgende dager for å forberede musemodeller av spermatogeneseforstyrrelser. Etter siste administrering, mus i lavdose- og høydosegruppeneCistanche fenylethanoid glykosiderble gitt tilsvarende doser ved sonde, og musene i kontrollgruppen og modellgruppen ble gitt samme volum av normalt saltvann ved sonde, en gang daglig i 30 dager. Tjuefire timer etter den siste sonden ble testisvevet fra mus tatt. En enzymbundet immunosorbentanalyse ble brukt for å bestemme nivået av testosteron i testikkelvevshomogenat fra mus. Spermtettheten, spermmotiliteten og spermavviksraten for hver gruppe ble sammenlignet. De morfologiske endringene av testikkelvev ble observert ved HE-farging. Resultater: Sammenlignet med kontrollgruppen, sank spermtettheten og spermmotilitetsraten til modellgruppen (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche fenylethanoid glykosiderble betydelig økt (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche fenylethanoid glykosidgruppe økt betydelig, Lagene er distinkte, de spermatogene cellene er ordnet pent, tett og regelmessig, og sædceller kan sees i lumen.Konklusjon: Cistanche fenylethanoid glykosiderhar en betydelig terapeutisk effekt på spermatogeneseforstyrrelsen forårsaket av cyklofosfamid hos mus, og dens mekanisme kan være relatert til forbedring av testosteronnivået i testikkelvev.

[Søkeord]Cistanche fenylethanoid glykosider; cyklofosfamid; spermatogenese lidelse; mus, BALB/C

Klikk for å Cistanche-produkter

På grunn av akselerasjonen av sosial rytme, dårlige levevaner og miljøforurensning, og andre faktorer, har unormal sædkvalitet som oligospermi og astenospermi blitt hovedårsaken til mannlig infertilitet [1]. For tiden er det færre medikamenter for behandling av oligospermi og astenospermi, og den terapeutiske effekten er ikke åpenbar. Resepter av tradisjonell kinesisk medisin eller aktive ingredienser har gode effekter på å forbedre mannlig reproduktiv funksjon [2-6]. Men på grunn av det store utvalget av reseptbelagte legemidler, er forholdet mellom de farmakologiske effektene og de effektive ingrediensene i legemidlet ikke klart, noe som begrenser markedsføringen og bruken av spermatogene legemidler. Forskning og utvikling av de effektive ingrediensene i kinesisk medisin og studiet av dens terapeutiske effekter ved reproduksjonsskader har god bruksverdi.Cistanche fenylethanoid glykosiderer en av de viktigste aktive ingrediensene iCistanche deserticola. De er vanligvis naturlige glykosider som inneholder esterbindinger og oksoglykosidbindinger med -glukose som kjernen. De er mye funnet i tofrøbladede planter [7]. Studier [8] har vist detCistanchefenyletanoidglykosiderkan beskytte rottesæd fra oksidativ skade in vitro, men det er ingen rapporter om spermatogenesen. Dette eksperimentet studerer den terapeutiske effekten av Cistanche fenyletanoidglykosider på den spermatogene funksjonen til mus med cyklofosfamid-indusert spermatogenese og gir et eksperimentelt og teoretisk grunnlag for bruk avCistanche fenylethanoid glykosideri behandling av spermatogenese lidelser.

1. Materialer og metoder

1.1. Laboratoriedyr, hovedreagenser og instrumenter

40 SPF-klasse voksne BALB/C mus, 6-8 uker gamle, med en kroppsmasse på 20-22g, ble kjøpt fra Animal Experimental Center ved Jilin University School of Basic Medicine, og dyresertifikatnummeret : SCXK (Kirgisistan) 2008-005. Musene ble avlet adaptivt i 5 dager før eksperimentet. Fôringsforhold: 22 grader ~ 25 grader, døgnrytme (12t/12t), gratis drikkevann og mat. Cistanche er et produkt fra Xinjiang Dakang Trading Company. Cyklofosfamid til injeksjon ble kjøpt fra Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (batchnummer 11061921). Testikkelvevshomogenat testosteronenzymkoblet immunanalysesett ble kjøpt fra Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (batchnummer) 20120812), andre reagenser er alle innenlandsproduserte analytiske kvaliteter. PLUS384 mikroplateleser (MDC i USA), TE2000U invertert mikroskop (Nikon, Japan) og J-26XP-sentrifuge (Nanodrop, USA).

1.2 Fremstilling av Cistanche Phenylethanol Glucoside

10 g cistanche-pulver ble ekstrahert ved tilbakeløpskjøling med 70% etanol, to ganger, 2 timer hver gang, for å oppnå fenetylalkoholglykosidkonsentrat. Den konsentrerte løsningen ble kromatografert på D101 makroporøs harpikskolonne og eluert med 70% etanol for å oppnå Cistanche fenekosidalkohol. UV-spektrofotometeret identifiserte ekstraktet ved en bølgelengde på 333 nm.

