I dag regnes cellulær alderdom som en vanlig reaksjon av nesten alle typer prolifererende celler
Sep 08, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
AbstraktMålrettet eliminering av senescent celler, analyse, er en av kjernetrendene innen antialdringsterapi. Hjerteglykosider ble nylig vist seg å være bredspektrede senolytika. Her testet vi senolytiske egenskaper til hjerteglykosider mot humane mesenkymale stamceller (hMSCs). Hjerteglykosider hadde ingen senolytisk evne mot senescent hMSCs av ulik opprinnelse. Ved å bruke biologiske og bioinformatiske tilnærminger sammenligner vi alderdomsutvikling i 'hjerteglykosider-sensitive' A549 og '-ufølsomme' hMSCs. Fraværet av analyse ble funnet å være mediert av den effektive kaliumimporten og økt apoptoseresistens i senescent hMSCs. Svekkelse av "antiapoptotisk forsvar" disponerer hMSC-er for analyse. Vi avslørte at apoptoseresistens, tidligere anerkjent som et vanlig kjennetegn ved senescens, faktisk ikke er et generelt trekk ved senescerende celler. Dessuten er det bare apoptose-prolin-senescentceller som er følsomme for hjerteglykosid-indusert analyse. Dermed kan vi spekulere i at effektiviteten av analysen kan avhenge av om senescerende celler faktisk blir apoptose-resistente sammenlignet med deres prolifererende motstykker.
NøkkelordStamceller. Senolyse·Senescens·Apoptose·Stressmotstand
Introduksjon
I dag betraktes cellulær senescens som en vanlig reaksjon av nesten alle typer prolifererende celler, inkludert kreft og stamceller, så vel som noen post-mitotiske celler på en rekke stressende stimuli [1-3]. Følgende typer cellulær senescens kan skilles ut i henhold til opprinnelsen til den induserende faktoren: replikativ (på grunn av DNA-skaden ved de forkortede telomerendene), onkogenindusert (som respons på avvikende aktivering av onkogen signalering), stressindusert ( mediert av DNA-skaden forårsaket av oksidativt stress, varmesjokk, UV- og y-stråling, etc.) og kjemoterapi-indusert (aktivert i kreftceller som respons på kjemoterapeutiske legemidler)[4-7]. Det er heterogenitet i markører uttrykt av senescerende celler avhengig av både celletype og en fornærmelse som brukes til å indusere senescens. Imidlertid er det flere fellestrekk som er typiske for de fleste typer senescentceller. Den essensielle egenskapen til senescens for enhver form for delende celle er det irreversible spredningstapet [8].cistanche tubulosa ekstraktIrreversibiliteten til cellesyklusstansen kontrolleres av de syklinavhengige kinase (CDK)-hemmerne pl6 og p21 og reguleres ofte av tumorsuppressorproteinet p53 [8,9]. De andre viktige egenskapene til senescentceller er aktiveringen av en vedvarende DNA-skaderespons; cellehypertrofi, som ofte oppstår som et resultat av nedsatt ribosomal biogenese og proteinsyntese; forstyrrelse av lysosomal nedbrytning og dysfunksjon av resten av nedbrytningssystemene; økt aktivitet av det spesifikke lysosomale enzymet senescensassosiert- -galaktosidase; ulike mitokondrielle endringer; erverv av den senescensassosierte sekretoriske fenotypen (SASP), sammensatt av pro-inflammatoriske faktorer, matrise-nedbrytende enzymer, reaktive oksygenarter, etc.; epigenetiske og kromatin landskapsendringer, inkludert dannelsen av aldersassosierte heterokromatiske foci og alderdomsassosiert utvidelse av satellitter [8-10]. Med andre ord bevarer senescerende celler metabolsk aktivitet og vitalitet, men deres funksjon er betydelig endret sammenlignet med opprinnelsescellene.
