TUNEL-analyse: Et kraftig verktøy for evaluering av nyreskade

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt:Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick-end labeling (TUNEL)-analyse er en veletablert analyse som brukes til å oppdage celledødsassosiert DNA-fragmentering (3'-OH DNA-termini) av endonukleaser. Fordi disse enzymene er spesielt aktive i nyrene, er TUNEL mye brukt til å identifisere og kvantifisere DNA-fragmentering og celledød i dyrkedenyre celler og nyrer fra dyr og mennesker som følge avgiftig eller hypoksisk skade. Den tidlige karakteriseringen av TUNEL som en apoptotisk analyse har ført til en rekke feiltolkninger av mekanismene tilnyrecelle skade.Likevel blir TUNEL stadig mer populært fornyreskadevurdering fordi den kan brukes universelt i dyrkede celler og vevsceller og for alle mekanismer for celledød. Videre er den sensitiv, nøyaktig, kvantitativ, lett koblet til bestemte celler eller vevsrom, og kan kombineres med immunhistokjemi for å tillate pålitelig identifikasjon av celletyper eller sannsynlige mekanismer for celledød. Tradisjonelt har TUNEL-analyse vært begrenset til tilstedeværelse eller fravær av et TUNEL-signal. Imidlertid kan tilleggsinformasjon om mekanismen for celledød fås fra analysen av TUNEL-mønstre.

seksuell opphisselse nyrelidelse behandling med cistanche supplement pulver

Introduksjon DNA er det eneste molekylet i cellen som kan repareres, men det kan ikke resyntetiseres fullstendig etter skade. DNA-ødeleggelse er en av de siste stadiene av en flertrinns celledødsprosess, som potensielt er reversibel inntil punktet for terminal DNA-fragmentering. Derfor er sistnevnte en vanlig egenskap og mekanistisk markør for irreversibel celledød [1,2]. Celledødsassosiert DNA-fragmentering blir vanligvis "visualisert" av den terminale deoksynukleotidyltransferase dUTP nick-end labeling (TUNEL)-analysen, DNA-laddering eller kometanalysen [3]. Pulsfeltelektroforese [4] og tilfeldig oligonukleotid-primet syntese (ROPS) analyse [5] er to andre sjelden brukte sekundære analyser. Bruken av kometanalyse er begrenset til kun in vitro (dyrkede celler), og kvantifiseringen er arbeidskrevende [6]. Det er mulig å utføre kometanalyser i isolerte cellekjerner, men det er assosiert med ytterligere forvirrende faktorer under isolering av kjerner. Den andre, DNA-laddering-analysen, er ikke en kvantitativ metode, og det første håpet om at stigemønsteret vs. smear skulle skille mellom henholdsvis apoptose og nekrose, ble fordrevet da denne tilnærmingen viste seg å være upålitelig [7]. Av de tre hovedmetodene er TUNEL den mest sensitive, minst tidkrevende og mest universelt anvendelige. Den kan brukes i dyrkede celler og vev og for alle celledødsmekanismer. Den er nøyaktig, kvantitativ, lett koblet til bestemte celler eller vevsrom, og kan kombineres med immunhistokjemi for å tillate pålitelig identifikasjon av celletyper eller mekanismer for celleskade assosiert med TUNEL-positive signaler [2].

DNA-brudd som kan måles av TUNEL produseres hovedsakelig av apoptotiske endonukleaser. De mest aktive endonukleasene i nyrene er deoksyribonuklease 1 (DNase I) og endonuklease G (EndoG) [8–10]. DNase I er den mest aktive og rikeligste apoptotiske endonukleasen hos pattedyr [11]. Nyrene, spyttkjertlene, bukspyttkjertelen og tarmen er organer som er kjent for å produsere store mengder DNase I. Epitelceller i spyttkjertler, bukspyttkjertel og tarm skiller ut DNase I som et fordøyelsesenzym i fordøyelseskanalen. Noen cellulær DNase I kjemper mot "fremmede" DNA-invaderende vertsceller [12]. Ikke-utskilt DNase I utgjør en skjult fare for vertscelle-DNA, men normalt virker ikke DNaser på vertscelle-DNA før skade eller cellens død. I nyrene skilles DNase I ut av tubulære epitelceller, antagelig for å ødelegge virus og bakterier i urinen. Denne funksjonen finner sannsynligvis sted i forbindelse med proteinaser, spesielt meprin, som er hovedproteinasen i urinen [13]. Selv om det er beskyttende mot infeksjon, gjør tilstedeværelsen av svært aktiv DNase i nyren dette organet sårbart for skade, hvor aktiviteten til DNase er kjent for å være cytotoksisk for vertsceller. DNaser fremmer celledød indusert av toksiske eller hypoksiske stimuli og ødelegger alle vertsnyre-DNA-celler som frigjøres som et resultat av celledød.

