Trombomodulin forbedrer transformerende vekstfaktor-b1-mediert kronisk nyresykdom via den G-proteinkoblede reseptor 15/Akt signalveien

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Uchida1 , Ryo Inoue6 , Shuangjie Qin 5, Liqi Val5 , Liq Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 og Esteban C. Gabazza2,9

1 Institutt for diabetes, metabolisme og endokrinologi, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 2 Institutt for immunologi, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 3 Institutt for lunge- og kritisk pleiemedisin, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 4 Institutt for gastroenterologi og hepatologi, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 5 Institutt for nevral regenerering og cellekommunikasjon, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 6 Sentralinstituttet for forsøksdyr, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japan; og 7 Nefrologisk avdeling, Taizhou sykehus, Wenzhou Medical University, Lihai, Zhejiang-provinsen, Folkerepublikken Kina.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Copyright ª 2020, International Society of Nephrology. Publisert av Elsevier Inc. Dette er en åpen artikkel under CC BY-NC-ND-lisensen (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Korrespondanse: Esteban C. Gabazza, Institutt for immunologi, Mie University School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japan. E-post: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; eller Yutaka Yano, Diabetes, Metabolism and Endocrinology, Mie University Graduate School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japan. E-post: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT og TY bidro like mye til dette arbeidet. 9 YY og EKG er co-senior forfattere. Mottatt 1. september 2019; revidert 24. april 2020; akseptert 7. mai 2020

SØKEORD: apoptose; Kronisk nyre sykdom; G-proteinkoblet reseptor; rekombinant humant trombomodulin; transformerende vekstfaktor-b1

Nyrefifibrose er den vanlige konsekvensen av kroniske nyresykdommer som ubønnhørlig utvikler seg til sluttstadiet av nyresykdom med organsvikt som kun kan behandles med erstatningsterapi. Siden transformerende vekstfaktor-b1 er hovedaktøren i patogenesen av nyrefifibrose, stilte vi hypotesen om at rekombinant trombomodulin kan forbedre transformerende vekstfaktor-b1-mediert progressiv nyrefifibrose og svikt. For å avhøre hypotesen vår genererte vi en ny glomerulus-spesifikk human transformerende vekstfaktor-b1 transgen mus for å evaluere den terapeutiske effekten av rekombinant trombomodulin. Denne transgene musen utviklet progressiv glomerulær sklerose og tubulointerstitiell fifibrose med nyresvikt. Terapi med rekombinant trombomodulin i fire uker inhiberte signifikant nyrefifibrose og forbedret organfunksjon sammenlignet med ubehandlede transgene mus. Behandling med rekombinant trombomodulin hemmet signifikant apoptose og mesenkymal differensiering av podocytter ved å interagere med den G-proteinkoblede reseptoren 15 for å aktivere Akt-signalveien og for å oppregulere ekspresjonen av anti-apoptotiske proteiner inkludert survivin. Derfor antyder vår studie sterkt den potensielle terapeutiske effekten av rekombinant trombomodulin for behandling avKronisk nyre sykdomog påfølgende organsvikt.

cistanchekanbehandle nyresykdomforbedre nyrefunksjonen

Oversettelseserklæring

Fibrose og dysfunksjon avnyrerer for tiden store helseproblemer over hele verden. Det er for tiden ingen antifibrotisk medisin godkjent for behandling av nyrefifibrose. Transformerende vekstfaktor-b1 er den viktigste og vanlige driveren for nyrefibrogenese ved kronisk nyresykdom forårsaket av mange lidelser. Vi fant her at rekombinant trombomodulin, et medikament godkjent i Japan for å behandle disseminert intravaskulær koagulasjon, undertrykker progresjonen av glomerulær sklerose, tubulointerstitiell fifibrose og nyresvikt forårsaket av overekspresjon av human transformerende vekstfaktor-b1, noe som antyder dens potensielle terapeutiske verdi for behandlingen avkroniske nyresykdommer.

Kronisk nyresykdomer et stort folkehelseproblem forbundet med høy sykelighet og dødelighet som rammer rundt 13 prosent av den voksne befolkningen i utviklede land.1 Verdens helseorganisasjon rapporterte atKronisk nyre sykdom(CKD) var årsaken til 1,5 prosent av dødsfallene på verdensbasis i 2012.1 Videre indikerer nyere epidemiologiske data en global jevn økning i antall pasienter med CKD.2,3 I de fleste tilfeller utvikler den patologiske prosessen seg gradvis, og fører til slutt til slutt- stadium nyresvikt, som kan behandles utelukkende med livslang dialyse eller nyretransplantasjon.4,5 Diabetes mellitus (DM) og arteriell hypertensjon er de hyppigste årsakene til CKD etterfulgt av iskemi, glomerulosklerose av ukjent etiologi, urologiske hindringer og kroniske infeksjoner.6 Uavhengig av den underliggende lidelsen, er den siste og vanlige patologiske konsekvensen av CKD fifibrose av nyrene.7 Renal fifibrose er avvikende helbredelse og remodellering av parenkymale strukturer i nyrene utsatt for langvarig eller gjentatt skade preget av tilstedeværelsen av tubulointerstitiell fifibrose, glomerulosklerose og tubulær atrofi.8 Hoveddriveren for nyrefifibrogenese er transformerende vekstfakta eller (TGF)-b1.8,9 TGFb1 kan fremme fifibrose ved å stimulere sekresjonen av ekstracellulære matriseproteiner og kjemotaktiske faktorer eller prolifererende faktorer av fibroblaster, ved å hemme metalloproteinaser og ved å fremme epitel-mesenkymal overgang.10 Bortsett fra å behandle den underliggende sykdommen , et godkjent medikament som spesifikt retter seg mot nyrefifibrose er foreløpig utilgjengelig.6

Trombomodulin (TM) er et transmembrant glykoprotein med flere biologiske funksjoner, inkludert modulering av koagulasjonssystemet, immunresponsen, inflammatoriske reaksjoner og celleoverlevelse.11 Den molekylære strukturen til TM inneholder et lektinlignende domene, 6 epidermale vekstfaktorlignende domener , et serin/treoninrikt domene, en transmembrandel og en cytoplasmatisk hale.12 Trombin, en prokoagulant faktor generert under aktivering av koagulasjonssystemet, blir en antikoagulerende og antifibrinolytisk faktor etter binding til TM.13 TM-trombinkomplekset øker generasjonen av aktivert protein C (APC), en antikoagulant med antiinflammatorisk og cytobeskyttende aktivitet, ved å aktivere protein C. I tillegg kan TM alene direkte nedregulere den inflammatoriske responsen ved å hemme aktiviteten til høymobilitetsgruppeprotein B-1 (HMGB1), ved å undertrykke immunogene dendrittiske celler, eosinofiler, mastceller og komplementsystemet.13–18

Det er publiserte resultater som viser forebyggende effekter av TM ved diabetisk renopati og iskemi-reperfusjonsnyreskade.19-21 Ingen studie har imidlertid vurdert effekten av rekombinant TM på progressiv nyrefifibrose indusert av TGFb1, en vanlig årsak til nyrefifibrose i flere sykdommer som forårsaker CKD. Vi stilte hypotesen om at TM kan lindre TGFb1-mediert nyrefifibrose og nyresvikt. For å avhøre denne hypotesen, evaluerte vi den terapeutiske effekten av rekombinant TM i en nyutviklet glomerulus-spesifikk TGFb1 transgen (TG) mus som utvikler progressivtnyrefifibrose og nyresvikt.

cistanche for nyre

RESULTATER

Økte sirkulerende TM-fragmenter korrelerer med nedsatt nyrefunksjon

TM, et endotelcellemembranbundet glykoprotein, spaltes i fragmenter og mister sine beskyttende funksjoner under endotelskade.22 Diabetisk nefropati er assosiert med endotelskade.23,24 Pasienter med DM med nefropati, sammenlignet med pasienter uten signifikant nefropati, viste signifikant nefropati. sirkulerende nivåer av TM (4,4 vs. 3,3 pg/ml) og aktiv TGFb1 (0.28 vs. 0.24 ng/ml) (tilleggstabell S1, tilleggsfigur S1A). TM er signifikant korrelert med kreatinin, aktiv TGFb1 og løselig podocin (tilleggsfigur S1B). Disse observasjonene antyder at et tap av funksjonell membranbundet TM er assosiert med økt frigjøring av aktiv TGFb1 og nyredysfunksjon.