Cistanche kan anti-aldring
Det er nå klart at senescentceller kan modifisere det omkringliggende mikromiljøet som påvirker både naboceller og cellulære nisjer, noe som kan føre til vevssvikt og derfor kan være relatert til progresjon av aldring og aldersrelaterte sykdommer [11,12]. Med det i bakhodet, er mer oppmerksomhet i dag fokusert på strategiene for målrettet "drap" av senescent celler[13-15]. For dette formål er en ny klasse medikamenter kalt senolytika aktivt i utvikling. Senolytika retter seg mot signalveier som bidrar til motstanden til senescent celler mot apoptose, og induserer dermed apoptose fortrinnsvis i senescent celler [16]. Listen over senolytika fylles stadig på med nye midler. De mest kjente forbindelsene med den oppgitte senolytiske aktiviteten er navitoclax (Bcl-2-familiehemmer), en kombinasjon av dasatinib (en hemmer av flere tyrosinkinaser) og quercetin (en naturlig flavonol), Hsp90-hemmere, MDM2-hemmere, FOXO{ {8}}p53-interfererende peptid, en proteinnedbryter i BET-familien, uPAR-spesifikk CAR-T, galakto-konjugert navitoclax og forskjellige senolytiske naturlige forbindelser[16-24]. Nylig identifiserte to uavhengige forskningsgrupper hjerteglykosider, spesielt ouabain, digoksin og bufalin, som bredspektrede senolytika [25,26].cistanche tubulosa anmeldelserDet er verdt å nevne at nesten alle de deklarerte senolytika har begrensninger, slik som uønskede bivirkninger eller ineffektivitet overfor enkelte celletyper. Mesenkymale stamceller (MSC), som finnes praktisk talt i alle postnatale organer/vev, er preget av evnen til å fornye seg selv (symmetriske delinger) og til å differensiere, og dermed bidra til vedlikehold og regenerering av det residerende vevet [27]. På grunn av disse unike egenskapene, sammen med de potente antiinflammatoriske og immunsuppressive funksjonene, brukes MSCs bredt i celleerstatningsterapi for behandling av ulike sykdommer, inkludert diabetes mellitus, multippel sklerose, hjerteinfarkt, og så videre [28]. Imidlertid, i likhet med deres differensierte avkom og andre unipotente celler, er MSC-er i stand til å senescere enten replikativt eller for tidlig som respons på onkogeners aktivering og stressende stimuli [29, 30]. MSC-ers senescens har mange uønskede ettervirkninger, blant annet utmattelse av stamcellepoolen, redusert vevsvedlikehold og -regenerering, nedsatt differensieringskapasitet, SASP-mediert senescensspredning, reduserte angiogene egenskaper, modifikasjon av stamcellenisje [29,31-33]. Med tanke på den biologiske betydningen av de riktige MSC-enes funksjon, kan eldre MSC-er betraktes som det avgjørende målet for analyse. I tråd med dette forslaget har det blitt publisert en rekke anmeldelser som fremhever mulige fordelaktige resultater av fjerning av eldre MSC-er i løpet av det siste året [29, 31, 34, 35]. Likevel er det bare noen få eksperimentelle data om dette problemet [36-40].
Innenfor denne studien demonstrerer vi for første gang at hjerteglykosider, nemlig ouabain og bufalin, ikke klarer å vise hemolytisk aktivitet mot humane MSCs (hMSCs) avledet fra endometrium (END-MSCs), fettvev (AD-MSCs), tannmasse (DP-MSCs) og Warton gelé (WJ-MSCs). I tillegg bekrefter vi at begge hjerteglykosidene er i stand til å indusere apoptose fortrinnsvis i senescent A549 og SK-HEP-1, som tidligere beskrevet i pilotstudiene [25,26]. Ved å vurdere endringer i ionisk homeostase forårsaket av Nat/K pluss -ATPase-blokkering og ekspresjonsnivåer av de relaterte genene, avslører vi at fraværet av ouabain-indusert analyse kan være mediert av den økte effektiviteten til den kompenserende K pluss-importen i senescent END- MSC-er sammenlignet med senescent A549. Videre, ved bruk av avansert bioinformatikk demonstrerer vi at senescens av END-MSC-er, resistente mot ouabain-indusert analyse, er ledsaget av anskaffelse av apoptose-resistent fenotype, mens senescens av ouabain-sensitiv A549 ikke er det. Det er viktig at blokkering av aktiviteten til antiapoptotisk protein MCL-1 før behandling med hjerteglykosid resulterte i analysen av apoptoseresistente senescent END-MSCs. Derfor gir vi klare bevis på at apoptose-resistens ikke er et generelt trekk ved senescentceller. Basert på dataene vi har oppnådd, konkluderer vi med at effektiviteten av analytiske tilnærminger kan avhenge av om celler faktisk ble apoptose-resistente under alderdomsutvikling.