Nyrerer filtrerende organer som fjerner giftige forbindelser fra kroppen. Høy DNase I-aktivitet i nyrene gjør nyrecellene svært følsomme for skader fra giftige forbindelser og deres metabolske produkter. Dette gjør TUNEL til den mest hensiktsmessige og anvendelige metoden for å måle skade på nyrene. I denne gjennomgangen vil vi fokusere på TUNEL som en mye brukt, informativ og presis analyse for måling av celledød og vevsskade i nyrene. Vi vil diskutere aspekter ved TUNEL når det gjelder nyresykdommer og skader og identifisere kvaliteter, teknikker og underbrukte funksjoner ved TUNEL for å fremme produktiv og hensiktsmessig bruk av denne kraftige analysen i forskning, diagnostikk og terapi av nyresykdommer. Vi vil også diskutere ulike TUNEL-bildemønstre som kan knyttes til celledødsmekanismer. Punktene som er tatt opp i denne gjennomgangen er bredt anvendelige for bruk av TUNEL i andre organer enn nyrene.

Nøkkelord:TUNEL; celledød; nyre; DNaser; endonukleaser; vevsskade

TUNEL-prinsipperTUNEL-analysen ble utviklet i 1992 av Gorczyca et al. [14] og Gavrieli et al. [15], ved bruk av henholdsvis fluorokrom og avidin-peroksidasemerking. På den tiden var det et desperat behov for nye metoder for å vurdere apoptose, og TUNEL fylte dette gapet. Opprinnelig markedsført som en analyse for DNA-trådbrudd under eller assosiert med apoptose [14,16], i fravær av bedre analyser, ble TUNEL raskt standardanalysen for apoptose [17,18]. Imidlertid ble det nesten umiddelbart anerkjent av forskere at TUNEL målte enhver DNA-fragmentering tilfeldig, ikke bare den som var forbundet med apoptose [19–21]. Likevel var behovet for apoptotiske analyser så stort at de sjeldne rapportene om at TUNEL var uspesifikke for apoptose generelt ble ignorert. Dette førte til en enorm mengde falske positive rapporter om apoptose i nyrene og andre organer, i en grad hvor opptil 20 prosent av totale celler ble rapportert apoptotiske selv uten skade [22–25] når endringer som liten som 0,01 prosent kan være statistisk signifikant bevis på vevsskade.

TUNEL-analysen har opplevd en renessanse de siste årene siden slutten av boomen i apoptosestudier for noen år siden. Vårt PubMed-søk etter tidsskriftartikler som involverer "nyre" og "TUNEL"-termer ga over 1500 resultater fra 1992 til 2020. I 2019 ble det publisert 170 artikler, det høyeste antallet på et enkelt år de siste 28 årene (Figur S1) og som utgjør flertallet av artiklene som er undersøkt for denne anmeldelsen. Tallrike studier brukte TUNEL-positivitet som et universelt mål på DNA-fragmenteringsassosiert celledød i andre typer celledød bortsett fra apoptose. For eksempel kan ferroptose, en nyoppdaget form for programmert, ikke-apoptotisk celledød utløst av oksidativ skade som oppstår under nyreiskemi-reperfusjon (IR) hos mus, oppdages av TUNEL [26]. Pyroptose, som er en inflammatorisk form for programmert celledød som er forskjellig fra apoptose og nekrose, er vist å være assosiert med TUNEL-positive signaler [27,28]. TUNEL-positivitet ble observert under nekroptose som bidro til progressiv uttømming av nyretubuliceller hos rotter som ble utsatt for subtotal nefrektomi [29]. I nyrene og annet vev er positive TUNEL-signaler funnet ved nekrose [30,31], dysregulert autofagi [32–35], anoikis [36,37], mitotisk katastrofe [35,38], autolyse [39], Pautolyse [39], proptosis [40] og aponeurosis [30], som viser at TUNEL er en virkelig universell analyse for irreversibel celledød.