TG-mus med et glomerulus-spesifikt uttrykk av humant TGFb1-gen i full lengde

Vi utviklet en TG-mus som overuttrykker det humane TGFb1-genet i full lengde i podocytter. Musen ble generert ved å plassere den humane TGFb1 under kontroll av podocin-promotoren på en bakteriell kunstig kromosom (BAC)-konstruksjon (tilleggsfigur S2; tilleggsfigur S3). Vi oppnådde 5 grunnleggermus som uttrykker 3 kopier og 3 grunnleggermus som uttrykker 1 kopi av det humane TGFb1-transgenet. Uttrykket av transgenet var nyrespesifikk, og avkommet til grunnleggerne var levedyktig (tilleggsfigur S3). Mus hadde fulltidsgraviditet og kullet var av normal størrelse. Mus ble født i det forventede Mendelske forholdet.

For å karakterisere TG-musene målte vi flerenyreparameterehver 4. uke i en periode på 16 uker (tilleggsfigur S4). Plasma- og urinkonsentrasjonene av TGFb1 ble signifikant økt i TGFb1- TG-musene sammenlignet med villtype (WT) mus fra tidlige uker etter fødselen og holdt seg deretter stabilt på et høyt nivå (Figur 1a). TGFb1-TG-mus viste en signifikant økning i nyrevevsinnholdet av hydroksyprolin ved 20uke (190.5 vs. 96.0 mg/nyre ), mesangial ekspansjon fra 4. uke (1,9 vs. 1,1 poengsum), og i kollagenavsetning fra 12. uke (0,9 prosent vs. 0,1 prosent ) etter fødsel sammenlignet med deres WT-motparter (Figur 1a–f) ). Konvensjonell optisk mikroskopi viste utvidelse av basalmembranen til Bowman-kapselen, fortykkelse av den glomerulære basalmembranen, økt kollagenavsetning i mesangiale og interstitielle rom og tubulær atrofi (Figur 1bd). Transmisjonselektronmikroskopi viste glomerulosklerose inkludert mikrovilløs transformasjon og fotprosessutsletting av podocytter, redusert glomerulær kapillær endotelfenestrasjon, fortykkelse av den glomerulære basalmembranen og økt mesangial matriseavsetning (figur 2a–i). Urinkonsentrasjonene av de tidlige markørene for nefropati Fettsyrebindende protein (185,1 vs. 87,0 pg/ml) ognyreskademolekyl 1 (441,9 vs. 256,9 pg/ml) ble signifikant forbedret i TGFb1-TG-mus fra henholdsvis 4. og 8. ukes alder, sammenlignet med deres alderstilpassede WT-mus (tilleggsfigur S5). Total proteinuri og det totale protein-kreatinin-forholdet i urin var signifikant økt ved 4., 8., 12., 16. og 2. 0. uke hos TGFb1-TG-mus sammenlignet med deres WT-motparter (Figur 3a) . Plasmanivået av ureanitrogen i blodet var signifikant forhøyet fra 4. uke (5,1 vs. 4,1 mg/dl) og konsentrasjonen av kreatinin fra 8. uke (1,1 vs. 0,4 mg/dl) i TGFb1-TG-mus sammenlignet med sine WT-kolleger (figur 3b).

rhTM hemmer glomerulosklerose og tubulointerstitiell fifibrose

Sammenlignet med TGFb{{0}}TG-mus behandlet med saltvann (SAL) og WT-mus behandlet med rekombinant human (RH) TM eller SAL, viste TGFb1-TG-mus behandlet med rytme signifikant redusert mesangial ekspansjon/cellularitet (1,3 vs. 3.{{30}}-score) og signifikant lav tubulointerstitiell kollagenavsetning og glomerulosklerose (121,3 prosent vs. 139,7 prosent) (Figur 4a–e). I samsvar med disse observasjonene, hydroksyprolininnholdet (11,7 vs. 19,9 mg/g), nyrevevskonsentrasjonene av kollagen I (101,3 vs. 196,7 ng/mg protein) og periostin (21,7 vs. 40,8 ng/ mg protein), og den relative mRNA-ekspresjonen av kollagen I ble signifikant redusert i nyrevev fra TGFb1-TG-mus behandlet med rhTM sammenlignet med nyrevev fra kontrollmus (figur 4f, tilleggstabeller S2 og S3). Transmisjonselektronmikroskopien viste en signifikant reduksjon av utsletting av podocytter og fortykkelse av glomerulær basalmembran hos mus behandlet med rhTM sammenlignet med mus behandlet med SAL alene (tilleggsfigur S6AB og B). I tillegg kommer nyrevevskonsentrasjonene av de profibrotiske cytokinene monocyttkjemoattraktant protein-1 (45,0 vs. 76,1 pg/mg protein), interleukin-13 (612,1 vs. 1002,0 pg/mg protein) og aktivt TGFb1 (131,0 vs. 151,5 pg/mg protein) ble signifikant redusert i TGFb1-TG-mus behandlet med rhTM sammenlignet med kontrollmus (tilleggsfigur S7). Nyrevevskonsentrasjonen av HMGB1 ble også signifikant redusert i nyrevev fra TGFb1-TG-mus behandlet med rhTM sammenlignet mednyrevevfra kontrollmus (tilleggsfigur S7). Plasmakonsentrasjonen av trombin-antitrombinkomplekset var signifikant økt i TGFb1-TG/SAL-gruppen sammenlignet med WT/SAL-gruppen, men ingen forskjell ble funnet mellom TGFb1-TG/rhTM- og WT/rhTM-gruppene (Supplerende figur S8A). Som forventet var det en høy konsentrasjon av TM i plasmaet til TGFb1-TG- og WT-mus behandlet med rhTM. Plasmakonsentrasjonen av APC/antitrypsin-komplekset ble signifikant redusert i TGFb1-TG/SAL-gruppen sammenlignet med WT/SAL- og TGFb1-TG/rhTM-gruppene (280,5 vs. 384,6 pg/ml) , og det var ingen signifikant forskjell i nivået av plasminogenaktivatorhemmer-1 (tilleggsfigur S8A). Nivåene av C5a i plasma, urin ognyrevev(630.1 vs. 1075,0 pg/mg protein) og plasmaløselig podocin ble signifikant redusert i TGFb1-TG-mus behandlet med rhTM sammenlignet med TGFb1-TG-mus behandlet med SAL (Supplerende figur S8B). Nivået av podocin i urin var høyere i TGFb1-TG/SAL-gruppen enn i WT/SAL- og TGFb1-TG/rhTM-gruppene (tilleggsfigur S9A–C).