Materialer og metoder
Celler
END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549 og SK-Help ble hentet fra Russian Collection of Cell Cultures (Institute of Cytology, Saint-Petersburg, Russland). A549 og SK-Hjelpelinjer ble autentisert ved karyologi, tumorigenisitet, isoenzym (LDH og G6PD) tester og STR-analyse. Celler ble dyrket i komplett medium DMEM F12(Gibco BRL) supplert med 10 prosent FBS (HyClone), 1 prosent penicillin-streptomycin (Gibco BRL) og 1 prosent glutaminsyre (Gibco BRL). Alle cellene ble rutinemessig testet for mykoplasma-kontaminering.
Senescens- og stressfremkallende forhold
For oksidativt stress-indusert senescens ble END-MSCs/WJ-MSCs behandlet med 200 uM/100 uM HO(Sigma) i 1 time. For doksorubicin-indusert senescens ble DP-MSCs/A549 behandlet med 1 μM doksorubicin (Veropharm) i 3 dager. I hvert tilfelle ble celler ansett som aldrende ikke tidligere enn 14 dager etter behandling. For replikativ senescens ble AD-MSC-er tidligere enn den 4. passasjen identifisert som kontrollceller og senere enn den 10. som senescerende. For etoposid-indusert senescens ble A549/END-MSCs/SK-Help behandlet med 2 uM/5 uM/3 uM etoposid (Veropharm) i 3 dager og analysert ikke tidligere enn 7 dager etter senescensinduksjon. I dette tilfellet falt behandlingsdesignet fullstendig sammen med de som er beskrevet i studien som RNA-seq-data stammet fra (Wang et al., 2017). To hjerteglykosider vi brukte som senolytiske forbindelser - Ouabain (Sigma) og Bufalin (Calbiochem).
For å sammenligne stressmotstand mellom kontroll og senescent END-MSC eller A549, ble cellene behandlet enten med 400/800 uM H O2(Sigma) i 1 time eller med 0,3/1 uM staurosporin (Sigma). Cellelevedyktighet ble analysert 48 timer etter stressinduksjon.
For å blokkere MCL-1-aktivitet ble END-MSC-er forbehandlet med 10 uM A-1210477(Sigma) i 3 dager.
Flowcytometrianalyse
Målinger av cellelevedyktighet, proliferasjon, cellestørrelse, autofluorescens, apoptosehastigheter, caspase 3/7 spaltning, mitokondriell membranpotensial og membrandepolarisering ble utført ved flowcytometri. Flowcytometri ble utført ved bruk av CytoFLEX (Beckman Coulter) og de oppnådde dataene ble analysert ved bruk av CytExpert programvareversjon 2.0. Adherente celler ble skylt to ganger med PBS og høstet ved trypsinisering. Løsne celler ble slått sammen og resuspendert i friskt medium og deretter telt og analysert for autofluorescens. For å få tilgang til cellelevedyktighet ble 50 ug/ml propidiumjodid (Life Technologies) tilsatt til hver prøve rett før analyse. Cellestørrelsen ble evaluert ved cytometrisk fremadrettet lysspredning av PI-negative celler. Apoptose-induksjon ble verifisert ved bruk av Annexin-V-APC (Invitrogen) og DAPI (Sigma) co-farging etter produsentens instruksjoner. Caspase-aktiviteten ble vurdert ved å bruke CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Tap av mitokondriell membranpotensial ble vurdert ved å bruke det ratiometriske fargestoffet JC-1 (Invitrogen). Fargeprosedyren ble utført i henhold til produsentens protokoll. For membrandepolarisering brukte vi en DiBAC4 (3) fluorescerende probe (Invitrogen).
Aldringsassosiert -galaktosidasefarging
Aldringsassosiert -Galactosidase (SA- -Gal)-farging ble utført ved bruk av et senescens-galaktosidase-fargingssett (Cell Signaling Technology) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ analyse av bilder ble produsert ved bruk av MatLab-pakken, i henhold til algoritmen beskrevet tidligere[41]. For hvert forsøkspunkt ble ikke mindre enn 50 tilfeldig utvalgte celler analysert.
