Timing og iskemieffekter på nyrefibrose etter kontralateral nefrektomi

Introduksjon

Forekomsten avakutt nyreskade(AKI) har økt dramatisk over hele verden de siste årene [1]. AKI kan være forårsaket av organtransplantasjon, postoperativ under perfusjon, blødning, dehydrering, sjokk og sepsis i klinisk praksis [2]. Nyere epidemiologiske og eksperimentelle studier har vist at alvorlighetsgraden, frekvensen og varigheten av AKI er nært assosiert med den påfølgende forekomsten avkronisk nyresykdom(CKD). Nyrefibrose etter AKI kan føre til CKD eller til og mednyresykdom i sluttstadiet(ESKD) [3–5], noe som antyder at AKI og CKD er koblede syndromer [6]. Mekanismene som ligger til grunn for overgangen fra AKI til CKD forblir imidlertid ukjente til tross for en rekke eksperimentelle og kliniske studier. Dyremodeller er viktige verktøy for å undersøke mekanismene som AKI fører til CKD. Nyreiskemi-reperfusjonsskade (IRI) er en av hovedårsakene til AKI, og flere dyremodeller av IRI-indusert AKI er utviklet [7], inkludert den bilaterale IRI (bIRI) modellen, den unilaterale IRI-modellen med intakt kontralateral nyre , uIRI-modellen med samtidig kontralateral nefrektomi, og uIRI-modellen med forsinket kontralateral nefrektomi.

bIRI-modellen er mindre konsistent fordi når den iskemiske skaden på begge nyrene er for mild, er det ingen signifikante fibrotiske endringer på lang sikt. Når AKI er for alvorlig, kan mus dø i den akutte skadefasen. Videre kan små forskjeller i skade på de to nyrene føre til signifikante forskjeller i deres kroniske nyrepatologi etter noen uker [8,9]. UIRI-modellen med samtidig kontralateral nefrotomi er lik bIRI-modellen da kun den skadde nyren gjenstår på grunn av nefrektomi på den andre siden [10]. I IRI-modellen med en intakt kontralateral nyre er fibrosen i den iskemiske nyren alvorlig [11,12]. Denne modellen er veldig konsistent og pålitelig for langsiktig observasjon av forskere. På grunn av tilstedeværelsen av en kontralateral uskadet nyre, kan den imidlertid ikke brukes til evaluering av estimert glomerulær filtrasjonshastighet (eGFR), serumkreatinin (SCr) og blodureanitrogen (BUN) [11–14]. Sammenlignet med de to uIRI-modellene nevnt ovenfor, overvinner uIRI-modellen med forsinket kontralateral nefrektomi disse problemene og kan brukes til både langtidsobservasjoner etter AKI og nyrefunksjonsovervåking. Derfor er denne modellen egnet for å studere AKI-CKD-overgang [15].

KLIKK HER FOR Å FÅ CISTANCHE EKSTRAKT FORAKUTT NYRESKADE

Ikke desto mindre kan forskjellige iskemiske tilstander og intervallet mellom kontralateral nefrektomi og uIRI ha betydelig innvirkning på progresjonen og alvorlighetsgraden av CKD etter AKI. Tidligere studier har fokusert på effekten av den iskemiske varigheten på post-AKI nyrefibrose og har ikke gitt mye oppmerksomhet til kjernekroppstemperaturen under iskemi. For eksempel, Skrypnyk et al. [12] kontrollerte den iskemiske temperaturen ved 38 C med et vannbadsystem, med en iskemisk varighet på 30 minutter, og den kontralaterale intakte nyren ble fjernet 8 dager etter uIRI. Resultatet viste at den iskemiske nyren hadde signifikante fibrotiske forandringer 28 dager etter uIRI. Med samme iskemiske varighet, Xiao et al. [8] viste at signifikante fibrotiske endringer skjedde 11 dager etter uIRI når den iskemiske temperaturen ble kontrollert til 37 C 38 C og tidsintervallet mellom uIRI og kontralateral nefrektomi var 10 dager. Noen forskere, som Colombaro et al. [14] og Li et al. [16] nevnte ikke den iskemiske temperaturen i sine studier.