TUNEL-analysen er basert på merking av 3'OH-ender med et 3'OH-endespesifikt DNA-enzym, terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) (figur). Bruken av DNA-polymerase eller Klenow-fragment DNA-polymerase i stedet for TdT kan bidra til å bestemme typen 3'OH-ender (hakk, hull eller overhengende oligoer) fordi DNA-polymeraser trenger en mal (den motsatte DNA-strengen) og vil derfor ikke merke hengende eller utstående DNA-ender. Det er viktig å huske at produksjonen av 3ZOH DNA-ender ikke er unik for apoptotiske (DNA-nedbrytende) endonukleaser. 3'OH DNA-ender er et viktig "kommunikator"-signal, en fellesnevner for flertallet av DNA-enzymer. De produseres og brukes av nesten alle DNA-enzymer i eukaryoter, inkludert DNA-reparasjonsendonukleaser (apurin/apyrimidinic, AP), eksonukleaser, DNA-polymeraser, DNA-ligaser, DNA-transferaser og topoisomeraser. I tillegg kan 3'Id 3z-sukker eller 3z-proteinkonjugater omdannes til 3'OH-termini av henholdsvis fosfataser, glykosylaser og proteinaser. Dette er grunnen til at en presis forståelse av hva som måles er nødvendig for vellykket anvendelse av TUNEL og tolkning av resultatene.

Sammenlignet med to andre primære metoder for DNA-fragmenteringsmåling, DNA-stige og kometanalyse, har TUNEL fordelen av å være basert på identifisering av DNA-termini i stedet for fragmenter (Figur 2). Teoretisk sett burde TUNEL være mer følsom og lineær for identifisering av initial (lav) DNA-fragmentering enn DNA-stige eller komet, som begge har en etterslepperiode med akkumulering av små høymobilitetsfragmenter. I alle fall har studier som kombinerer TUNEL med enten komet )41,42] eller DNA-stige [43,44] en fordel med å fange tidlig DNA-fragmentering med maksimal følsomhet.

TUNEL-applikasjonerTUNEL brukes til å identifisere og kvantifisere nyreskade i kliniske og grunnleggende toksikologiske studier i en rekke bruksområder, inkludert medisinske behandlinger [45], miljømessige [46], landbruks [41] og industrielle [47] eksponeringer og dyr [48] ] og matvitenskap [49]. TUNEL gjelder for alle celletyper, organer og arter som har DNA og DNaser, som inkluderer omtrent alle arter. TUNEL har blitt brukt til å identifisere og kvantifisere nyreskade hos et bredt spekter av dyr, inkludert sebrafisk [50], japansk risfisk [51], kyllinger [48], ørkenrotte [52], mus [41], rotter [45], rabb sin [53], minigriser [54] og mennesker [55]. En viktig fordel med TUNEL er at den kan brukes i fikserte dyrkede celler så vel som fiksert vev. Dette gir metodisk konsistens for sammenligning mellom in vitro og in vivo resultater i studier der mekanismer kan undersøkes i dyrkede nyreceller, mens in vivo implikasjoner vurderes i dyrets nyrer. Alt mellom hele celler og vev kan også brukes, inkludert dyrkede cellesfæroider [56] og ex vivo nyreskiver [57,58].

Intensiteten til TUNEL når det gjelder signalstyrken eller antall TUNEL-positive celler kan variere mellom arter avhengig av aktiviteten til DNaser. Etter vår erfaring har rottenyre mer aktiv DNase I enn musenyre, og TUNEL-positiv signalstyrke korrelerer med dette. Når nyren sammenlignes med andre organer, er dens TUNEL-positive signal veldig intens og ligner på andre organer med høy DNase I-aktivitet, som tarmen og spyttkjertelen. I den andre enden av spekteret er den laveste TUNEL-positive signalstyrken observert i hjerne og tumor/kreftceller, hvor DNase I-ekspresjon mest sannsynlig inaktiveres av alternativ spleising i kodingsområdet [59]. TUNEL-positivt signal observeres i alle celletyper i nyrene. I gjennomsnitt skades det tubulære epitelet oftere enn glomeruli, spesielt ved akutte skader (Figur 3A). Dette korrelerer godt med DNase I-aktiviteten som råder i disse celletypene. Ut fra kjønns- og aldersforskjeller observert i våre eksperimenter, er DNase I mer rikelig og aktiv hos hanner enn hos kvinner og middelaldrende dyr sammenlignet med gamle eller nyfødte dyr. Imidlertid er det ingen tydelig forskjell i TUNEL-positivitet i forhold til kjønn eller alder, sannsynligvis fordi den fremtredende eller domineres av andre faktorer. I noen nyremodeller (som iskemi-reperfusjon) induseres DNase I [9]; mens i andre er det ikke og kan til og med undertrykkes (for eksempel ved cisplatin-toksisitet) [10]. Aktivering av endonukleaser, hvis tilstede, har vist seg å skje innen de første 24 timene etter nyreskade [9,60,61]. Derfor var det ikke overraskende at minst halvparten av TUNEL-applikasjonene i nyreforskningen i denne oversikten ble brukt til akutt nyreskade (AKI) siden vurderingen av AKI ofte gjøres innen 24 til 72 timer etter skade når endonukleaser er mest aktive . Listen over AKI-studier er lang og inkluderer toksiske, septiske, transplantasjons- og hypoksiske skader. I dette arbeidet undersøkte vi modellene, eksponeringstyper, behandlinger, vurderingstidslinjer og celletyper som ble berørt i disse studiene. Studiene som ble undersøkt dekket akutte og blandede akutt-kroniske former for nyreskade og kronisk nyresykdom.