Western blotting
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [41]. SDS-PAGE-elektroforese, overføring til en nitrocellulosemembran og immunblotting med ECL (Thermo Scientific)-deteksjon ble utført i henhold til standard produsentens protokoller (Bio-Rad Laboratories). Antistoffer mot følgende proteiner ble brukt: glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH)(klon 14C10), fosfo-p53(Ser15), p21(klon 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (klon D3E5), så vel som pepperrotperoksidase-konjugert geit-antikanin-IgG. Fortynningshastigheten var 1:1000 for alle primære antistoffer og 1:7000 for sekundære. Alle antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling. Scion Image 4.0 (Scion Corporation) ble brukt til å velge og bestemme den bakgrunnssubtraherte tettheten til båndene i alle gelene og blottene.
Transkriptomisk analyse
Prøver fra følgende tre Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq datasett ble brukt i analysen: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 og GSM2742121-GSM2742122forkontroll og senescentA549celler, tilsvarende); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 og GSM3454500-GSM3454502 for kontroll- og senescent IMR-90-celler, tilsvarende); og datasettet vårt GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 og GSM4877907-GSM4877910 for henholdsvis kontroll og senescent END-MSCs). Dataene for alle datasettene ble behandlet på samme måte.
Raw-lesdata gjennomgikk kvalitetsfiltrering og adaptertrimming via FilterByTile og BBDuk-skript fra BBtools-pakken (versjon 38.75) ved å bruke standardalternativene. De gjenværende avlesningene ble i tillegg filtrert og trimmet ved bruk av et trimesterskript fra FastqPuri-pakken (versjon 1.0.7).cistanche StorbritanniaTrimmeoperasjonen ble brukt for begge ender av avlesningene hvis de inneholdt N-er eller kvaliteten deres var under kvalitetsterskelen satt til 27, alle avlesninger kortere enn 25 baser ble forkastet. Kvalitetskontrollen av trimming ble holdt med FastQC-programvaren (versjon 0.11.7) og FastqPuri-skript. Avlesningene, etter å ha bestått alle operasjoner, utgjør ikke mindre enn 90 prosent av de opprinnelige dataene.
Transkripsjonsmengder ble estimert ved å bruke Salmon lightweight mapping (versjon 1.1.0) som kjørte i selektiv justeringsmodus. Listen over lokkefugler ble generert basert på Gencode humane referansegenomet GRCh38.p13 (utgave 33) og brukt videre for å bygge indeksen på sammenkoblede transkriptom- og genom Gencode-referansefiler (utgave 33) ved bruk av en kmer-størrelse på 21. Kartleggingsoperasjoner ble kjørt med ekstra flagg——numBootstraps 30——paljetter——gcBias——validerer tilordninger. De resulterende kartleggingsratene var rundt 70 prosent.
Ytterligere databehandling ble utført ved bruk av R-versjon 3.6.3 med Tidyverse-samlingen av pakker (versjon 1.3.0). Estimerte gentellinger, metadata og transkripsjonsområder ble lastet inn i R og oppsummert til et gennivå ved bruk av tximeta (versjon 1.4.5). Den resulterende tellingsmatrisen ble filtrert for å inneholde rader med minst 5 estimerte tellinger på tvers av alle prøver, den resulterende matrisen inneholdt 20 400 gener.
For PCA- og varmekart-representasjonen ble lesetellingene normalisert ved å bruke loggtransformasjon fra DESeq2-pakken (versjon 1.26.0).cistanche wirkungVarmekart ble konstruert ved bruk av genfilter (versjon 1.38.0) og varmekart(versjon 1.0.12)R-pakker. Validering av delingsprøver etter senescensvariabel ble utført via subsetting normaliserte lesetellinger etter gener relatert til Gene Ontology-begrepet "Cellular senescence" (GO 0090398). Differensiell ekspresjonsanalyse og estimering av logfold-endringer ble beregnet ved å bruke DESeq2 for den siste variabelen i designformelen som kontrollerer cellens alderdomsstatus, ouabain-behandlingsreaksjon og interaksjon av de indikerte faktorene. For å styrke testing av differensialuttrykk ble korrigering av loggfoldendring ved hjelp av en kombinasjon av adaptiv krympeestimator fra håndflatepakken (versjon 1.8.0) og spesifisering av en ekstra loggfoldendringsterskel lik 0,667 brukt. De resulterende krympede estimatene ble brukt videre for generering og kjøring av Gene Set Enrichment Analysis ved bruk av klyngeprofil (versjon 3.14.3) og fuser (versjon 1.12.0)R-pakker med p-verdier justert for flere sammenligninger i henhold til Benjamin-Hochberg-metoden. Affymetrix mikroarray-prøver for kontroll- og senescent AD-MSC-er ble hentet fra GEO-databasen (GSE66236) og behandlet med Phantasus-webapplikasjon med log2- og kvantilteller-normalisering. Gene Set Enrichment Analysis ble utført med bruk av en sikring (versjon 1.12.0)R-pakke.
