Forbedrer top-down proteomikk i hjernevev med FAIMS del 2

Dataanalyse

Proteoformidentifikasjon ble utført med TopPIC versjon 1.3.53 Innstillinger for TopPIC inkluderte et forløpervindu på 3 m/z (for å ta hensyn til isotopisk konvolutt), en massefeiltoleranse på 15 ppm, en maks/min ukjent masseforskyvning på 500 Da og et maksimum antall tillatte ukjente modifikasjoner på 1.

De siste årene har flere og flere studier vist at det er en nær sammenheng mellom proteinmorfologi og hukommelse. Proteiner er de mest grunnleggende molekylene i livsaktiviteter. De kan kontrollere livsaktivitetene til cellene og opprettholde normal drift av menneskekroppen. Studier har funnet at morfologien til proteiner ikke bare spiller en viktig rolle i cellelivsaktiviteter, men har også et uatskillelig forhold til hukommelsesfunksjonen i hjernen. Når morfologien til proteiner endres, vil det påvirke forbindelsen mellom nevroner, og dermed påvirke folks hukommelsesevne.

I de tidlige stadier av livet spiller endringer i proteinmorfologi en viktig rolle i utviklingen og funksjonen til hjernen. Hvis morfologien til proteiner ikke er som den burde være, vil det forårsake en rekke nevrologiske problemer, som til slutt fører til hukommelsestap, kognitiv svekkelse og så videre.

Det er imidlertid ingen grunn til bekymring. Moderne medisinsk teknologi har tillatt folk å justere morfologien til proteiner gjennom kostholdet for å forbedre hukommelsen. Et rikt og variert kosthold er rikt på proteiner, men når du velger protein, prøv å velge mat med lite fett, lavt kolesterol og lavt karbohydrat for å unngå de negative effektene av overdreven inntak på kroppen.

Kort sagt, proteinmorfologi og minne er uatskillelige. Vi bør ta hensyn til et sunt kosthold og balansert proteininntak for å opprettholde god helse og samtidig opprettholde god hukommelse. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche kan forbedre hukommelsen betydelig fordi den har antioksidant-, anti-inflammatoriske og anti-aldringseffekter, som kan bidra til å redusere oksidasjon og inflammatoriske reaksjoner i hjernen, og dermed beskytte helsen til hjernen. nervesystemet. I tillegg kan Cistanche også fremme vekst og reparasjon av nerveceller, og dermed forbedre tilkoblingen og funksjonen til nevrale nettverk. Disse effektene kan bidra til å forbedre hukommelsen, læreevnen og tenkehastigheten, og kan også forhindre forekomsten av kognitiv dysfunksjon og nevrodegenerative sykdommer.

Klikk på Know for å forbedre korttidshukommelsen

MS2-spektra ble søkt mot en database sammenkoblet med oppføringer fra Homo sapiens Swiss-Prot (20.352), Swiss-Prot-spleisevarianter (22,000) og TrEMBL (54.436), så vel som vanlige forurensninger. Identifiserte proteoformer ble filtrert til en falsk oppdagelsesrate (FDR) på 1 % gjennom TopPIC.

Nedstrøms dataanalyse ble utført i R-miljøet for statistisk databehandling og figurgenerering.54 I nedstrømsanalyse ble proteoformer fra samme gen med de samme start- og sluttaminosyrene som ble funnet å være innenfor ±5 Da kombinert som en enkelt proteoform for å øke stringensen av våre oppdrag.

Selv om 5Da-terskelen er vilkårlig, kompenserte denne tilnærmingen for feil tilordnede monoisotopiske topper, tvetydighet i ukjente masseskift og andre artefaktuelle avvik. For å bestemme det relative standardavviket (RSD) til proteoformer i replikater, brukte vi "funksjonsintensitet"-utgangen fra TopPIC.

Fragmenteringssekvensdekningskart og tilhørende spektre ble generert ved bruk av LCMsSpectator-programvaren.55

Spesifikke innstillinger for LCMsSpectator inkluderte en forløperiontoleranse på 10 ppm, en produksjonstoleranse på10 ppm, en minimum S/N-terskel på 1,5, en Pearson-korrelasjonsterskel på 0,7, en standardutjevning på 9 poeng, og en forløper isotop relativ intensitetsterskel på 0,1.

RESULTATER OG DISKUSJON

Tilsetning av FAIMS øker kraftig proteomdekningen

Cortex-vevsprøven fra en pasient diagnostisert med Alzheimers ble behandlet etter arbeidsflyten, som vist i figur 1. Vi forsøkte først å analysere ytelsen til FAIMS på forskjellige CV-er sammenlignet med de uten FAIMS (referert til som "Ingen FAIMS").