1.3 Utarbeidelse av dyremodell og legemiddeladministrasjonsmetode

Etter at 40 BALB/C hannmus ble adaptivt matet i 5 dager, ble musene tilfeldig delt inn i 4 grupper (10 mus i hver gruppe): kontrollgruppe, modellgruppe, CistancheCistanche fenylethanoid glykosiderlavdosegruppe, ogCistanche fenylethanoid glykosiderhøydosegruppe. Bortsett fra kontrollgruppen, ble de tre andre gruppene av mus gitt en intraperitoneal injeksjon av cyklofosfamid 80 mg·kg-1 for hver mus i 5 påfølgende dager for å forberede dyremodeller av spermatogeneseforstyrrelser. Etter at modellen ble utarbeidet, mus i lav- og høydosegruppeneCistanchefenyletanoid ble gitt henholdsvis 50 og 100 mg·kg-1·d-1. Musene i kontrollgruppen og modellgruppen fikk like store volumer av normalt saltvann. En gang om dagen i 30 dager. Alle mus ble avlivet 24 timer etter siste medikamentadministrering og bilaterale tester ble tatt. Høyre testis ble fikset med formaldehyd. Epididymis og testis ble tatt fra venstre side. Testisen ble homogenisert og sentrifugert ved 3,000 min i 10 min. Supernatanten ble tatt og lagret i en isboks ved -20 grader for testing. Den venstre bitestikkelen ble testet for spermtetthet, spermmotilitet og deformitetsrate.

1.4 Bestemmelse av spermtetthet, spermiemotilitet og deformitetsrate

Plasser et reagensglass som inneholder 10 mL spermnæringsoppløsning [9] i et vannbad med konstant temperatur for å forvarme det til 37 grader, ta en ensidig bitestikel for å fjerne bindevev og fett, kutt vevet og legg det i et reagensrør kl. 37 grader i 10 minutter Etter at sædcellene er helt fri, ta 1 dråpe på blodcelletelleplaten og beregne sædtettheten i henhold til celletellemetoden. Resultatet uttrykkes som antall sædceller per milliliter; ta i tillegg 5μL spermsuspensjon og samme mengde eosin-Y fra reagensrøret Bland godt, plasser det i romtemperatur i 10 minutter, tilsett et dekkglass og observer med et lysmikroskop. Døde sædceller farges rosa, levende sædceller farges ikke og cytoplasmaet er gjennomsiktig. Hver prøve teller 200 sædceller, beregner levedyktigheten til sædcellene, resultatet uttrykkes som en prosentandel, spermlevedyktighet=et antall levende sædceller / totalt antall sædceller × 100 prosent . Ytterligere 5 μL sædsuspensjon ble fiksert i metanol i 5 minutter, tørket og farget med 2 prosent vandig eosinløsning i 1 time, skylt og fønet. Se etter deler med mindre sædoverlapping under en linse med lav effekt, og bruk en linse med høy effekt for å sjekke sædmorfologien i rekkefølge. Hver mus inspiserte 1,000 komplett sperm. Spermhodene uten kroker, bananformede, amorfe, fete hoder og doble hoder ble bedømt som deformiteter. Spermdeformitetsraten ble beregnet og resultatene ble uttrykt i prosent. Sperm deformity rate=et antall deformerte sædceller / totalt antall sædceller × 100 prosent.

1.5 Bestemmelse av reproduktive hormoner

Testisen ble skrellet av membranen og plassert i en hetteglass, og det forhåndsavkjølte homogeniseringsmediet (0.01mol·L-1 sukrose, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1 mmol·L-1 EDTA-Na2-løsning, pH 7,4), kutt testisvevet med oftalmologisk saks, hell det i et homogeniseringsrør av glass og sentrifuger ved 4, 000×g i 10 minutter ved lav temperatur, og ta supernatanten. Bruk enzymkoblet immunosorbentanalysesett for å måle testosteronnivået i testikkelvevshomogenatet og test 3 parallelle prøver for hver prøve. De eksperimentelle trinnene og metodene ble fullført i samsvar med instruksjonene i settet.

1.6 Morfologisk observasjon av testis

Ta parafinsnitt av musetestis, farget med HE, og observer fordelingen av spermatogonia og spermatogene celler i testikkelvev under et lysmikroskop.