Figur 1|Den menneskelige transformerende vekstfaktor b1 (TGFb1) transgene (TG) mus utvikler progressiv nyrefifibrose. (a) Konsentrasjonene av TGFb1-protein i plasma og urin ble målt ved enzymimmunanalyse og vevshydroksyprolininnholdet ved en kolorimetrisk analyse. (b–d) Snitt av nyrevev ble farget med (b) periodic acid–Schiff (stolper ¼ 20 mm) og med (c,d) Masson trikrom (stolper ¼ 10{{ 40}} mm) og deretter (e,f) kvantifisert ved hjelp av et poengsystem eller WinROOF-bildeprogramvaren (Mitani Corporation, Tokyo, Japan). Antall mus for nyrevevsevaluering: for villtype (WT) mus, n ¼ 4 ved 4, 12 og 20 uker; for TG-mus, n ¼ 7 ved 4 uker, n ¼ 8 ved 16 uker, og n ¼ 9 ved 20 uker gamle. Antall mus for plasma- og urinevaluering: for WT-mus, n ¼ 12 ved 4 uker, n ¼ 8 ved 8 uker, n ¼ 7 ved 12 uker, og n ¼ 4 ved 16 og 20 uker; for TG-mus, n ¼ 24 ved 4 uker, n ¼ 17 ved 8 og 12 uker, og n ¼ 9 ved 16 og 20 uker. Data er uttrykt som median interkvartilt område. Statistisk analyse av Mann-Whitney U-test. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p="">< 0,0001.="" ns,="" ikke="" vesentlig.="" for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

Figur 2|Transmisjonselektronmikroskopiske funn i den transformerende vekstfaktor b1-induserte nyrefifibrosemodellen. Fiksering, håndtering og fjerning av nyrene fra mus ble utført som beskrevet i metodene. (a,b) Mikrovilløs transformasjon og (a,b,d,e,g) utsletting av fotprosessen (hvite pilspisser) av podocytter, (c–e) redusert glomerulær kapillær endotelfenestrasjon (gule pilspisser), (f) fortykkelse av glomerulær basalmembran (stjerner), og (h,i) økt mesangial matriseavsetning (hvite piler) er tilstede. CL, kapillær lumen. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.kidney-international.org.

rhTM forbedrer nyrefunksjonen

Nivåene av L-fettsyrebindende protein (197.0 vs. 313,4 pg/ml),nyreskademolekyl1 (299,9 vs. 596,2 pg/ml), ureanitrogen i blod (12,9 vs 34,8 mg/dl), kreatinin (0,5 vs. 1,4 mg/dl), og albumin-kreatinin-forholdet ble signifikant redusert i TGFb1-TG-mus med renal fifibrose behandlet med rhTM sammenlignet med deres ubehandlede TG-motparter (figur 5). Totalproteinet i urinen og det totale proteinkreatininforholdet ble også redusert i TGFb1-TG-mus behandlet med rhTM sammenlignet med deres ubehandlede motparter (figur 5).

rhTM reduserer apoptose av glomerulære celler

Terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick-endemerkende farging viste et signifikant redusert antall apoptotiske celler i glomeruli fra TGFb1-TG-mus behandlet med rhTM sammenlignet med glomeruli fra TGFb1- TG-mus behandlet med SAL (Supplerende Figur S10A og B). Spaltning av caspase-3 ble også signifikant redusert i nyrevev fra TGFb1-TG-mus behandlet med rhTM sammenlignet med nyrevev fra TGFb1-TG-mus behandlet med SAL (tilleggsfigur S10C). Denyrevevfra TGFb1-TG-mus behandlet med rhTM, sammenlignet med de fra TGFb1-TG behandlet med SAL, viste signifikant økning i mRNA-nivåer av B-celle lymfom 2 (Bcl-2), B -cellelymfom-ekstra stort (Bcl-XL), en bakuloviral hemmer av apoptose-repetisjon som inneholder 5 (BIRC5, også kjent som survivin), og BIRC6 (Apollon) med økt Bcl-2-Bax-forhold (tilleggsfigur S11) ).

Figur 3|Den humane transformerende vekstfaktor b1 (TGFb1) transgene (TG) mus har nyredysfunksjon. (a) Totalt protein og (b) blod urea nitrogen (BUN) ble målt ved kolorimetriske metoder og kreatinin ved en enzymatisk metode. Antall mus for plasma- og urinevaluering: for villtype (WT) mus, n ¼ 12 ved 4 uker, n=7 ved 8 og 12 uker, og n=4 ved 16 og 2{ {21}} uker; for TG-mus, n =24 ved 4 uker, n=17 ved 8 og 12 uker, og n=9 ved 16 og 20 uker. Data er uttrykt som median ± interkvartilt område. Statistisk analyse av Mann-Whitney U-test. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ****="" p=""><>

rhTM hemmer apoptose av podocytter

Forbehandling av podocytter med rhTM reduserte signifikant apoptose av podocytter dyrket i nærvær av TGFb1, vurdert ved antall celler i subG1-fasen (3,2 prosent vs. 5,2 prosent), terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick-ende-merking (–positiv 1.0 vs. 5.4 celler/Fifield) og graden av caspase-3-spalting (0.9 vs. 1.1-forhold) (Figur 6a–e). Screening av antiapoptotiske faktorer i dyrkede podocytter viste at rhTM signifikant øker mRNA-ekspresjonen av den antiapoptotiske faktoren Bcl-2 sammenlignet med ekspresjon i ubehandlede celler (tilleggsfigur S12). mRNA-ekspresjonen av den antiapoptotiske faktoren BIRC5 økte også i celler behandlet med rhTM sammenlignet med uttrykk i ubehandlede celler (tilleggsfigur S12). mRNA-ekspresjonen av den proapoptotiske faktoren Bax ble betydelig redusert ved rhTM-behandling sammenlignet med ingen behandling (tilleggsfigur S12). Behandling med rhTM hemmet også uttrykket av annexin V og terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick-endemerkende farging signifikant i podocytter dyrket i nærvær av hydrogenperoksid (tilleggsfigur S13A–E) og under høy glukosetilstand (tilleggsfigur S14A–E) ) som ytterligere bekrefter den antiapoptotiske egenskapen til rhTM på podocytter. Utforskning av den antiapoptotiske proteinkinase B (Akt)-banen25 viste at rhTM forbedret fosforyleringen av Akt i humane primære podocytter dyrket i nærvær av hydrogenperoksid eller TGFb1 (tilleggsfigur S15A og B). Vi isolerte deretter podocytter fra hver gruppe mus og evaluerte Akt-fosforylering ved Western blotting. Det var signifikant forbedret fosforylering av Akt i podocytter isolert fra TGFb{{30}}TG/rhTM-gruppen sammenlignet med podocytter fra den ubehandlede gruppen (1,1 vs. 0,7 forhold) (tilleggsfigur S16A og B).