RNA-ekstraksjon, revers transkripsjon og sanntids PCR
RNA-ekstraksjon, revers transkripsjon og sanntids-PCR ble utført som beskrevet i vår forrige studie [32]. Reagenser for RNA-ekstraksjon (ExtractRNA-reagens), revers transkripsjon (MMLV RT-sett) og sanntids-PCR (HS SYBR-sett) ble hentet fra Evrogen. Genekspresjonsnivåer ble vurdert ved bruk av sanntids PCR BioRad CFX-96-forsterkeren (BioRad) med følgende kjøreprogram for alle undersøkte gener: 40 sykluser med smelting i 10 s ved 95 grader, annealing i 15 s ved 57,5 grader. , og syntese i 15 s ved 72 grader . Smeltekurveanalyse ble brukt for å kontrollere spesifisiteten til reaksjoner. Følgende analyse av de oppnådde dataene ble utført ved bruk av Bio-Rad CFX Manager-programvaren (BioRad) med standard 2deltaCt-kvantifiseringsmetoden med bruk av GAPDH-uttrykk som referanse. Primersekvenser er oppført i tabell 1.
Statistisk analyse
For å få betydning i forskjellen mellom de to gruppene ble Students t-test eller Welchs t-test brukt. For flere sammenligninger mellom grupper ble ANOVA med Tukeys HSD brukt. Med mindre annet er angitt, er alle kvantitative data vist som gjennomsnitt±SD og stjernene indikerer signifikante forskjeller som følger: ns, ikke signifikant,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">
Resultater
H2O2-behandlede END-MSC-er går inn i for tidlig alderdom
Innenfor denne studien brukte vi humane mesenkymale stamceller isolert fra desquamered endometrium (END-MSCs), som tilfredsstiller minimumskriteriene foreslått av ISCT for å definere hMSCs [41]. Tidligere har vi utviklet en pålitelig eksperimentell modell for å studere ulike aspekter ved for tidlig alderdom av END-MSCs [30]. Vi har nemlig vist at END-MSCs utsatt for subletalt oksidativt stress gradvis ervervet alle de typiske egenskapene til senescerende celler, inkludert vedvarende DNA-skade foci og aktiv DNA-skaderespons, irreversibel cellesyklusstans mediert av den klassiske p53/p21/Rb pathway, spredningstap, cellehypertrofi, utseende av SA- -Gallfarging og utvikling av senescensassosiert sekretorisk fenotype [30, 32, 42]. Her brukte vi den designet modellen for å studere senolytisk effekt av ouabain samt for å avsløre de underliggende intracellulære endringene i ionehomeostase. Til å begynne med, ved å estimere de vanligste parametrene, bekreftet vi at enkeltdose (1 time, 200 μM) HO-behandling var tilstrekkelig til å indusere senescens i END-MSCs. Det er viktig at stressede END-MSCs ble ansett som eldre to uker etter det oksidative stresset; derfor ble alle senescensmarkørene vurdert ikke tidligere enn 14 dager etter H-Oz-behandling. H-Oz-behandling av END-MSC førte faktisk til spredningsblokkering, cellehypertrofi som indikert av økt cellestørrelse, akkumulering av lipofuscin påvist ved forhøyet autofluorescens, utseende av SA- -Gal, aktivering av p21/Rb-veien og tap av HMGB1 støtter sammen alderdomsetablering under de valgte eksperimentelle forholdene (fig. ac, e, f).