I mellomtiden var det få som undersøkte effekten av tidsintervallet mellom kontralateral nefrektomi og uIRI i denne modellen, noe som resulterte i svært varierende resultater blant forskjellige laboratorier, som også dramatisk påvirket påfølgende eksperimenter. I denne studien undersøkte vi effekten av hovedfaktorene som påvirker nyrefibrose etter AKI, inkludert tidsintervallet mellom kontralateral nefrektomi og uIRI, kjernekroppstemperaturen under iskemi og iskemisk varighet. Vi hadde som mål å gi en referanse for å lage en passende dyremodell for å studere AKI CKD-overgangen

Materialer og metoder Dyremodeller

C57BL/6J-hannmus (8–10 uker gamle, omtrent 22 g vekt; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Kina) ble gitt gratis tilgang til mat og vann i Animal Experiment Center ved Shanxi Medical University. Avlsforholdene var som følger: fuktighet 40–70 %, temperatur 23 C, luftrenshetsklasse 7, kontrollert 12-t lys/mørke-syklus under patogenfrie forhold, fôr-Co60-bestråling og renset vann. Alle prosedyrer for denne studien ble godkjent av Animal Ethics Committee ved Second Hospital of Shanxi Medical University (etisk nummer: DW2022028).

Protokoller

Tatt i betraktning at iskemisk varighet, kjernekroppstemperaturer under iskemi og reseksjonstidspunkter for den kontralaterale uskadde nyren kan alle ha innvirkning på alvorlighetsgraden av AKI og påfølgende nyrefibrose, undersøkte vi effekten av de tre ovennevnte faktorene individuelt, med de to andre fiksert. Tre eksperimenter ble utført som følger.

Protokoll 1: For å observere effekten av intervallet mellom kontralateral nefrektomi og uIRI på nyrefunksjonen og post-AKI fibrose, ble den iskemiske tiden til venstre nyre fastsatt til 24 minutter og kjernekroppstemperaturen ble fiksert til 37 C under nyren. iskemi i mellomtiden. Høyre nyrereseksjon ble utført på henholdsvis dag 7, dag 10 og dag 14 (n ¼ 8 per gruppe) etter venstre nyre IRI. Vi bestemte varigheten av iskemi og nyrereseksjon basert på resultatene fra tidligere studier [8,10,12,15] og våre pre-eksperimentelle resultater. Se figur 1(A–C) for studieprotokollen.

Protokoll 2: For å observere effekten av kjernekroppstemperatur under iskemi på AKI-CKD-overgangen, ble den iskemiske tiden til venstre nyre fastsatt til 24 minutter, og høyre nyre ble fjernet 14 dager etter venstre nyre IRI. Kjernekroppstemperaturen ble kontrollert til henholdsvis 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C og 38 C (n ¼ 8 per gruppe). Se figur 1(D) for studieprotokollen.

Protokoll 3: For å observere effekten av nyreiskemiske varigheter på overgangen fra AKI til CKD, ble kjernekroppstemperaturen fastsatt til 37 C under iskemi, og høyre nyre ble fjernet 14 dager etter venstre nyre IRI. Vi valgte dette tidspunktet var fordi nyrefibrose, som var den typiske endringen etter AKI til CKD, var veldig tydelig i henhold til rapportene [8,10,12,15] og våre pre-eksperimentelle resultater. Den iskemiske tiden til venstre nyre ble kontrollert til henholdsvis 21 minutter, 24 minutter, 27 minutter og 30 minutter (n ¼ 8 per gruppe). Se figur 1(E) for studieprotokollen.

Alle mus ble avlivet 8 uker etter IRI av venstre nyre. En del av venstre nyrevev ble lagret ved 70 C for den påfølgende RT-PCR og western blot-analyse, og den andre delen ble fiksert i nøytralt formalin for histopatologisk analyse. Blodprøver ble tatt via sinus retro-orbital for biokjemisk testing.

Figur 1. Protokoller for den unilaterale iskemi-reperfusjonsskaden (uIRI) med forsinket kontralateral nefrektomi. (A–C): Venstre nyre ble utsatt for IRI på dag 0, og høyre nyrereseksjon ble utført på forskjellige tidspunkt (dag 7, dag 10 og dag 14) med den iskemiske varigheten fiksert til 24 min med kjernekroppstemperaturen fastsatt til 37 C under nyreiskemi. (D): Venstre nyre ble utsatt for IRI på dag 0, og høyre nyrereseksjon ble utført under forskjellige kjernekroppstemperaturer (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C og 38 C) med iskemisk tidspunkt for venstre nyre fastsatt til 24 minutter, og høyre nyre ble fjernet 14 dager etter venstre nyre IRI. (E): Venstre nyre ble utsatt for IRI på dag 0, og høyre nyrereseksjon ble utført ved forskjellige iskemiske varigheter (21 min, 24 min, 27 min og 30 min) med kjernekroppstemperaturen fastsatt til 37 C under nyrene iskemi, og høyre nyre ble fjernet 14 dager etter venstre nyre IRI. Nyrevekt, nyrefunksjon, nyrehistologisk skade og nyrefibrose ble vurdert frem til dag 56.