GPR15 formidling

Tidligere studier rapporterte at TM aktiverer intracellulære veier ved å interagere med fibroblastvekstfaktorreseptor 1 (FGFR1) ogG-proteinkoblet reseptor15 (GPR15).26,27 Podocytter uttrykker FGFR128, men om de uttrykker GPR15 er uklart. Her isolerte vi podocytter fra hver gruppe mus og viste at podocytter også uttrykker GPR15 (tilleggsfigur S17A–E). Vi fant at podocytter fra frisk kontroll og en pasient med glomerulosklerose også uttrykker GPR15 (tilleggsfigur S18). For å avklare om FGFR1 eller GPR15 medierer den rhTM-hemmende aktiviteten på apoptose av podocytter, evaluerte vi den antiapoptotiske aktiviteten til rhTM i TGFb1-behandlede podocytter i nærvær av FGFR1-hemmer eller etter transfeksjon av cellene med lite interfererende RNA (siRNA) mot FGFR1 eller GPR15. Forbehandling av podocytter med FGFR1-hemmer (tilleggsfigur S19A og B) eller FGFR1 siRNA (13,2 prosent vs. 7,9 prosent) (figur 7a og b) klarte ikke å oppheve den hemmende aktiviteten til rhTM ved apoptose av podocytter. Imidlertid opphevet transfeksjon av celler med GPR15 siRNA fullstendig den hemmende aktiviteten til rhTM (14,6 prosent vs. 13,8 prosent) påapoptose av podocytter(Figur 7a–c).

Figur 4|Rekombinant humant trombomodulin (rhTM) hemmer glomerulosklerose og tubulointerstitiell fifibrose. Seksjoner av nyrevev ble farget (a,b) med periodic acid–Schiff og (c,d) med Masson trichrome og (e) deretter kvantifisert ved hjelp av et skåringssystem eller WinROOF-bildeprogramvaren. (e) Gjennomsnittsverdien for villtype (WT)/saltvannsgruppen (SAL) ble tatt som 100 prosent. Statistisk analyse av Mann-Whitney U-test. (f) Hydroksyprolininnholdet i vevet ble målt ved en kolorimetrisk metode, konsentrasjon av kollagen I-a1 (Col1a1) og periostin ved enzymimmunoassay, og mRNA-ekspresjon ved omvendt transkriptase-polymerasekjedereaksjon. Statistisk analyse av Kruskal Wallis variansanalyse og korrigert Dunn-test. n=8 i hver gruppe. Stolper {{10}} (a,c) 50 mm og (d) 20 mm. Data er uttrykt som median ± interkvartilt område. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" tg,="" transgen;="" tgfb1,="" transformerende="" vekstfaktor="" b1.="" for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

rhTM hemmer EMT av podocytter

Det var et signifikant økt område med positiv farging for podocin og a-glattmuskelaktin (a-SMA) (1,4 prosent vs. 11,2 prosent) hos TGFb1-TG/SAL-mus sammenlignet med TGFb1-TG / rhTM mus (Figur 8a og b). Vi dyrket deretter in vitro primære humane podocytter, forbehandlet med rhTM før vi tilsatte TGFb1-protein til kulturmediet. Den fibroblastlignende morfologien og det forbedrede uttrykket av a-SMA ble undertrykt i podocytter behandlet med rhTM sammenlignet med ubehandlede celler (tilleggsfigur S20A). I tillegg hemmet rhTM mRNA-ekspresjonen av fibronektin og vimentin, selv om det forbedret mRNA-ekspresjonen av E-cadherin i podocytter sammenlignet med ekspresjon i ubehandlede celler (tilleggsfigur S20B). SMAD-familiemedlemmer 2 (Smad2) og Smad3 spiller en kritisk rolle i TGFb1-mediert epitel-mesenkymal overgang (EMT).29 Behandling med rhTM undertrykte aktiveringen av Smad2 og Smad3 i TGFb1-TG-mus signifikant. sammenlignet med ubehandlede TG-mus (Figur 8c) og i humane podocytter dyrket i nærvær av TGFb1 (Supplerende Figur S20C).29 TG-mus behandlet med rhTM (TGFb1-TG/rhTM) viser også mindre ekspresjon av a-SMA (3,7 prosent vs. 17,2 prosent) i tubulære epitelceller sammenlignet med deres ubehandlede motparter (tilleggsfigur S21A og B).

Figur 5|Rekombinant humant trombomodulin (rhTM) forbedrer nyreskade og nedsatt nyrefunksjon. Kreatinin ble målt ved en enzymatisk metode; totalt protein ved kolorimetrisk metode; og blodureanitrogen (BUN) og albumin, nyreskademolekyl 1 (KIM-1), L-fettsyrebindende protein (L-FABP) og total transformerende vekstfaktor b1 (TGFb1) ved enzymimmunanalyse. n=8 i hver gruppe. Data er uttrykt som median±interkvartilt område. Statistisk analyse ved Kruskal-Wallis variansanalyse og ukorrigert Dunn-test. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" ikke="" signifikant;="" sal,="" saltvann;="" tg,="" transgen;="" wt,="">

GPR15 medierer den hemmende aktiviteten til rhTM på EMT

Transfeksjon av podocytter med FGFR1 siRNA klarte ikke å oppheve den hemmende aktiviteten til rhTM på de relative mRNA-uttrykkene av både kollagen I-a1 og a-SMA i TGFb1--behandlede podocytter (tilleggsfigur S22). Transfeksjon av celler med GPR15 siRNA opphevet imidlertid signifikant den hemmende aktiviteten til rhTM på de relative mRNA-uttrykkene av både kollagen I-a1 og a-SMA i TGFb{10}}behandlede podocytter (tilleggsfigur S22).

DISKUSJON

TGFb1 og skade på glomerulære celler

Den vanlige konsekvensen av lidelser som forårsaker CKD er nyrefifibrose.8,30,31 TGFb1 er den vanlige driveren for fibrogenese i nyrene assosiert med CKD forårsaket av sykdommer inkludert DM, arteriell hypertensjon og autoimmune lidelser.10 Celler fra glomerulus og tubulointerstitielle rom kan skille ut de latente formene av TGFb1 som, når de aktiveres for mye under vevsskade, kan føre til nyrearrdannelse.32 Ettersom TGFb1 kan stimulere sin egen sekresjon, blir den fibrotiske prosessen generelt en ond sirkel.8 En tidlig hendelse i den patogene prosessen til TGFb. 1- mediertenyre fifibroseer en skade på podocytter og glomerulære endotelceller.33–35 Plasmanivået av løselig TM er en markør for endotelskade. I samsvar med rollen til TGFb1 i nyrecelleskade fant vi her en signifikant korrelasjon av aktiv TGFb1 med løselig TM, løselig podocin og kreatinin i plasma fra pasienter med DM. Krysstale mellom glomerulære endotelceller og podocytter under anyreskadefører til et lokalt uttrykk av proteaser som forårsaker nedbrytning av glomerulær basalmembran.34–36 Dette kan forklare påvisningen av løselig podocin og dets signifikante korrelasjon med løselig TM hos våre pasienter med DM.