De mest skadelige effektene av senescerende celler på vevs- og organismenivå antas å være konsekvensen av deres langvarige vitalitet. I tråd med dette punktet beholdt HO?-behandlede END-MSC-er høy levedyktighet selv på de sene stadiene av senescensutvikling (levedyktigheten til senescerende END-MSC-er ble vurdert 17 dager (14 dager-3 dager) etter det innledende oksidative stresset) (fig.1d) ). For å oppsummere er subletal HO2-behandling av END-MSC-er den passende modellen for prematur senescens og er relevant for å undersøke effekten av senolytiske forbindelser på END-MSC-er.
Hjerteglykosid ouabain har ingen senolytisk aktivitet mot senescent END-MSCs i et bredt konsentrasjonsområde
Nyere bevis tyder på at hjerteglykosider, inkludert ouabain, digoksin og bufalin, representerer en familie av forbindelser med hemolytisk aktivitet [25,26]. Selv om hjerteglykosider i dag betraktes som de bredspektrede senolytika, mangler dataene angående deres effekter på eldre hMSC-er. Derfor testet vi her om ouabain har potensial til å indusere død selektivt i senescent END-MSCs. For å gjøre det, vurderte vi levedyktigheten til kontroll- og senescent END-MSCs etter behandling med ouabain i det brede konsentrasjonsområdet (fra 10-' til 10~ M). Interessant nok førte ingen av de påførte konsentrasjonene til en merkbar reduksjon i levedyktigheten til både kontroll- og senescentceller den første dagen etter påføring av ouabain (fig.2 og tilleggsfig.S1).
På den tredje dagen etter ouabain-behandling avslørte vi imidlertid en betydelig doseavhengig nedgang i levedyktigheten til kontroll END-MSCs (Fig. 2a og Supplemental Fig. S1). Uventet viste senescentceller seg å være mer resistente mot ouabain ved hver konsentrasjon som ble testet. I tråd med dette resultatet førte10-M ouabain til mer utsatt apoptotisk død i kontrollceller (20,75 prosent An pluss /PI- og 36,47 prosent An pluss /PI pluss) sammenlignet med eldre (15,01 prosent An＋/PI) -og 12,15 prosent An pluss /PI pluss )(Fig.2b). Oppnådde resultater viser tydelig at i sammenheng med senescent END-MSCs har ouabain ingen senolytisk aktivitet.
For å utelukke mulige effekter assosiert med variasjon av senescens-induserende stimuli på senolytisk virkning av ouabain, utførte vi et ekstra sett med eksperimenter. Vi behandlet nemlig END-MSCs med etoposid i stedet for oksidativt stress for å indusere for tidlig senescens.sitrus bioflavonoiderEtoposid-behandlede END-MSCs viste alle funksjonene som er typiske for aldrende celler (fig.3a-e).
Viktigere, ouabain hadde ingen hemolytisk virkning mot etoposid-behandlet senescent END-MSCs (Fig. 3f og Supplement-mental Fig. S2). Disse dataene gir ytterligere bekreftelse for resultatene ovenfor og bevis på at mangelen på ouabain-indusert analyse ikke er konsekvensen av den konkrete senescensutløseren som brukes til å indusere senescens.
Fig. 1 Validering av oksidativt stress-indusert END-MSCs prematur senescensmodell. Senescent END-MSCs a løs spredning, b gjennomgår hypertrofi, c får forhøyet autofluorescens, beholder høy cellelevedyktighet d og e viser SA- -Gal-aktivitet sammenlignet med kontrollene. f Fosforyleringsnivåer av p53 og Rb og ekspresjonsnivåer av p21 og HMGBI proteiner i kontroll og senescent END-Ouabain har ingen hemolytisk virkning mot humane mesenkymale stamceller av forskjellig opprinnelse. For å utvide våre observasjoner angående fravær av ouabain-indusert analyse i END-MSCs , analyserte vi ouabain-effekter på hMSC-er isolert fra andre kilder, inkludert fettvev, tannkjøtt og Whartons gelé. For i tillegg å styrke dataene våre, brukte vi forskjellige modeller for senescens——replikativ senescens for AD-MSCs, doxorubicin-indusert senescens for DP-MSCs og oksidativt stressindusert senescens for WJ-MSCs (fig.4a-f).