Hvorvidt nyreskade med et TUNEL-positivt signal observeres i tubuli eller glomerulus avhenger av typen skadelig middel eller sykdom. For eksempel ble lupus nefritis hos mennesker og nikkel nanopartikkelskade beskrevet som å ha strengt glomerulære TUNEL-positive signaler [62,63]. På den annen side produserte iskemi-reperfusjon og streptozotocin-indusert diabetisk nefropati hos rotter TUNEL-positive celler kun i tubuli [64,65]. Proksimale tubuli, Henles løkke, distale tubuli og kollektive kanaler er ofte TUNEL-positive i iskemi-reperfusjonsmodeller. TUNEL-positive celler i både glomeruli og tubuli ble beskrevet hos rotter eksponert for legemidler som ciklosporin A [66] og doksorubicin [67] eller forbrukerproduktmaterialer som sinkoksid-nanopartikler [68] og i en rottemodell av diabetes mellitus [68] 69]. Septisk sjokk-indusert AKI hos mennesker var også assosiert med både glomerulære og tubulære TUNEL-positive celler [70]. strangulert lukket sløyfe tynntarmsobstruksjon forårsaket TUNEL-positivitet i nyrene i 3 timer [87].

AKI kan oppstå etter transplantasjon og hypoksiske skader. Allograftavstøtning hos mennesker er ofte assosiert med økningen av TUNEL-positive celler [88,89]. Etter kald iskemi ble TUNEL-positive celler vanligvis observert innen 2–24 timer under reperfusjon [90], eller mer snevert, mellom 14 og 17 timer etter iskemi [91], og noen ganger er vi fortsatt observert så sent som 7 dager i transplantasjonsavvisning [92]. Tilsvarende, i iskemi-reperfusjonsmodeller, ble TUNEL-positive celler oftest observert 24 timer etter reperfusjon [44,93,94], eller innenfor området mellom 4 [95,96] og 72 timer [97]. I både transplantasjons- og iskemiske AKI-studier ble TUNEL-positive celler lokalisert til distale og proksimale tubulære epitelceller [44,93]. I musnyreretter iskemi-reperfusjonsskade ble TUNEL-positive celler beskrevet som konsentrert i det kortikomedullære krysset, det vanlige målet for iskemisk skade [98].

Blandet akutt og kronisk skade, der toksiske eksponeringer, sykdomstilstander og/eller vurderinger var både akutte (dvs. timer, dager) og kroniske (dvs. uker, måneder, år) i samme studie, ble observert i menneskelig transplantasjon avvisning (biopsi 1 uke til 3 år etter transplantasjon) [88], hepatitt E-virusinfeksjon hos svin (7 og 14 dager etter inokulering) [52], CO2 pneumoperitoneum-indusert stress i hydronefrotiskenyrer(2 uker hydronefrose, 2 dager post-pneumoperitoneum) [53], mesangial proliferativ glomerulonefritt indusert av slangegift (1 til 14 dager etter injeksjon) [99], unilateral ureteral obstruksjon (1 til 14 dager med obstruksjon) [100], uranylacetateksponering (1 til 28 dagers eksponering) [101], aristokolsyrenefropati (5 og 30-dagers daglig eksponering) [102], og neonatal hyperoksi (testet 1 til 60 postnatale dager, eksponert for hyperoksi først 14 dager) [103]. Fjorten dager etter påvirkning er et svært vanlig vurderingstidspunkt for denne typennyreskader[52,53,99,101,103]. I de fleste tilfellene var TUNEL-positive celler lokalisert i tubuli og kollektive kanaler. Det eneste unntaket var slangegifttoksisitet, som først og fremst skadet glomeruli [99].