Figur 6|Rekombinant humant trombomodulin (rhTM) undertrykker apoptose av podocytter indusert av transformerende vekstfaktor b1 (TGFb1). (a) rhTM ble tilsatt til kulturmediet til podocytter 1 time før indusering av apoptose med 1 0 ng/ml TGFb1 i 48 timer. (b) Prosentandelen av celler i subG1-fasen ble påvist ved hjelp av andre cytometri. (a,b) n=3 i hver gruppe. (c,d) Antall celler med DNA-fragmentering ble målt ved terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick end-labeling (TUNEL) analyse (n=3 i saltvann [SAL]/SAL og rhTM/SAL grupper; n=6 i SAL/TGFb1- og rhTM/TGFb1-grupper), og (e) graden av caspase-3-spalting ble målt ved Western blotting (n=4 i hver gruppe). Stolper=100 mm. Data er uttrykt som median ± interkvartilt område. Statistisk analyse av Mann-Whitney U-test. *P < 0,05.="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-fenylindol;="" hpf,="" kraftig="" felt;="" ns,="" ikke="" vesentlig.="" histogrammer="" vises="" som="" prosent="" maks="" (prosent="" av="" maksimal="" verdi),="" og="" skalerer="" hver="" kurve="" til="" modus="100" prosent="" .="" for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

Podocyttspesifikk human TGFb1-overekspresjonsassosiert nyrefifibrose

Et medikament som kan motvirke effekten av TGFb1 vil være ideelt for å blokkere nyrefifibrose. Her har vi generert en TG-mus som overuttrykker det humane TGFb1-genet i glomerulus som utvikler spontan og progressiv glomerulær sklerose og tubulointerstitiell fifibrose med nyresvikt så tidlig som 4 uker etter fødselen. Modellen viser avansert glomerulopati med skade av podocytter og glomerulære endotelceller; glomerulær basalmembran fortykkelse og mesangial ekspansjon med interstitiell arrdannelse; økte markører for nyrevevsskade og nedsatt nyrefunksjon; og økt TGFb1 i plasma,nyrevevog urin. Økningen i urinutskillelse av proteiner, TGFb1, og aktivering av komplementsystemet kan forklare den samtidige utviklingen av interstitiell arrdannelse i vår nåværende modell.37–40 Ytterligere eksperimenter avslørte økte apoptotiske celler og aktivering av Smad-proteiner i nyrevev fra ubehandlet TGFb{ {3}}TG-mus sammenlignet med WT-mus. Samlet sett peker disse funnene på denne nye TGFb1-TG-musen som en passende modell for medikamentoppdagelse inyre fifibrose.

Figur 7|G-proteinkoblet reseptor (GPR15) medierer hemming av apoptose rekombinant humant trombomodulin (rhTM) i podocytter. Humane primære podocyttceller ble transfektert med fibroblastvekstfaktorreseptor 1 (FGFR1) lite interfererende RNA (siRNA), GPR15 siRNA eller kryptert siRNA i 48 timer, og deretter ble rhTM tilsatt cellekulturen 1 time før behandling med transformerende vekstfaktor b1 (TGFb1). Apoptotiske celler ble (a) vurdert ved hjelp av andre cytometri og (b) deretter kvantifisert. (c) Cellelysater ble fremstilt for Western blotting. n{{10}} i hver gruppe. Data er uttrykt som median ± interkvartilt område. Statistisk analyse av Mann-Whitney U-test. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="">

Figur 8|Hemming av epitel-mesenkymal overgang av rekombinant humant trombomodulin (rhTM). (a) Podocin og a-glattmuskelaktin (a-SMA) ble farget som beskrevet i metodene. (b) Området som er positivt for a-SMA-farging ble kvantifisert av WinROOF-bildebehandlingsprogramvaren. n=3 i villtype (WT)/saltvann (SAL) og WT/rhTM grupper og n=5 itransformerende vekstfaktor-b1-transgen(TGFb{{0}}TG)/SAL- og TGFb1-TG/rhTM-grupper. (c) Totale (t) og fosforylerte (p) SMAD familiemedlem (Smad) proteiner ble evaluert ved Western blotting. n=8 i hver gruppe. Data er uttrykt som median ± interkvartilt område. Statistisk analyse ved Kruskal-Wallis variansanalyse og korrigert Dunn-test. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0.08." for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

rhTM forbedrer nyrefifibrose

Vi har vist at rhTM forbedrer lungefifibrose utviklet hos mus som overuttrykker human TGFb1 i lungene ved å undertrykke alveolær epitelcelle-apoptose.41 Kliniske studier har også vist bedring av idiopatisk lungefifibrose etter rhTM-behandlingen av disse tidligere observasjonene.424. for organfifibrosebehandling. Vi antok at rhTM ville være effektiv i TGFb1- assosiert nyrefifibrose. For å teste denne hypotesen behandlet vi nyrespesifikke TGFb1-TG-mus med rhTM.44 Administrering av rhTM i 4 uker, signifikant svekket skade, dysfunksjon og fifibrose i nyrene. Mus behandlet med rhTM viste lave urinnivåer av totalt protein, albumin, TGFb1, C5a og reduserte nyrenivåer av profibrotiske cytokiner, C5a og HMGB1.45 Terapi med rhTM hemmet også både apoptose og EMT av podocytter. Imidlertid utøvde rhTM ingen effekt på trombin-antitrombinkomplekset, en koagulasjonsaktiveringsmarkør, selv om det økte generasjonen av APC, en antikoagulerende faktor med antiinflammatorisk og anti-apoptotisk aktivitet.23 Det er verdt å merke seg at trombin, det prokoagulerende enzymet, kan fremmer paradoksalt nok antikoagulasjon under lavgradige protrombotiske tilstander ved å danne TM/trombinkomplekset, som øker dannelsen av antikoagulanten APC. Trombin fungerer imidlertid hovedsakelig som en prokoagulant under overdreven protrombotiske tilstander (f.eks. sepsis).46 Denne doble og paradoksale effekten av trombin kan forklare den tilsynelatende ineffektiviteten til rhTM for å hemme koagulasjonsaktivering i vår modell, som er i en lavgradig protrombotisk tilstand . Totalt sett tyder disse observasjonene på at rhTM forbedrer progressiv fifibrose og dysfunksjon avnyrerved å forlenge overlevelsen av eller forhindre EMT av glomerulære celler og ved å undertrykke betennelse, komplementaktivering og vekstfaktoraktivitet direkte eller indirekte via aktivering av protein C-veien og reduksjon av HMGB1-ekspresjon. Forbedring av diabetisk nefropati hos mus med økt sirkulerende TM lektinlignende domene og sykdomsforverring hos mus som mangler det lektinlignende domenet støtter den gunstige effekten av rhTM på nyrefifibrose.20,21

Hemming av podocytt-apoptose

Podocytter spiller kritiske roller i vedlikeholdet av den glomerulære filtrasjonsbarrieren og dannelsen av spaltemembranen for å forhindre tap av essensielle sirkulerende proteiner.47Nyreskadeforårsaket av reaktive oksygenarter, høy glukose eller inflammatoriske mediatorer inkludert TGFb1 induserer apoptose av podocytter som fører til podocyttutarming som til slutt kan ende opp med å forårsake nyredysfunksjon.47 Etter binding og aktivering av serin/treoninkinase transmembrane heteromere type I- og type II-reseptorkomplekser , sender TGFb1 ut intracellulære signaler gjennom Smad-familien av transkripsjonsfaktorer eller gjennom Smad-uavhengige signalveier.48 Aktivering av den Smad-avhengige veien skjer når aktiverte TGFb1-reseptorer fosforylerer Smad2 og Smad3, som med Smad4 translokerer til kjernen.49 Smad2/ Smad3/Smad4-komplekset stimulerer transkripsjonen av proapoptotiske faktorer og reduserer transkripsjonen av antiapoptotiske faktorer som fører til celleapoptose.49 I samsvar med dette fant vi det høye nyrenivået av den proapoptotiske faktoren Bax og et lavt nivå av de antiapoptotiske faktorene Bcl2 og Bcl-XL i TGFb1- TG-mus. TM kan hemme apoptose av forskjellige celletyper.21,41,49 I samsvar med dette fant vi her at rhTM hemmer apoptose av podocytter indusert av hydrogenperoksid, høy glukose eller TGFb1, og dette funnet kan forklare den gunstige effekten av rhTM ved CKD . I tillegg vippet rhTM balansen mot hemming av apoptose ved å redusere uttrykket av Bax, ved å øke uttrykket av Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 og BIRC6, og ved å øke aktiveringen av Akt-banen inyrevev. Totalt sett antyder disse observasjonene at rhTM stimulerer podocyttoverlevelse ved å favorisere Akt-aktivering og antiapoptotisk faktorekspresjon.