Som vist i Fig. 4g, skilte ulike typer hMSC-er seg i levedyktigheten ved ouabain-behandling, for eksempel var både kontroll- og senescent DP-MSC-er mye mer motstandsdyktige mot ouabain-virkning enn WJ-MSC-er (Fig. 4g og Supplerende Fig. S3b, c). Ikke desto mindre var ikke ouabain i stand til å indusere senolyse i noen av typene senescent hMSCs (Fig. 4g og Supplemental Fig. S3). Sammen viser dataene som er oppnådd at fraværet av ouabain-indusert analyse er et fellestrekk for ulike typer hMSC-er. MSC-er. Verdiene som presenteres er gjennomsnitt±SD. For flere gruppesammenlikninger ved a og d ble enveis ANOVA brukt, n=3, ns ikke signifikant,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">
GAPDH ble brukt som en lastekontroll
Hjerteglykosid bufalin klarer ikke å drepe senescent END-MSCS
For å bekrefte fraværet av senolytisk virkning av hjerteglykosider mot hMSCs, brukte vi bufalin, en annen forbindelse med den angitte senolytiske aktiviteten som tilhører hjerteglykosidefamilien [25]. Bufalin hadde nesten ingen effekt på levedyktigheten til kontroll og H2O2-behandlede senescent END-MSCs i et bredt konsentrasjonsområde (fra 10-7 til 10-5 M) (Fig. 5a og Supplemental) Fig. S4a).
I likhet med det vi observerte for ouabain-behandling, var fraværet av analyse på bufalin uavhengig av senescens-induserende stimuli, siden levedyktigheten til ESC-er som sensurerte enten som respons på oksidativt stress eller på etoposid var upåvirket (fig. 5a, b, tilleggsbilde). S4a, b). Resultatene beskrevet ovenfor bekrefter at hjerteglykosider viste seg å være ineffektive for målrettet dødsinduksjon i senescent END-MSCs. MSC-er. Verdiene som presenteres er gjennomsnitt±SD. For flere gruppesammenlikninger ved a og d ble enveis ANOVA brukt, n=3, ns ikke signifikant,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">
Hjerteglykosid bufalin klarer ikke å drepe senescent END-MSCS
For å bekrefte fraværet av senolytisk virkning av hjerteglykosider mot hMSCs, brukte vi bufalin, en annen forbindelse med den angitte senolytiske aktiviteten som tilhører hjerteglykosidefamilien [25]. Bufalin hadde nesten ingen effekt på levedyktigheten til kontroll og H2O2-behandlede senescent END-MSCs i et bredt konsentrasjonsområde (fra 10-7 til 10-5 M) (Fig. 5a og Supplemental) Fig. S4a).
I likhet med det vi observerte for ouabain-behandling, var fraværet av analyse på bufalin uavhengig av senescens-induserende stimuli, siden levedyktigheten til ESC-er som sensurerte enten som respons på oksidativt stress eller på etoposid var upåvirket (fig. 5a, b, tilleggsbilde). S4a, b). Resultatene beskrevet ovenfor bekrefter at hjerteglykosider viste seg å være ineffektive for målrettet dødsinduksjon i senescent END-MSCs.
Fig.2 Ouabain har ingen hemolytisk aktivitet mot HO2-behandlede senescent END-MSCs i et bredt konsentrasjonsområde. Relativ cellelevedyktighet ( prosent ) av kontroll og senescent END-MSCs i 3 dager etter behandling med 1077,10~6,10-5 Mouabain. b Apoptose-induksjon i END-MSCs etter 10-6 M ouabain vurdert ved Annexin V/DAPI dobbel farging. n=3 uavhengige eksperimenter. Alle data tilsvarer gjennomsnittet±SD. Statistisk signifikans ble vurdert av Welchs t-test:ns ikke signifikant,***s<>
Både hjerteglykosidene ouabain og bufalin er i stand til å indusere celledød selektivt i senescent A549 og SK-Hep1 celler
Tatt i betraktning det faktum at resultatene våre ikke samsvarer med de nylig publiserte bevisene angående den bredspektrede senolytiske virkningen av hjerteglykosider, bestemte vi oss for å reprodusere denne effekten ved å bruke den cellulære modellen beskrevet i de relevante studiene [25,26]. Dermed utførte vi en serie eksperimenter med kontroll og senescent A549 lungekarsinomceller. Senescens i A549-celler ble indusert ved etoposidbehandling. Etoposid-indusert senescens av A549-celler er en ofte brukt og dermed godt karakterisert modell av terapi-indusert senescens [4]. Det ble også vist at ouabain selektivt dreper etoposid-behandlede senescerende A549-celler[25]. For å bevise senescens i A549, vurderte vi spredningshastighet, cellestørrelse, akkumulering av lipo-fin, SA- -Gal-farging, aktiveringsstatusen av p53/p21/Rb-banen, og ekspresjonsnivået til HMGB1 (fig. 6a-e).