Kronisknyresykdom (CKD), definert som tilstedeværelse avnyreskade eller redusert glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) hos mennesker i mer enn 3 måneder, er også et vanlig emne for TUNEL-vurdering, som kan avgjøre om CKD er assosiert med progressivnyreskade.Den mest studerte CKD der TUNEL brukes er diabetisk nefropati. Skaden identifisert av TUNEL-positivitet skjedde i tubuli og podocytter [69] hos diabetespasienter med utbrudd av diabetes før TUNEL-testing varierende fra 7 til 30 år [104,105] og 2 til 16 uker etter streptozotocinbehandling hos gnagere [106,107]. Lignende TUNEL-positiv histopatologi ble rapportert ved immunglobulin A nefropati [22]. Ved lupus nefritt og membranproliferativ glomerulonefritt ble TUNEL-positivitet først og fremst sett i glomeruli [62,108,109]. På den annen side observerte legemiddelsikkerhetsstudier av cisplatin [110], klorokin [45], doksorubicin [67], finasterid [23], takrolimus [111] og levetiracetam [24] hovedsakelig tubulær skade. Likeledes ble den fortsatte akutte skaden identifisert av tubulære TUNEL-positive celler beskrevet i studier av urinsyrenefropati [112], metioninmangel [48], eksponering for miljøgifter mikrocystin-LR [50] og kadmium [113] og i assosiasjon med kalsium-oksalat indusertnyresteiner [114] og forkalkende nanopartikler [115]. Mens identifisering av den progressive nyreskaden under CKD ved å bruke TUNEL-analysen er et nyttig diagnostisk verktøy, vil det å kombinere TUNEL-analysen med immunhistokjemi (IHC) kanskje være enda mer informativt for å bestemme skademekanismen.

TUNEL kvantifiserings- og samlokaliseringsteknikker

Metoder for TUNEL kvantifisering varierer. I de fleste rapportene er TUNEL-positive celler/kjerner kvantifisert som prosenten av totale celler/kjerner [83,116,117]. Dette virker som den rette tingen å gjøre, selv om antallet TUNEL-positive celler sannsynligvis ikke samsvarer nøyaktig med antall døde celler. Noen celler har kanskje ikke nådd identifiserbare nivåer av DNA-fragmentering, mens andre allerede kan ha blitt eliminert av makrofager. Kvantifisering av antall TUNEL-positive celler per kvadratenhet (mm2) brukes også [118], men denne metoden virker mindre presis fordi den avhenger av plassering og celletypeinnhold i områdene. Kortikale seksjoner inneholder for det meste glomeruli, tubuli, blodårer og medullære stråler, mens medullære seksjoner primært inneholder løkker av Henle, samlekanaler og blodårer. Kvantifisering "per felt" avhenger absolutt av hva feltet er [72.119], og kvantifisering "per seksjon" er, enda mer, udefinert [61.120]. Dårlig identifiserte målinger, som "histologisk poengsum" [121], "apoptotisk indeks" [113], "apoptoserate" [92], "prosent av apoptose" [122], eller prosentandel av ubehandlet kontroll [123,124], ser ut til å være enda mindre hensiktsmessig, og gjøre tolkning vanskelig og ikke sammenlignbar med de fleste studier.

Celledød i naboceller starter ujevnt fordi den avhenger av vaskularisering, cellesyklus og andre variabler. Dette resulterer ofte i ujevn TUNEL-farging av celler i vevet [45,96,125]. Overraskende nok brukes ikke den generelle intensiteten til det TUNEL-positive signalet til TUNEL-måling, til tross for at det er direkte avhengig av graden av DNA-fragmentering. Dette er kanskje fordi celler anses som døde uavhengig av intensiteten til TUNEL-signalet, da en celle ikke kan være "mer død" hvis TUNEL-fargingen er mer intens. Selv om det er vanskelig å sammenligne studier som bruker en lang rekke metoder for å kvantifisere TUNEL-resultater, er mengden TUNEL-positive celler i kontrolldyr vanligvis under 2 prosent [75,99,100,116,126]. En akutt skade er assosiert med en ~5–40× økning i TUNEL-positivitet [79,126,127]. Under kronisk skade er økningen i TUNEL-positive celler litt lavere, ~2–20- ganger, [29,43,65] sammenlignet med ubehandlede kontroller.

Den første TUNEL-analysen basert på diaminobenzidin (DAB)-farging ble designet for lysmikroskopi [14,15]. Denne tradisjonelle metoden ble fortsatt brukt i to tredjedeler av studiene som ble undersøkt i denne oversikten og i det overveldende flertallet av humane biopsistudier. Kvantifiseringen gjøres ved manuell celleteller, og selv om den er nøyaktig, er den tidkrevende. Ofte brukes ikke kvantifisering i det hele tatt, og resultatene presenteres ved hjelp av bilder av behandlede og fargede prøver som enkle bevis på at celledød fant sted. Automatisering kan øke hastigheten på kvantifiseringsprosessen [128,129]. DAB kan imidlertid ikke kombineres med noen annen farging i samme prøve, og dermed kan DAB-basert TUNEL kun gi antall døde celler, uten noen identifikasjon av celletype (unntatt visuell gjenkjenning) eller celledødsmekanisme.