cistanche for kronisk nyresykdom

Hemming av EMT

EMT av podocytter bidrar også til nyrefifibrose. Podocytter som gjennomgår EMT frigjør ekstracellulære matriseproteiner som akkumuleres og avsettes under TGFb1-assosiert renal fifibrogenese.50 TGFb1 fremmer EMT gjennom reseptormediert aktivering av Smad2/Smad3/Smad4-komplekset. Fosforylert Smad3 fremmer EMT ved å stimulere transkripsjonen av matriseproteiner og ved å redusere ekspresjonen av epitelmarkører.51 I samsvar med dette fant vi økt EMT av podocytter i TGFb1-TG-mus og podocytter dyrket i nærvær av TGFb1 eller under oksiderende eller høye glukoseforhold. Tidligere rapporter antydet at rhTM undertrykker EMT.52,53 Her fant vi at rhTM hemmer EMT av podocytter og tubulointerstitielle epitelceller i TGFb1-TG-mus. Hemming av Smad-proteinaktivering ser ut til å være mekanismen for den gunstige effekten av rhTM på EMT fordi TGFb1-TG-mus og primære podocytter behandlet med rhTM viste signifikant redusert fosforylering av Smad2 og Smad3 sammenlignet med ubehandlede tilstander. Disse funnene støtter den hemmende aktiviteten til TM på EMT.

Reseptormediering i rhTM beskyttende aktivitet

Tidligere studier har vist at GPR15 eller FGFR1 medierer den cytobeskyttende aktiviteten til TM.26,27,54. Vi testet om disse reseptorene medierer den beskyttende aktiviteten til rhTM mot apoptose og EMT. Mens nedregulering av GPR15-protein av siRNA fullstendig opphevet den undertrykkende aktiviteten til rhTM på TGFb1-mediert apoptose av podocytter, opphevet verken FGFR1 siRNA eller dets hemmer det, noe som tyder på at GPR15 medierer den beskyttende rhTM-aktiviteten. Det var forbedret fosforylering av Akt i dyrkede podocytter og podocytter isolert fra TGFb1-TG-mus etter behandling med rhTM, noe som tyder på involvering av den intracellulære Akt-veien. Et arbeid som viser at rhTM aktiverer Akt-banen i endotelceller støtter dette funnet.55 Aktivering av Akt-signalveien kan potensere rhTM-effekten ytterligere ved å øke GPR15-overflateuttrykket.56 Disse observasjonene indikerer at rhTM beskytter podocytter mot apoptose i vår TGFb{ {13}}TG-mus ved å aktivere GPR15/Akt-aksen som fører til økt ekspresjon av anti-apoptotiske faktorer og redusert ekspresjon av proapoptotiske faktorer.57 På den annen side har tidligere studier vist at anafylatoksinene C3a og C5a gjennom deres GPR kan bidra til CKD ved å skade podocytter og at APC kan hemme podocyttapoptose og nyrefifibrose via dens endotelprotein C-reseptor og proteaseaktiverte reseptor 1.23,58–61 Her fant vi at rhTM hemmer komplementsystemet og øker generasjonen av APC. Derfor, bortsett fra aktiveringen av GPR15/Akt-veien, kan hemming av komplementfaktorer og økt aktivering av protein C og dets reseptorer også forklare de fordelaktige effektene av rhTM i vår TGFb1-assosiertenyre fifibrose modell.

I tillegg blokkerte nedregulering av GPR15, men ikke av FGFR1, den hemmende effekten av rhTM på EMT, noe som tyder på at GPR15 også medierer denne rhTM-beskyttende aktiviteten. Hemming av Smad-proteiner er involvert i EMT-undertrykkelse fordi behandling med rhTM hemmet fosforyleringen av både Smad2 og Smad3 i TGFb1-TG-mus og dyrkede podocytter. Imidlertid er den nøyaktige mekanismen for Smad-proteinhemming via GPR15 uklar. Noen bevis viser at Akt-banen kan krysstale med og regulere Smad-signalveien,62–64 og at Akt kan forhindre fosforylering av Smad3 ved å interagere direkte med ufosforylert Smad3 for å sekvestrere den utenfor kjernen, noe som fører til hemming av transkripsjon og EMT.62– 64 Basert på disse rapportene kan det tenkes at Akt ble aktivert etter rhTM-binding til GPR15-sekvestrerer ufosforylert Smad3 som fører til podocytt-EMT-hemming. Det er verdt å merke seg at denne Akt-medierte gunstige effekten bare observeres i ikke-maligne celler.65–67 I ondartede celler kan interaksjonen av TGFb1 med reseptorene direkte aktivere fosfoinositidet 3-kinase/Akt/snegleveien og forårsake EMT.65–67 Samlet sett støtter resultatene av vår studie rollen til GPR15 som reseptoren som medierer de gunstige effektene av rhTM på podocytter.

Konklusjon

Oppsummert, her rapporterer vi for første gang en ny transgen TG-mus som overuttrykker full lengde av humant TGFb1-gen spesifikt i glomeruli som utvikler spontan og progressiv glomerulær sklerose, tubulointerstitiell fifibrose ognyresvikt, og forbedring av etablert nyrefifibrose/nyresvikt ved rhTM-interaksjon med GPR15 som hemmer apoptose og mesenkymal overgang av podocytter.

METODER

Generering av TGFb1 BAC TG mus

TGFb1-BAC-TG-mus som uttrykker det humane TGFb1-genet i full lengde under muse-podocin-promoterkontrollen ble generert ved pronukleær injeksjon i 392 C57BL/6J-museembryoer (CLEA Japan, Inc., Tokyo, Japan). Vi vurderte TG-grunnleggerne og kimlinjeoverføring av BAC TG-konstruksjonen ved Southern blotting (tilleggsmaterialer og metoder).

Forsøksdyr

TGFb1-TG-musene ble avlet i mer enn 10 generasjoner under C57BL/6-bakgrunn før de ble brukt i eksperimentene. WT-kullkamerater ble brukt som kontrolldyr. Alle dyrene ble holdt i et spesifikt patogenfritt miljø og utsatt for en 12-times lys-mørke-syklus ved en omgivelsestemperatur og luftfuktighet mellom 22 grader og 26 grader og 40 prosent og 70 prosent, og med ad libitum tilgang til mat og vann i dyrehuset til Mie Universitet (Supplerende materialer og metoder).

Etisk utsagn

Sikkerhetskomiteen for rekombinant DNA-eksperiment (godkjenningsnr. I-629; dato: 19. september 2013) og komiteen for dyreundersøkelser ved Mie University (godkjenningsnr. 27-4; dato: 19. august 2015) godkjent studieprotokollene. Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjene til Mie University og etter de internasjonalt godkjente prinsippene for forsøksdyrpleie publisert av National Institute of Health (https://olaw.nih.gov/).

For den kliniske undersøkelsen ble det gitt skriftlig informert samtykke fra alle pasienter og friske forsøkspersoner, og studieprotokollen ble godkjent av Etikkkomiteen for klinisk undersøkelse ved Mie University (godkjenningsnr. 1043 og 2194).