1.7 Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført ved bruk av SPSS17.0 statistisk programvare. Spermtetthet, spermmotilitetshastighet, spermdeformitetsrate og testikkeltestosteronnivå hos mus i hver gruppe ble uttrykt som x±s, og sammenligningen mellom gruppene ble utført ved enkeltfaktoranalyse av varians.

2. resultater

2.1. Spermtetthet, spermmotilitet og spermdeformitetsrate for hver gruppe mus

Sammenlignet med kontrollgruppen, sank spermtettheten og spermlevedyktigheten til modellgruppen (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche fenoksyetanolglykosidøkt (s<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Testosteronnivåer i testisvev hos mus i hver gruppe

Testosteronnivåene i testikkelvevshomogenatene til kontrollgruppen og modellgruppen var (10.26±0.57) og (5.33±0.84) nmol·L-1, hhv. Testosteronnivået til modellgruppen var betydelig lavere enn kontrollgruppen (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistanchecistanche fenetylglykosid høydosegruppen var signifikant høyere enn lavdosegruppen (P<>

2.3 Morfologi av musetestis i hver gruppe

Observert med lysmikroskop var sædrørene i testiklene til normalgruppen tett anordnet, nivået og antallet kjønnsceller var stort, sædepitelet var ordnet pent, og sædrørene ble alle sett med sæddannelse. I modellgruppen ble sædrørene i testiklene til mus atrofiert og degenerert, seminiferøse epitel ble betydelig tynnet ut, antall epitellag ble redusert, arrangementet var uordnet og antall sædceller i hulrommet ble redusert. Sammenlignet med modellgruppen er den lave dosen avCistanche fenetylalkoholglykosid.

I gruppen økte antallet seminiferøse epitellag av seminiferøse tubuli, arrangementet av epitelet var mer regelmessig, og skaden på seminiferøse tubuli var åpenbart forbedret; strukturen til seminiferøse tubuli i høydoseCistanche fenylethanoid glykosidgruppen forbedret seg mer signifikant, og antall og antall seminiferøse epitellag økte betydelig. Ordnet pent er det modne sædceller i sædrørene, og strukturen er i utgangspunktet tilbake til normal. Se figur 1 (innsats 6).

3 Diskusjon

Cyklofosfamid er et ofte brukt antitumorlegemiddel og immunsuppressivt middel, som hovedsakelig forstyrrer en rekke intracellulære biologiske funksjoner gjennom alkylering av DNA. Reproduksjonstoksisitet er en av hovedbivirkningene av cyklofosfamid [3], som lett kan føre til sperm-DNA-skade og unormal spermutvikling. Kliniske studier [10-11] indikerer at reproduksjonstoksisiteten til cyklofosfamid kan forårsake azoospermi eller oligospermi. , Fører til infertilitet eller forekomst av genetiske defekter eller misdannelser hos avkom.

Cistanche tubulosaer en flerårig høyere parasittisk plante i Leiden-familien. Det er en velkjent kinesisk medisin som gir næring til nyrene og yang, gir næring til blodet og gir næring til tarmen. Det er en vanlig reseptbelagt medisin for tradisjonell behandling av mannlig reproduktiv dysfunksjon [12].Fenyletanoide glykosiderer en av de viktigste aktive komponentene iCistanche[13] og har et bredt spekter av farmakologiske effekter, som antioksidasjon, anti-aldring og anti-tumor [14].

I denne studien ble cyklofosfamid brukt til å lage en musemodell av spermatogeneseforstyrrelse, og den terapeutiske effekten av Cistanche fenyletanoidglykosider på spermatogeneseforstyrrelse forårsaket av cyklofosfamid ble studert. Resultatene viste at sammenlignet med normalgruppen sank spermtettheten til modellgruppen, overlevelsesraten redusert og misdannelsesraten økte. Sammenlignet med modellgruppen, kan alle dosegruppene av Cistanche-fenoksyetanolglykosider effektivt øke spermtettheten, forbedre spermmotiliteten og redusere spermdeformitet. Resultatene ovenfor indikerer at cistanche-fenoksyetanolglykosidene kan fremme spermatogenese og beskytte den skadede testiklene. Resultatene av testismorfologi viste at etter behandling medCistanche fenylethanoid glykosid, ble antallet seminiferøse epitel i testiklene til modellmusene betydelig økt, lagene var distinkte, de spermatogene cellene var ordnet pent, tett og regelmessig, og sædceller kan sees i lumen, noe som tyder på atCistanche fenyletanoidkan endre Shanhe gjenoppretter strukturen og morfologien til seminiferøse epitel etter reproduksjonsskade.