Mens studier på mennesker i overveiende grad er avhengige av DAB-basert TUNEL ved bruk av lysmikroskopi, bruker omtrent halvparten av dyrestudiene FL-fluorescerende mikroskopi (figur 3). Fluorescerende TUNEL er visuelt attraktivt, lett å tolke, og har flere store fordeler. I tillegg til presis kvantifisering ved identifikasjon av TUNEL-positive kjerner eller gjennomsnittlig intensitet av fargen, kan FL-fluorescerende TUNEL-signal kolokaliseres med andre farger for histokjemi (f.eks. DAPI) (figur 3A) eller IHC (figur 3B). I sistnevnte kan bruk av proteinmarkører bidra til å identifisere TUNEL-positive signaler assosiert med forskjelligenyrerom eller gi informasjon om type celledød. Vi kunne ikke finne noen eksempler på TUNEL kombinert med dobbel IHC-antistofffarging. Selv om en slik kombinasjon vil være svært informativ, for eksempel for identifisering av en celledødsmekanisme i visse celletyper, kan de tekniske vanskelighetene forbundet med slik farging oppveie fordelene.

Identifikasjon avnyrecelletype er absolutt ikke et problem for en erfarennyrepatolog [104]. På grunn av dette er bruken av tilleggsmarkører for celletypeidentifikasjon, for eksempel ved bruk av CD31 for identifisering av endotelceller [130], sjelden. Imidlertid brukes ofte bruk av IHC-proteinmarkører for karakterisering av vevsskade. De fleste studier bruker TUNEL-positivitet som eneste bevis på apoptose. I andre studier har erkjennelse av at TUNEL-positivitet ikke er spesifikk for apoptose ført til at mange morfologiske (f.eks. hematoxylin og eosin eller periodic acid-Schiff-farging), biokjemiske og IHC-markører kan kombineres med TUNEL-farging for å bekrefte apoptose. Den mest brukte markøren for kaspaseavhengig apoptose er spaltet (aktiv) kaspase-3 ved å bruke et antistoff som ikke gjenkjenner kaspasen i full størrelse-3 [131,132]. Både TUNEL og spaltet kaspase-3-analyser viste utelukkende tubulær, ikke glomerulær, farging i iskemi-reperfusjon hos rotter [64]. Andre kaspasestudier brukte kaspase-1 [27], -9 [53], -11 [28] og -12 [75]. Andre apoptotiske markører inkluderte B-celle lymfom 2 (Bcl2) familien av proteiner Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] og Bad [43]; apoptotisk reseptor Fas [52] og apoptotisk reseptor-ligand FasL [66]; forkhead box (FOX) proteintranskripsjonsfaktorer Fox01 [133] og Fox03 [27]; og cytokrom c [53]. Inflammasjon ble identifisert av IHC av tumornekrosefaktor-alfa (TNF) [134]; tumorvekstfaktorer TGF [66] og TGF- 1 [135]; serin/treoninkinase 1 (SGK1) [135]; elektronoverføringsflavoprotein, beta-underenhet (ETF) [136]; Janus kinase-2 (JAK2) [137]; signaltransduser og aktivator for transkripsjon 3 (STAT3) [137]; kjernefaktor kappa-lettkjedeforsterker av aktiverte B-celler (NF-κB) [137] og dets hemmerprotein IκB [137]. Tilnyreskadevurdering, nyreskademolekyl-1 (KIM-1) [24], aquaporin-1-kanal (AQP-1) [45], hypoksi-induserbar faktor {{7} }alfa-transkripsjonsfaktor (HIF-1) ​​[103], Asc-type aminosyretransportør-1 (Asc-1) [121], pattedyrmål for rapamycin (mTOR) [131] kinase , og transglutaminase II [89] ble brukt. Oksidativ nyreskade ble studert ved bruk av markører som 8-hydroksyguanosin (8OHdG) [102], nøytrofil gelatinase-assosiert lipocalin (NGAL) [102], NAD-avhengig deacetylase sirtuin-1 (SIRT1) [138] , og hem oksygenase 1 (HO-1) [90]. Kinaser ble intensivt studert, inkludert c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway [101], fosfoinositid 3-kinase/proteinkinase B/nukleær faktor erytroid 2-relatert faktor 2 transkripsjonsfaktor (PI3K/ Akt/Nrf2) pathway [46], pannexin-1 (PANX1) plasmamembran gap junction protein [26], og mitogenaktivert proteinkinase/ekstracellulær signalregulert kinase (MAPK/ERK) [26]. Studier av apoptotiske endonukleaser involverte caspase-aktivert DNase (CAD) [139], DNase I [108] og EndoG [139], og DNA-skademarkører inkluderte tumorprotein p53 (p53) [99] og dynamin-relatert protein 1 (PARP1) ) [66]. Noen studier fant også vurderingen av endoplasmatisk retikulum stressmediert apoptose og vevsskade nyttig [75].