Eksperimentelt design

For karakterisering avnyrefifibrosis-modellen, tildelte vi TGFb{{0}}TG-hannmus (n=24) og WT-hannmus (n=12) 4 uker gamle og veier 20 til 23 g til 3 grupper med 8 TGF b1-TG-mus og 4 WT-mus i hver gruppe. Mus fra hver WT- og TGFb1-TG-gruppe ble avlivet i uke 0, 8 eller 16 for å samle prøver av urin, blod og nyre for å vurdere endringer i fifibrose og nyrefunksjonsparametere over tid.

For å evaluere den terapeutiske effektiviteten til rhTM (rhTM ble vennlig levert av Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokyo, Japan) i nyrefifibrose, TGFb1-TG-mus (n= 8) eller WT-kullkamerater (n {{2 }}) ble behandlet med rhTM (3 mg/kg) ved ip-injeksjon, 3 ganger i uken i løpet av de 4 ukene før musene ble drept. TGFb1-TG-mus (n =8) eller WT-kullkamerater (n= 8) ​​som mottok en lik mengde fysiologisk SAL ved ip-injeksjon ble brukt som negative kontrollmus.

Protokollen for denne studien fulgte retningslinjene for dyreforskning: rapportering av in vivo-eksperimenter (ARRIVE). Mus ble randomisert, og forskere som målte parametere ble blindet for behandlingsgrupper.

Biokjemisk analyse

Konsentrasjonene av totalt protein (BCA-proteinanalysesett; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), monocyttkjemoattraktant protein-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), trombinantitrombinkompleks (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada) ble målt ved bruk av kommersielle enzymimmunoassay-sett etter produsentens instruksjoner (Supplerende materialer og metoder).

Cellekultur

De humane podocytt-primære cellene ble kjøpt fra CELPR OGEN (Torrance, CA). Humane podocytt-primære celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium i en fuktet, 5 prosent CO2-atmosfære ved 37 grader. Mediet ble supplert med 10 prosent varmeinaktivert føtalt bovint serum (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 IE/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin og L-glutamin (tilleggsmaterialer og metoder).

Statistisk analyse

Data er uttrykt som median±interkvartilt område. Den statistiske forskjellen mellom variablene ble beregnet ved Kruskal-Wallis variansanalyse med post hoc analyse ved bruk av Dunn-testen. Mann-Whitney U-test ble brukt til å evaluere forskjeller mellom 2 grupper. Statistiske analyser ble gjort ved å bruke GraphPad Prism versjon 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Statistisk signifikans ble ansett som P <>

FORMIDLING

EKG, CND-G og YY har patent på TGFb1-TG-musen mednyre fifibrosebrukt i denne studien. CND-G og YY mottok et stipend fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan for denne studien. EKG, TY, CND-G og MT mottok et tilskudd fra Shionogi Pharmaceuticals. Alle de andre forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.

TAKK

Denne forskningen ble delvis støttet av tilskudd fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (Kakenhi nr. 17K09824 for YY; Kakenhi nr. 17K08442 for CND-G), og delvis av et tilskudd fra Shionogi & Co, Ltd., Japan. Finansierne hadde ingen rolle i studiedesign, dataanalyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

En del av dette arbeidet ble publisert i abstrakt form.

FORFATTERBIDRAG

AT utarbeidet sykdomsmodellen og skrev det første utkastet til manuskriptet. TY, KN, TT, RI og CND-G forberedte sykdomsmodellene og målte parametere. AM og SW utførte den mikroskopiske overføringsstudien. MT, YO og AU målte parametere og utførte in vitro-eksperimentene. YT, LQ, TK og VFD ga intellektuelle bidrag. YY og EKG korrigerte manuskriptutkastet og designet studien.

cistanche for symptomer på nyresvikt

TILLEGGSMATERIALE

Supplerende fil (PDF) Supplerende materialer og metoder.

Tabell S1. Fagenes kjennetegn.

Tabell S2. Primere for RT-PCR av musevev.

Tabell S3. Primere for RT-PCR av humane podocytter.

Figur S1. Løselige trombomodulinfragmenter korrelerer med TGFb1 og kreatinin hos pasienter med DM.

Figur S2. Human TGFb1-bakteriell kunstig kromosom (BAC) konstruksjon. Figur S3. Grunnleggermus som uttrykker full lengde av humant TGFb1-gen.

Figur S4. Karakterisering av den glomerulus-spesifikke transformerende vekstfaktor b1 transgene mus.

Figur S5. Den humane TGFb1-transgene musen har økte markører for nyreskade.

Figur S6. Terapi med rekombinant humant trombomodulin (rhTM) reduserer fotprosessens utsletting av podocytter og fortykkelse av den glomerulære basalmembranen.

Figur S7. TGFb1 transgene mus behandlet med rekombinant humant trombomodulin (rhTM) har en lav konsentrasjon av profibrotiske faktorer og HMGB1 i nyrevev. Figur S8. Terapi med rekombinant humant trombomodulin (rhTM) øker genereringen av aktivert protein C, hemmer komplementsystemet, reduserer sirkulerende løselig podocin, selv om det ikke har noen effekt på koagulasjonssystemet i TGFb1 transgene mus.

Figur S9. Terapi med rekombinant humant trombomodulin (rhTM) reduserer urinkonsentrasjonen av podocin.

Figur S10. Terapi med rekombinant humant trombomodulin (rhTM) reduserer apoptose av glomerulære celler.

Figur S11. Behandling av TGFb1-overekspresjonsassosiert nyrefifibrose med rekombinant humant trombomodulin (rhTM) hemmer apoptose i nyrevev.

Figur S12. Rekombinant humant trombomodulin (rhTM) øker ekspresjonen av antiapoptotiske faktorer i podocytter.

Figur S13. Rekombinant humant trombomodulin (rhTM) undertrykker apoptose av podocytter indusert av hydrogenperoksid.

Figur S14. Rekombinant humant trombomodulin (rhTM) undertrykker apoptose av podocytter indusert av høye glukosenivåer.

Figur S15. Rekombinant humant trombomodulin (rhTM) øker aktiveringen av Akt-banene i podocytter.

Figur S16. Terapi med rekombinant humant trombomodulin (rhTM) øker Akt-fosforylering i podocytter fra TGFb1-TG-mus.

Figur S17. Podocytter fra hver behandlingsgruppe av mus uttrykker GPR15 mRNA.

Figur S18. Farging av GPR15 i podocytter fra et friskt individ og en pasient med fokal segmentell glomerulosklerose.

Figur S19. Fibroblastvekstfaktorreseptor-1 er ikke involvert i den hemmende aktiviteten til rekombinant humant trombomodulin (rhTM) i podocytter.

Figur S20. Rekombinant humant trombomodulin (rhTM) hemmer den epiteliale-mesenkymale overgangen til podocytter.

Figur S21. Terapi med rekombinant humant trombomodulin (rhTM) hemmer ekspresjonen av a-glattmuskelaktin i nyretubuli.

Figur S22. G-proteinkoblet reseptor (GPR15) medierer den hemmende aktiviteten til rekombinant humant trombomodulin (rhTM) på den epiteliale-mesenkymale overgangen til podocytter.

Supplerende referanser.