Testosteron regulerer differensieringen av mannlige kjønnsceller og er en nødvendig betingelse for normal utvikling av testiklene og normal forekomst av sædceller. Noen studier [15] rapporterte at den selektive knockouten av androgenreseptorer i Sertoli-celler i testis forårsaket spermutviklingsforstyrrelser og mannlig sterilitet. I denne studien ble cyklofosfamid brukt til å produsere spermatogen.

Etter hinderskademodellen var testosteronnivået i testikkelvevet til musene betydelig lavere enn i normalgruppen. Etter virkningen av Cistanche fenyletanoidglykosider økte testosteronnivåene i hver dosegruppe, og testosteronnivået i høydosegruppen var signifikant høyere enn i lavdosegruppen. Det antydes at cistanche-fenoksyetanolglykosidene kan fremme spermatogenese ved å øke nivået av testosteron i testikkelvevet for å behandle spermatogen dysfunksjon, men mekanismen for dens effekt på testosteron trenger ytterligere forskning og diskusjon.

Testosteron regulerer differensieringen av mannlige kjønnsceller og er en nødvendig betingelse for normal utvikling av testiklene og normal forekomst av sædceller. Noen studier [15] rapporterte at den selektive knockouten av androgenreseptorer i Sertoli-celler i testis forårsaket spermutviklingsforstyrrelser og mannlig sterilitet. I denne studien ble cyklofosfamid brukt til å produsere spermatogen.

Etter hinderskademodellen var testosteronnivået i testikkelvevet til musene betydelig lavere enn i normalgruppen. Etter handlingen avCistanche fenylethanoid glykosider, økte testosteronnivåene i hver dosegruppe, og testosteronnivået i høydosegruppen var signifikant høyere enn i lavdosegruppen. Det antydes at cistanche-fenoksyetanolglykosidene kan fremme spermatogenese ved å øke nivået av testosteron i testikkelvevet for å behandle spermatogen dysfunksjon, men mekanismen for dens effekt på testosteron trenger ytterligere forskning og diskusjon.

[referanser]

[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. Ny fremgang innen mannlig infertilitetsforskning [J]. Chinese Journal of Andrology, 2006, 12(9): 771-774.

[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming, et al. Effekt av Guilingji-kapsel på modellrotter med oligospermi. Spermproduksjonens rolle og innvirkningen på kjønnshormoner [J]. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2011, 28(6): 621-623.

[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, et al. Epimedium totale flavonoider forårsaker minimering av cyklofosfamid. Forskning på den beskyttende effekten av rottefødt spermbarriere [J]. Kinesisk patentmedisin, 2010, 32 (12): 2052-2055.

[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing, et al. Shengjing-granuler på cyklofosfamid-indusert spermsvikt Hindrer den terapeutiske effekten til mus [J]. Journal of Zhengzhou University: Medical Science Edition, 2008, 43(2): 267-270.

[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing, et al. Effekt av Shengjing-granulat av kinesisk medisin på spermatogenese-svekket mus Eksperimentell forskning på terapeutiske effekter [J]. Chinese Journal of Andrology, 2008, 14 (11): 1046-1049.

[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun, et al. Effekt av Heshhouwu-avkok på testisvev hos aldrende rotter Påvirkningen av celle Rb/p53-signaltransduksjonsvei [J]. Anatomy Journal, 2010, 41(3): 435-439.

[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Effekt av refluksekstraksjon av Cistanche Phenylethanol Glucoside med forskning på etanolfaktor [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2009 (1): 250-251.

[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei, et al. Effekter av Cistanche Phenylethanol Glucoside på rotteserm Forskning på den beskyttende effekten av ekstern oksidativ skade [J]. Lishizhen Tradisjonell kinesisk medisin og Materia Medica, 2010, 21(9): 2205-2207.

[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong, etc. Anti-semen antistoffer på sperm mitokondriell funksjon Virkningen av [J]. Journal of Shantou University Medical College, 2008, 21(1): 4-6.

[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD, et al. Høy risiko for info Highdoseccyclophaphamiddeforsarcomaduringchildhood [J].Cancer, 2001, 91(3): 613-621.

[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, et al. Testikkelfunksjon og fruktbarhetsbevaring hos mallecancerpartier [J]. BestPect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.

[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. Cistanches evne til å motstå treningstrøtthet hos rotter og påvirkningen av frie radikaler i hjernen [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9592-9595.

[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian, et al. Fenyletanolglykosider i dyrket Cistanche-cistanche Ekstraksjons- og rensingsforskning [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2006, 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. Fremskritt innen farmakologisk forskning av fenoksyetanolglykosider Utstilling [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3): 440-441.

[15] ChangC, ChenYT, YehSD, et al. Infomedia våren TheandrogenreceptorinSertolicells [J]. ProcNatlAcadSci USA, 2004, 101 (18): 6876-6881.