Det er verdt å huske at FAIMS-grensesnittet produserer et beskjedent tap av ioneoverføring, antagelig på grunn av den lengre ionebanen gjennom kilden.56 Derfor, for bedre å representere typiske forhold og sikre rettferdige sammenligninger, ble "No FAIMS"-dataene samlet inn ved bruk av samme prøve uten FAIMS-enheten er installert.

Disse "No FAIMS"-dataene ble samlet inn i tre eksemplarer og analysert i henhold til arbeidsflyten, som vist i figur 1 med en topp 6 DDA MS2-analyse. "No FAIMS"-datasettene identifiserte i gjennomsnitt 754 ± 35 proteoformer (figur 2A og tabell S1) og kollektivt identifiserte 1073 unike (ikke-redundante) proteoformer (Figur 2B) avledet fra 293 unike gener (Figur 2C), som dekker 29 359 aminosyrer på tvers av proteomet (Figur 2D).

Den metriske "proteomdekningen" (figur 2D) er definert som ikke-redundante aminosyrer dekket av hver proteoforms sekvens. I hovedsak står denne metrikken for både lengden og mangfoldet til de identifiserte proteoformene.

Vi anser dette for å være en mer balansert beregning sammenlignet med det rå antallet proteoformer og gener, da det unngår skjevheter mot mindre proteoformer. Selv om enkle tellinger av proteoformer eller gener er intuitive, ser disse beregningene ut til å være sterkt påvirket av korte proteolytiske fragmenter. FAIMS-datasettene ble samlet inn fra -50 til -20 CV skannet i trinn på 5 V.

Hver av de resulterende 7 CVene ble samlet i tre eksemplarer. Når det gjelder proteoformer og gener, presterte FAIMS "Ingen FAIMS" for alle CV-ene som ble testet innenfor -50 til -30 CV-området (Figur 2A–C).

For eksempel identifiserte de tre datasettene ved -50 CV 1833 ± 17 proteoformer, en gjennomsnittlig økning på ~140 % per kjøring sammenlignet med "Ingen FAIMS". Til sammen identifiserte disse tre datasettene ved -50 CV 2564 unike proteoformer fra 530 unike gener som dekker totalt 43 437 aminosyrer, en økning på henholdsvis 95, 69 og 69 % i forhold til de tre "NoFAIMS"-datasettene (Figur 2B–D). og tabell S1).

Selv om FAIMS ved -25V observerer færre unike proteoformer og gener sammenlignet med "Ingen FAIMS", er proteoformene selv mye lengre i gjennomsnitt. Når man vurderer proteoformlengde (Figur 2D), dekker −25 V-datasettene nesten like mange aminosyrer fra proteomet (28.398) i forhold til "No FAIMS" (29.359), og gjør det med bare halvparten så mange proteoformer (Figur 2B) ).

Vi undersøkte også om FAIMS kunne gi en like robust og reproduserbar analyse sammenlignet med uten FAIMS. Vi vurderte kvantifiseringsreproduserbarhet ved å beregne RSD (ekvivalent med variasjonskoeffisienten) for hver proteoforms funksjonsintensitet, forutsatt at proteoformen oppfylte kriteriet om å bli observert på tvers av alle tre replikatdatasettene for hver CV-innstilling.

Fordi FAIMS- og "No FAIMS"-datasettene alle ble samlet inn fra en enkelt biologisk prøve, bør variasjonen mellom replikatene utelukkende tilskrives instrumentelle faktorer.

Boksplottet i figur 3 (så vel som individuelle histogrammer i figur S1) viser hvordan fordelingen av RSD-er sammenlignes mellom FAIMS- og "No FAIMS"-datasettene.

Basert på median RSD, resulterte tillegget av FAIMS i lignende eller litt forbedret kvantifiseringskvalitet i forhold til "Ingen FAIMS". Forbedringen i RSD-er blant lavere spenninger (-20 til -30 CV) kan være relatert til observasjonen av at færre proteoformer overføres innenfor dette området, noe som gir høyere kvalitet MS1-spektra og derfor bedre estimater av funksjonsintensitet.

Videre er det verdt å merke seg at RSD-ene bestemt fra disse replikatene ligner på tidligere top-down55 og bottom-up57,58 eksperimenter utført med lignende instrumentering.

Til sammen viser disse dataene at tillegget av FAIMS til TDP kraftig øker proteoformidentifikasjoner, uten at det går på bekostning av kvantifiseringskvalitet.

Vi undersøkte deretter overlappingen i identifiseringer mellom CV-ene, som kunne gi det største ikke-overflødige settet med observasjoner.

Ved å bruke overlappskoeffisienter, definert som skjæringspunktet mellom to sett delt på det minste av de to settene, bestemte vi likheten mellom hvert datasett. Den totale gjennomsnittlige overlappingskoeffisienten for både proteoform- og genidentifikasjoner innenfor hver FAIMS CV var 0.76.