Gitt et stort antall undersøkte mekanistiske studier og fordelen med å kombinere TUNEL med IHC-markører for identifisering av celledødsmekanismer, ville man forvente mange studier som bruker kolokalisering mellom de to. Analysen kan utføres ved en piksel-for-piksel-kolokalisering mellom TUNEL-positive celler og IHC-markører, IHC-markør-midlere intensitet i TUNEL-positive områder, eller TUNEL-positive signal betyr intensitet i IHC-markør-positive områder. Dessverre har denne fordelen med TUNEL blitt brukt i bare noen få studier. TUNEL-positive celler ble kolokalisert med spaltet caspase-3 inyretubuli under acetaminophen-toksisitet hos rotter [74]. IHC-kolokalisering med TUNEL-positivt signal tillot celledødsidentifikasjon av mesangiale celler under Habu-nefritt [99]. I lysmikroskopi ble kolokalisering med mekanistiske markører for toksisitet utført i seriesnitt, som rapportert av Ott et al. [89].

TUNEL problemer og begrensninger

Flere potensielle problemer kan oppstå og bør forventes når du arbeider med TUNEL. Den ene er at 30OH DNA-termini ikke bare forekommer under celledød som et resultat av endonukleasevirkning, men også som en normal mellommetabolitt i nesten alle enzymatiske reaksjoner med DNA. En primær cellefunksjon som produserer 30OH-termini er DNA-syntese, der mange Okazaki-fragmenter teoretisk kan produsere et falskt positivt TUNEL-signal, spesielt i svært sensitive modifikasjoner av analysen. Undernyreskade,DNA-reparasjon kan også bidra til falske TUNEL-positive signaler som et resultat av en AP-endonukleasevirkning. Massiv oksidativ nyreskade indusert av kjemisk (hydrogenperoksid, bleomycin) eller fysisk (gammabestråling) skade kan øke antallet 30OH-ender, og øke de falske positive TUNEL-avlesningene bortsett fra endonukleasemediert DNA-fragmentering.

Oftere og mer sannsynlig kan feil innstilte eksperimentelle forhold for TdT-reaksjonen (tid, temperatur, enzymatisk aktivitet eller kofaktorer) resultere i en kunstig forhøyet TUNEL-positiv signalbakgrunn. Selv om det forblir udefinert med hensyn til hva som anses som normal baseline for ubehandlede nyrevevsprøver, virker det plausibelt at rundt 1 prosent av totale celler vil være et rimelig antall. En bakgrunn på 10 prosent eller høyere er klart bevis på enten ukarakteriserte og uraffinerte analyseforhold eller et avvik fra passende prøvelagringsforhold.

Et annet problem å forvente er lav DNase I-aktivitet i noen celletyper (f.eks. endotel),nyrerom (f.eks. glomeruli) eller patologisk vev (f.eks. svulster). Disse cellene bør forventes å vise lav TUNEL-positivitet, ikke fordi de er skaderesistente, men fordi det ikke er nok endonukleaseaktivitet til å produsere et målbart signal i TUNEL. Vår erfaring er at selv endringer mellom {{0}},01 prosent og 0,1 prosent av TUNEL-positive celler kan være statistisk signifikante og brukes som solid bevis på nyreskade (av et annet vev).

Til slutt oppstår et problem med kvantifisering av TUNEL-farging når mengden av DNA-fragmentering er for høy, for eksempel ved sene stadier av celledød eller ved høyintensive skader, der gjenværende DNA ikke kan motfarges ordentlig med DAPI på grunn av demontering av dobbel helix (figur 3D). I disse tilfellene er TUNEL-positive signaler "hengende i luften", og tilsynelatende ikke assosiert med en kjerne. Det blir en patologs ansvar å tolke disse som TUNEL-positive celler i stedet for en artefakt. Med fluorescein-merket TUNEL er det en fare for å identifisere bakgrunnsautofluorescens i vev som TUNEL-positivitet [140]. I disse tilfellene anbefales bytte til rødt spektrum TUNEL [51,54].