Kirurgisk prosedyre

Før operasjonen fastet alle mus i 12 timer med fri tilgang til vann og ble injisert med 3 % pentobarbitalnatrium 50 mg/kg intraperitonealt. Under anestesi ble rektaltemperaturen holdt på henholdsvis 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C eller 38 C i forskjellige forsøksgrupper. For å oppnå dette ble musen plassert med ryggen på en varmepute (CW{{10}}, BARBAROUS Growth, Zhejiang, Kina) i en posisjon med hodet og nakken forlenget for å sikre at luftveiene forble. uhindret, og øynene ble dekket med varm saltvannsgasbind for å unngå uttørking under prosedyren. Etter anestesi ble håret på venstre bakside av musen barbert med hårklipperen. Huden i operasjonsområdet ble deretter tørket av med en 75 % alkoholserviett. Generelt synker kroppstemperaturen til musen etter hårbarbering. Det kirurgiske inngrepet ble utført når kjernekroppstemperaturen ble konstant, noe som kunne ta ca. 15 min. Venstre nyre kunne sees ved å kutte venstre rygghud 0,5 cm ved siden av midtlinjen og 0,5 cm i nedre kant av brystkassen til musen. Deretter klemte vi venstre mage med én hånd for å få venstre nyre ut av kroppshulen, løftet nyren med en stump buet tang (passet på å unngå å skade nyren), løsnet nyreseten og klemte den raskt, og plasserte den fastklemte nyre under huden for å holde den varm og fuktig. Vellykket iskemi ble preget av en gradvis fargeendring av nyrene fra rød til mørk lilla, som varte i henholdsvis 21 min, 24 min, 27 min og 30 min i forskjellige eksperimentelle grupper. Nyrefargen endret seg tilbake til rød innen 2–5 minutter etter at klemmen ble løsnet. Deretter lukket vi bukhulen med lagdelte suturer. Høyre rygghud og muskel ble skåret inn på henholdsvis dag 7, dag 10 og dag 14 etter uIRI i forskjellige forsøksgrupper, og høyre nyre ble resekert. Lukk deretter såret med standard suturer. Etter hver operasjon ble 500 l saltvann injisert intraperitonealt for å kompensere for væsketapet under operasjonen. Samtidig ble musen holdt på en varmepute i ca. 2–3 timer til den fikk full bevissthet før den ble overført til buret. Den falske gruppen klemte ikke nyrepedikelen, og resten av de kirurgiske operasjonene var de samme som i uIRI-gruppen. Alle kirurgiske operasjoner ble utført av samme person med mer enn 2 års erfaring i driften av denne modellen.

Nyrefunksjonsanalyse

SCr-nivåer ble målt med Creatinine Kit (Jaffe Method, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). BUN-nivåer ble målt med Urea Kit (Urease-Glutamate Dehydrogenase Method, Biosino Biotechnology and Science).

Nyrevektanalyse

Etter vannlating ble kroppsvektene til mus målt med en elektronisk presisjonsvekt. Ferske nyrer ble skylt tre ganger i forhåndskjølt saltvann, deretter ble overflødig vann på nyrene tørket av med filterpapir. Nyrekapslene ble skrellet av på isen og nyrene ble veid umiddelbart. Forholdet mellom nyrevekt og kroppsvekt ble beregnet for å evaluere korrigert nyrevekt i mg/g.