For å bekrefte hemolytisk aktivitet av ouabain mot senescent kreftceller, estimerte vi først doseavhengig cellelevedyktighet. I tråd med resultatene våre beskrevet ovenfor, var vi ikke i stand til å oppdage noen signifikant nedgang i antall levedyktige kontroll- eller senescent A549-celler innen 24 timer etter påføring av ouabain (tillegg Fig. S5a). Imidlertid reduserte ouabain i løpet av 3 dager etter behandling signifikant levedyktigheten til senescent A549-celler på en doseavhengig måte, mens antallet kontroll-A549-celler reduserte i mye mindre grad (Fig.7a og Supplerende Fig. S5a). Nemlig omtrent 90 prosent av kontrollcellene bevarte levedyktigheten ved 10- Mouabain sammenlignet med 50 prosent av senescent A549-celler behandlet med samme dose (fig.7a). I tillegg var eldre A549-celler mer utsatt for bufalinindusert celledød enn deres kontrollmotstykker (fig.7b)(fig.5b og tilleggsfig.S5b).
I følge publiserte data utløste ouabain caspase-3-avhengig apoptose i eldre A549-celler [26]. Faktisk avslørte vi en signifikant økning i den doble positive og/eller PI-fraksjonen i eldre kreftceller behandlet med 10-6M ouabain (fig.7c). Videre, ved bruk av fluorescerende assay, observerte vi aktivering av caspase-3 i ouabain-behandlede senescent A549-celler (fig.7d). Til sammen er disse resultatene helt i samsvar med dataene beskrevet av andre forfattere og bekrefter den hemolytiske aktiviteten til ouabain mot A549.
Vi brukte også doksorubicin i stedet for etoposid for å forårsake senescens i A549 (fig.8a-e). Som forventet viste doxorubicin-behandlet senescent A549, så vel som etoposid-behandlet, høyere følsomhet både for ouabain og bufalin sammenlignet med kontrollmotpartene deres (fig. 8g og tilleggsfig. S6). Sistnevnte bekrefter at senolytiske effekter av hjerteglykosider er uavhengige av senescens-induserende stimuli. Således har hjerteglykosider faktisk senolytiske
Fig.3 Ouabain er ikke i stand til å indusere senolyse i etoposid-behandlede senescent END-MSCs. Validering av den episodeinduserte senescensmodellen for END-MSCs: en spredningsevne, b-cellestørrelse, c autofluorescensnivåer og d SA- -Gal-aktivitet, e-fosforyleringsnivå av Rb og ekspresjonsnivåer av p21- og HMGBI-proteiner. f Relativ cellelevedyktighet ( prosent ) av kontroll- og senescentceller etter behandling med 10-6 ouabain. Verdiene er gjennomsnitt±SD. For flere grupper ble sammenligninger ved en enveis ANOVA brukt,n=3, ns ikke signifikant,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">
Til slutt bestemte vi oss for å reprodusere analyseeksperimenter på etoposid-behandlede leverkreftceller SK-Help, en annen cellemodell med påvist senolytiske effekter av hjerteglykosider ifølge Guerrero et al. studie [25] (Fig.9a-e). Etoposid-behandlet senescent SK-Help viste høyere følsomhet overfor begge midlene sammenlignet med kontrollmotpartene, og beviste den hemolytiske virkningen av hjerteglykosider mot denne celletypen (fig.9f og tilleggsfig. S7).
Sammen viser disse dataene at selektiviteten til hemolyse indusert av hjerteglykosider er mer avhengig av cellenatur enn på den konkrete senescensutløseren.
Denne artikkelen er hentet fra Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x