TUNEL-mønstre som en kilde til tilleggsinformasjon

Flere TUNEL-mønstre kan tydelig skilles ut og brukes til å bestemme en potensiell mekanisme og grad av skade (tabell 1, figur 3). Vanligvis produseres et TUNEL-mønster som kun inneholder kjerne ved mild skade, mens sterkere skade (dvs. forhøyet eksponering) resulterer i sterkere farging og desintegrering av kjerner eller celler. Et strengt apoptotisk TUNEL-mønster er kjernefysisk fragmentering som et resultat av dannelse av apoptotiske kropper (figur 3E). Små fragmenter av TUNEL-positive kjerner, som sannsynligvis er apoptotiske legemer, ble sett i rotteiskemi-reperfusjon ved 24–72 timer [97]. Apoptotiske legemer ble også sett med TUNEL-merking av kjerner i det renale tubulære epitelet og interstitium 14 dager etter iskemi-reperfusjonsskade hos rotter [141]. Økende doser av lavendelolje reduserte TUNEL-mønstre som kun innebar nuklei og konverterte dem til nekrose-lignende TUNEL med cytoplasmatisk lekkasje [94]. Sistnevnte var et resultat av ødeleggelse av kjernekappe på grunn av virkningen av proteinaser og lipaser i nekrose. Cytoplasmatisk TUNEL (Figur 3F) sett som et TUNEL-positivt cytoplasma ble observert i lysmikroskopi i rabdomyolysemodellen i rotterubuli [142] og i podocytter dyrket i nærvær av høy glukose og ved diabetisk nefropati hos mus [135]. Cytoplasmatisk TUNEL ble også beskrevet ved nyreiskemi-reperfusjon hos mus ved bruk av FL-fluorescerende TUNEL [98] og ved iskemi-reperfusjon hos rotter ved bruk av lysmikroskopi [143]. Kvikksølvklorid-indusert dyp og utelukkende tubulær skade med sterk cytoplasmatisk TUNEL-farging som indikerer nukleær membranskade [60]. Hvis skaden fortsetter eller dosen av det skadelige middelet øker, kan cytoplasmatisk TUNEL konverteres til et "rotete" bilde av spredt TUNEL (Figur 3G) tilskrevet sene stadier av celleødeleggelse på grunn av nekrose og søl av cellulær cytoplasma og rusk. For eksempel ble både cytoplasmatisk og dispergert TUNEL observert i cisplatin-behandlede mus [71,72] og rotter [144], og i podocyttskade i streptozotocin-induserte diabetiske rotter [145]. Dispergert nekrotisk TUNEL ble også observert under uranylacetat-indusert nefrotoksisitet hos mus [101]. Til slutt, en annen TUNEL-signalvariabel å ta hensyn til er intensiteten til TUNEL-positive signaler, som kan avvike fra celle til celle avhengig av antall pauser (grad av skade) hver celle opplever, som dokumentert av noen studier [45,96,125 ]. For modeller der varierende TUNEL-signalintensitet er observert, anbefales kvantifisering av både antall TUNEL-positive objekter og gjennomsnittlig intensitet av fargingen.

Konklusjoner

På grunn av den høye aktiviteten til apoptotiske endonukleaser i nyrene, spesielt DNase I og EndoG, er bruk av TUNEL fornyreforskning og diagnoseer veldig informativ. Det kan bli enda mer nyttig hvis TUNEL brukes utover den første bruken som en metode for å identifisere apoptose. Å bruke TUNEL eksklusivt for apoptosestudier er et godt eksempel på hvordan vitenskapen utilsiktet kan bli feilrettet av en upassende brukt metode. Til tross for bruken som en for det meste akutt skadeanalyse, kan TUNEL med hell brukes til å vurdere både AKI og CKD. Ved CKD bør imidlertid graden av TUNEL-positivitet forventes å være lavere enn ved akutt skade. Fordi aktiviteten til endonukleaser (hovedsakelig DNase I) er mye høyere i tubulært epitel enn i andre nyreavdelinger, blir skade på nyretubuli vanligvis sett på som mer fremtredende. Glomerulære eller vaskulære skader kan imidlertid også studeres med TUNEL dersom skaden faktisk oppstår i disse avdelingene. Kolokaliseringen av FL-fluorescerende TUNEL med IHC-markører tillater identifikasjon og assosiasjon av celletyper og celledødsmekanismer med TUNEL-signaler. TUNEL-kvantifisering kan bidra med verdifull informasjon om graden av celledød, og bruk av bildeanalyseprogramvare kan være svært nyttig i denne forbindelse. Med tanke på mangfoldet av TUNEL-mønstre, anbefales det sterkt å etablere og demonstrere representative bilder

TUNEL-signaler som anses som positive. Til slutt bør TUNEL-mønstre brukes som en kilde til tilleggsinformasjon, slik som mekanismen for celledød og graden av toksisitet. For eksempel kan det å skille mellom TUNEL-positive apoptotiske kropper, tilstedeværelsen av cytoplasmatiske TUNEL-signaler eller spredte TUNEL-mønstre bidra til å identifisere apoptotiske vs. nekrotiske TUNEL-positive celler for mer presise tolkninger av forsknings- og diagnostikkresultater.

behandling av seksuell opphisselse nyrelidelse