Dette er sammenlignbart med overlappskoeffisienten fra «No FAIMS»-datasett (0.77), noe som tyder på at de tekniske replikatene viser lignende reproduserbarhet. Et varmekart som viser FAIMS-overlappingskoeffisientene til proteoforms og gener er vist i henholdsvis figur 4 og S2.

Spesielt er overlappingen av genidentifikasjoner over CV-rommet mye større i forhold til proteoformer, selv om det er spesielt merkbart når man sammenligner de lengste CV-avstandene.

For eksempel er overlappingen mellom −50 og −20 CV 0,64 på gennivå og 0,06 på proteoformnivå. Dette var forventet da hvert gen potensielt kan representeres av flere proteoformer.

Figur 4 viser at mens en forskjell på 5−10 V i CV gir overlappingskoeffisienter for det meste over 0,5, gir avstander større enn 15 V større grad av ulikhet og er derfor bedre plassert for å fange opp tilstrekkelig forskjellige sett med proteoformer.

Med disse datasettene forfulgte vi deretter å bestemme hvilke kombinasjoner av CV-er som er optimale for å oppnå maksimale genidentifikasjoner, proteoformidentifikasjoner og sekvensdekning med begrensninger på antall CV-er for hver kombinasjon.

Først etablerte de optimale kombinasjonene for et hvilket som helst antall CV-er fra 1 til 7 ved å bruke beregningene for unike proteoformer, gener og proteomsekvensdekning (Figur 5).

Ved å bruke kombinasjoner begrenset til tre CVer som et eksempel, viser figur 5A, B hvordan -35, -40 og -50 V er ideelle hvis man ønsker å maksimere antallet proteoformer eller gener.

Proteoformene og genene identifisert i disse tre CV-ene (ni datasett) dekker 84 % av de totalt unike proteoformene og 92 % av de totale genene over hele settet med 21 datasett.

Når man veier en proteoforms lengde med sekvensdekning som metrikk, er den ideelle kombinasjonen −30, −40 og −50 CV, som dekker 88 % av de unike aminosyrene fra alle 21 FAIMS datasett med bare et beskjedent tap av proteoform og genidentifikasjoner ( 4221 proteoformer og 723 gener, figur 5C). Imidlertid inkluderer disse kombinasjonene alle replikater og representerer de maksimale identifikasjonene som kan oppnås for en gitt kombinasjon av CVer. Derfor, for å demonstrere fordelen med ekstern CV-stepping, bestemte vi oss for å undersøke hvilke tall som med rimelighet kunne oppnås i gjennomsnitt med bare tre kjøringer, der hver kjøring er en forskjellig CV.

Ved å bruke −50, −40 og −30 V datasett som eksempel, bestemte vi de gjennomsnittlige unike proteoformene, unike gener og proteomsekvensdekninger basert på de 27 unike kombinasjonene fra de tre forskjellige replikatene i hver CV.

Basert på denne analysen kunne vi oppnå 2986 (±46) unike proteoformer og 618 (±12) unike gener som dekker 64 534 (±1089) aminosyrer i gjennomsnitt. Sammenlignet med "No FAIMS" tredobbelte datasett, som identifiserte 1073 unike proteoformer og 293 unike gener som dekker 29 359 aminosyrer, kan ekstern CV-trinn ved -50, -40 og -30 V mer enn doble hver metrikk.

Ikke desto mindre vil den optimale kombinasjonen av CV-er sannsynligvis også avhenge av organismen og vevet prøven er avledet fra, prøveprepareringstrinnene som ble brukt, samt eventuell ekstra offline fraksjonering implementert før LC-MS-analyse.

Totalt sett, når det tas sammen med overlappingsanalysen (figur 4), antyder det at 15 V eller større avstander mellom CV-er gir minst mulig overlapping mellom proteoformer, mens 5-10 V-separasjon innenfor -50 til -30 CV maksimerer gener, proteoformer og proteomer. sekvensdekning.

For ytterligere å bestemme virkningen av FAIMS på dybden av proteomdekning, sammenlignet vi genene identifisert fra våre ovenfra-og-ned-datasett med en typisk bottom-up-analyse av den menneskelige hjernen.

Omfattende nedenfra-og-opp-datasett av menneskelig hjernevev tillot oss å estimere forekomster for 8528 proteiner ved å bruke vektet spektraltelling.59–61 Proteiner ble kombinert i 10 forskjellige overflodspersentiler basert på spektraltellinger kompilert fra flere nedenfra-opp-datasett av den menneskelige hjernen.

Ved å kryssreferanse med våre ovenfra-og-ned-datasett, var vi i stand til å bestemme hvor genene og proteoformene er avledet fra og rangeres når det gjelder estimert proteinoverflod (ved hjelp av datasett-normaliserte spektraltall) i den menneskelige hjernen (Figur 6).

Gener som ble funnet i ovenfra-og-ned-analysen vår, men ikke referansesettet nedenfra og opp, ble lagret som "NA".

For more information:1950477648nn@gmail.com