REFERANSER

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Kronisk nyre sykdom. Lancet. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, et al. Vurdering av global nyrehelsestatus. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, et al. Global nyrehelse 2017 og utover: et veikart for å lukke hull i omsorg, forskning og politikk. Lancet. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Prevalens, påvisning, evaluering og behandling av kronisk nyresykdom. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Behandling av kronisk nyresykdom. Nyre Int. 2012;81:351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. Den neste generasjonen av terapeutika for kronisk nyresykdom. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Renal fifibrose: ny innsikt i patogenesen og terapeutikken. Nyre Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. Cellulære og molekylære mekanismer for nyrefifibrose. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. Å begrense endotelial TGF-beta-signalering er tilstrekkelig for å redusere endotel-mesenkymal overgang og fifibrose ved CKD. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et al. TGF-beta1/p53-signalering i nyrefifibrogenese. Cellesignal. 2018;43:1–10.

11. Conway EM. Trombomodulin og dets rolle i betennelse. Semin Immunopathol. 2012;34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Trombomodulin og det vaskulære endotelet: innsikt i funksjonelle, regulatoriske og terapeutiske aspekter. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. Thrombomodulin kobler koagulasjon til betennelse og immunitet. Curr Drug Targets. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Trombomodulin hemmer aktiveringen av eosinofiler og mastceller. Cell Immunol. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. Hemming av allergisk bronkial astma av trombomodulin formidles av dendrittiske celler. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Doble modulerende funksjoner av trombomodulin i den alternative komplementveien. Biosci-trender. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Trombomodulin modulerer dendrittiske celler via både antagonismer av høymobilitetsgruppeprotein B1 og en uavhengig mekanisme. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Det lektinlignende domenet til trombomodulin forstyrrer komplementaktivering og beskytter mot leddgikt. J Thromb Haemost. 2006;4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, et al. Løselig trombomodulin beskytter iskemiske nyrer. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, et al. Det lektinlignende domenet til trombomodulin forbedrer diabetisk glomerulopati via komplementhemming. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL, et al. Trombomodulindomene 1 forbedrer diabetisk nefropati hos mus via anti-NF-kappaB/NLRP3 inflammasommediert betennelse, forbedring av NRF2 antioksidantaktivitet og hemming av apoptose. Diabetologia. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Løselig trombomodulinaktivitet og løselig trombomodulinantigen i plasma. J Thromb Haemost. 2005;3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Eksogent aktivert protein C hemmer utviklingen av diabetisk nefropati. J Thromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Forbedring av diabetes ved protein S. Diabetes. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptose og akutt nyreskade. Nyre Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK, et al. FGFR1 medierer rekombinant trombomodulin-domene-indusert angiogenese. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, et al. Den femte epidermale vekstfaktor-lignende regionen av trombomodulin lindrer LPS-indusert sepsis gjennom interaksjon med GPR15. Thromb Haemost. 2017;117:570– 579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W, et al. Genomomfattende identifikasjon av gener som er essensielle for podocyttcytoskjeletter basert på encellet RNA-sekvensering. Nyre Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, et al. Kanonisk BMP-signalering i tubulære celler medierer utvinning etter akutt nyreskade. Nyre Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Kronisk hypoksi og tubulointerstitiell skade: en siste felles vei til nyresvikt i sluttstadiet. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Kronisk nyresykdom og dens komplikasjoner. Prim Care. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, et al. Nyreekspresjon av fibrotiske matriseproteiner og av transformerende vekstfaktor-beta (TGF-beta) isoformer i TGF-beta transgene mus. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271-280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. Motorproteinet Myo1c regulerer transformerende vekstfaktor-beta-signalering og fifibrose i podocytter. Nyre Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, et al. Endotelinreseptor-A medierer nedbrytning av det glomerulære endoteloverflatelaget via patologisk krysstale mellom aktiverte podocytter og glomerulære endotelceller. Nyre Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Glomerulær endotelcelleskade og krysstale ved diabetisk nyresykdom. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA, et al. Modifisert skanningselektronmikroskopi avslører patologisk krysstale mellom endotelceller og podocytter i en murin modell av membranproliferativ glomerulonefritt. Sci Rep. 2018;8:10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Proksimale tubulære celler fremmer fifibrogenese ved TGF-beta1-mediert induksjon av peritubulære myofifibroblaster. Nyre Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Nyretubuliskade: en drivkraft mot kronisk nyresykdom. Nyre Int. 2018;93:568–579.

39. Loefflfler I, Wolf G. Transforming growth factor-beta og progresjon av nyresykdom. Nephrol-skivetransplantasjon. 2014;29(tillegg 1):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S, et al. Urintransformerende vekstfaktor-beta hos pasienter med glomerulære sykdommer. Pediatr Nephrol. 1997;11:334-336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Hemming av celleapoptose og bedring av pulmonal fifibrose av trombomodulin. Am J Pathol. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Rekombinant humant trombomodulin ved akutt forverring av idiopatisk pulmonal fifibrose. Bryst. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Trombomodulin for akutte forverringer av idiopatisk pulmonal fifibrose: en proof of concept-studie. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Optimalt pasientvalg for antikoagulantbehandling ved sepsis: et evidensbasert forslag fra Japan. J Thromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X, et al. Rollen til gruppeboks 1 med høy mobilitet (HMGB1) i patogenesen av nyresykdommer. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Doseavhengige differensielle effekter av trombin ved allergisk bronkial astma. J Thromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, et al. Ny innsikt i podocyttbiologi i glomerulær helse og sykdom. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Smad-avhengige og Smad-uavhengige veier i TGF-beta-familiesignalering. Natur. 2003;425:577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Mechanisms of TGF-beta-mediert apoptose. Cell Tissue Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Cellebiologi og patologi av podocytter. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. Målretting av TGF-beta-signalering ved nyrefifibrose. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, et al. Trombomodulin påvirker overlevelsen til pasienter med ikke-metastatisk kolorektal kreft gjennom epitel-til-mesenkymal overgang (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, et al. Trombomodulin reduserer tumorigent og metastatisk potensial for lungekreftceller ved oppregulering av E-cadherin og nedregulering av N-cadherin-uttrykk. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, et al. G-proteinkoblet reseptor 15 medierer angiogenese og cytobeskyttende funksjon av trombomodulin. Sci Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, et al. Rekombinant trombomodulin utøver anti-autofagisk virkning i endotelceller og gir anti-ateroskleroseeffekt i mus med apolipoprotein E-mangel. Sci Rep. 2017;7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, et al. PI3K/Akt signalmediert proteinoverflateekspresjon registrert av 14-3-3 interagerende motiv. FEB J. 2009;276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Dobbel rolle for TGF-beta1 i apoptose. Cytokin Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Aktivert protein C, proteaseaktivert reseptor 1 og nevrobeskyttelse. Blod. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, et al. Aktivert protein C beskytter mot diabetisk nefropati ved å hemme endotel- og podocyttapoptose. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Rollen til anafylatoksinene i helse og sykdom. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D, et al. C3a-reseptorblokkering beskytter podocytter mot skade ved diabetisk nefropati. JCI Insight. 2020;5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, et al. Akt interagerer direkte med Smad3 for å regulere følsomheten for TGF-beta-indusert apoptose. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Signalveisamarbeid i TGF-beta-indusert epitel-mesenkymal overgang. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt modulerer TGF-beta-signalering gjennom en direkte interaksjon med Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. TGF-beta fremmer PI3K-AKT-signalering og migrasjon av prostatakreftceller gjennom TRAF6-mediert ubiquitylering av p85alpha. Sci-signal. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z, et al. Dikotomieffekter av Akt-signalering ved brystkreft. Mol Kreft. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, et al. FAM83A-signalering induserer epitelial mesenkymal overgang ved PI3K/AKT/Snail-banen i NSCLC. Aldring (Albany NY). 2019;11:6069–6088.