Hematoxylin-eosin (HE)-farging og nyreskadescore

Nøytralt formalinfiksert nyrevev ble rutinemessig dehydrert, innebygd i parafin, snittet (3 lm) og farget med HE for å observere skaden på nyrevev. Ti tilfeldig utvalgte felt av nyrebarken i hver seksjon ble fanget med lysmikroskopi ved 400 forstørrelse. To patologer skåret skaden på glomerulus og nyretubuli separat. Den rørformede skaden ble skåret på en skala fra {{20}}–4 ved å bruke følgende kriterier [17]: 0, ingen skade; 1, påvirker 1–25 % av nyreområdet; 2, som påvirker 26–50 % av nyreområdet; 3, som påvirker 51–75 % av nyreområdet; og 4, som påvirker 75–100 % av nyreområdet. Graden av tubulær skade ble evaluert semikvantitativt ved å beregne arealet av tubulær nyreskade. Den glomerulære skaden ble evaluert og skåret på en skala fra 0–4 i henhold til det prosentvise arealet av mesangial ekspansjon eller sklerose ved å bruke følgende kriterier [17]: 0, normal glomeruli; 1, 1–25 % av området skadet; 2, 26–50 % av området skadet; 3, 51–75 % av området skadet; og 4, 76–100 % av området skadet. Den endelige glomerulære skadeskåren ¼ 0 (% grad 0 glomeruli) þ 1 (% grad 1 glomeruli) þ 2 (% grad 2 glomeruli) þ 3 (% grad 3 glomeruli) þ 4 (% grad 4 glomeruli). Mer enn 50 glomeruli ble skåret per mus.

Massons trikromfarging

Nøytralt formalinfiksert nyrevev ble rutinemessig dehydrert, innebygd i parafin, snittet (3 lm) og farget med Massons trikrom for å observere nyrefibrose. I Massons trikromfargede skiver ble tjue ikke-overlappende felt med nyrebark fanget under 200 forstørrelse. Image-Pro Plus Image Analysis Software ble brukt til automatisk måling og analyse. Prosentandelen av det fibrotiske området ble brukt til å finne ut nivået av interstitiell fibrose i nyrene [8].

RT-PCR

Totalt mRNA ble ekstrahert fra nyrevevet til hver gruppe av Trizol og konsentrasjonen ble målt, deretter ble det omdannet til cDNA (Taka Reverse Transcription Kit). Taqman-fluorescensmetoden (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) ble brukt til å kvantifisere fibronektin (FN) og kollagen I (COL-I) RNA-uttrykk i nyrevev. Spesifikke primere ble brukt for FN (fremover: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 og bakover: 50 -ACTGGATGGGGGTGGGAAT-30 ), og COL-I (fremover: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} og omvendt: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (levert av Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kina). Amplifikasjonsbetingelsene er som følger: 95 C i 30 s, 95 C i 5 s, 60 C i 30 s, 40 sykluser; 95 C i 10 s, 65 C i 5 s og 95 C/5 C. Etter å ha analysert amplifikasjonskurvene og løselighetskurvene til produktene, ble de relative mRNA-nivåene bestemt ved den sammenlignende CT-metoden (2-DDCt) med 18SrRNA (fremover: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 og bakover: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) som intern referanse.

Western blot

Radio-immuno-presitasjonsanalyse (RIPA) lyseringsbuffer ble brukt til å lysere nyrevevet og konsentrasjonen av protein ble bestemt ved BCA-metoden. Gradientgelelektroforese ble brukt for å skille proteinene fra 5 0 lg prøver. Deretter ble proteinene overført til en nitrocellulosemembran. Etter blokkering med 5 % fettfri melk i 2 timer, ble membranene blottet over natten ved 4 C med kanin-anti-mus monoklonalt antistoff mot a-glatt muskel-aktin (a-SMA) (1:1000, nr. 19245, Cell Signaling Technology ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) eller COL-I (1:1000, No.72026, Cell Signaling Technology), henholdsvis. Neste dag ble membranene varmet opp ved romtemperatur i 0,5 time. Etter å ha blitt vasket med TBST, ble membranene inkubert med HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG(H þ L)(1:1000, nr. BA1054, BOSTER Biological Technology) i 2 timer. Etter å ha blitt vasket med TBST igjen, ble de farget med ultrahøysensitiv ECL-kjemiluminescensreagens for å visualisere immunblottene. b-aktin ble målt på samme membran som den interne referansen. Proteinuttrykk ble bestemt ved å kvantifisere de relative uttrykkene av målproteiner versus b-aktin.

Data og statistisk analyse

Alle data som undersøkes er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Sammenligninger mellom de to gruppene ble oppnådd ved en uavhengig t-test. Sammenligninger mellom flere grupper ble åpnet med enveis ANOVA når datafordelingen er normal, og variansen er homogen, Welch ANOVA ble brukt til å vurdere statistisk signifikans når variansen var heterogen, etterfulgt av Tukeys post hoc test for flere sammenligninger. Alle statistiske analyser ble utført av GraphPad Prism 8.0-programvaren. p < 0.05 ble ansett for å være statistisk signifikant.