UMOD-mutasjoner i kronisk nyresykdom i Taiwan

Abstrakt:UMODer det første identifiserte og mest muterte genet som forårsaker autosomal dominanttubulointerstitiell nyresykdom(ADTKD). Nyere studier har vist at ADTKD-UMODer en relativt vanlig årsak tilKronisk nyre sykdom(CKD). Men statusen til ADTKD-UMODi Taiwan er fortsatt ukjent. I denne studien identifiserte vi tre heterozygoteUMODmissense-varianter, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp), og c.817G > T (p.Val273Phe), i totalt 221 utvalgte CKD-familier (1,36%). To av disse missense-variantene, p.Cys41Arg og p.Gly60Asp, har ikke blitt rapportert tidligere. In vitro viste studier at begge uromodulinvariantene har defekter i cellemembrantrafikk og utskillelse til kulturmediet. Strukturmodellen spådde endret disulfidbindingsdannelse i begge variantene, men bare p.Gly60Asp ble spådd å forårsake proteindestabilisering. Våre funn utvider mutasjonsspekteret og indikerer at ADTKD-UMODbidro til en liten, men betydelig årsak til CKD i den taiwanske befolkningen.

Nøkkelord: uromodulin;Kronisk nyre sykdom(CKD); autosomal dominant tubulointerstitialnyresykdom(ADTKD); nyresvikt (KF).

KLIKK HER FOR Å FÅ CISTANCHE URTE TILSKUDD FOR NYRESYKDOM

1. Introduksjon

ADTKD er en sjelden dominant arvesykdom forårsaket av heterozygote mutasjoner i UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] og SEC61A1 [5]. UMOD er ​​den første identifiserte og vanligste årsaken til ADTKD, og ​​den har vært gjenstand for omfattende undersøkelser [1,6]. Selv om det er sjeldent, er ADTKD den tredje vanligste monogenenyresykdometter ADPKD og kollagen type IV nefropati, men prevalensen av ADTKD-UMOD er ​​fortsatt uklar, og nyere studier viser at den representerer opptil 2 % av pasientene med KF eller 0,3 % av alle individer med CKD [7, 8]. UMOD koder for uromodulin og er det mest tallrike proteinet i human urin [9]. Uromodulin er et nyrespesifikt protein produsert av epitelcellene i den tykke stigende delen av løkken til Henle og den tidlige delen av den distale kronglete tubuli [10], og det dannes som en polymer med høy molekylvekt via sonen. pellucida domene [11]. Dessuten er uromodulin et svært glykosylert protein, med syv N-glykosyleringssteder og spaltning ved enden av C-terminalen av serinproteasehepsin, før det skilles ut i det tubulære lumen [9,12,13]. Funksjonen til uromodulin inkluderer beskyttelse mot kalsiumoksalatkrystallisering [14], forsvar mot infeksjoner i urinveiene fra uropatogene bakterier [15–18] og regulering av Ca2+-K+ ionekanalen [19]. Effekten av UMOD-mutasjoner er forsinket modning, retensjon i endoplasmatisk retikulum (ER), redusert ekspresjon ved plasmamembranen og redusert urinutskillelse, noe som fører til ER-stress og utfoldet proteinrespons [20–22].

Kliniske fenotyper av ADTKD-UMOD er ​​uspesifikke og inkluderer CKD, gikt, hyperurikemi, normal til mild proteinuri, tilstedeværelse eller mangel på familiehistorie, og de fleste berørte individer som går inn i KF mellom 30 år og 50 år [23]. Renal histologi viser tubulær dilatasjon eller atrofi, tubulær basalmembran kansellering eller fortykning, interstitiell fibrose og akkumulering av mutert uromodulin som polymorfe ustrukturerte materialer avslørt ved PAS-farging [24,25].

Taiwan har den høyeste forekomsten og prevalensen av CKD og KF basert på internasjonale sammenligninger av USRDS-rapporten [26]. Imidlertid har ingen studie fokusert på statusen til ADTKD-UMOD i CKD-befolkningen i Taiwan. I denne studien undersøkte vi forekomsten av ADTKD-UMOD-mutasjoner i en utvalgt CKD-kohort i et enkelt tertiært senter i Taiwan.

2. Materialer og metoder

2.1. CKD-individer og DNA-forberedelse

Denne studien rekrutterte 221 CKD-familier (228 individer) fra CKD Care Program ved Kaohsiung Medical University Hospital. Inklusjonskriteriene inkluderte giktepisoder eller hyperurikemi med eGFR mindre enn 90 ml/min/1,73 m2 før fylte 40 år. Blodprøver, stamtavleinformasjon og tilgang til resultater fra laboratoriearbeid ble innhentet fra individer etter at informert samtykke ble gitt. Studien ble utført etter Helsinki-erklæringen og godkjent av KMUHs Institutional Review Board (KMUHIRB-G(II)-20160024). DNA fra perifere blodprøver ble ekstrahert i henhold til standardmetoden.

2.2. Exome-sekvensering og bioinformatikkanalyse

Nextera Flex for Enrichment and Exome-panelet (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, USA) ble brukt til å lage et exome-bibliotek. Størrelsesvalg, sekvensfangst, berikelse og eluering ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Størrelsesfordelingen til DNA-biblioteker ble deretter målt ved bruk av TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, USA), etterfulgt av sekvensering på en Illumina NovaSeq 6000 med 150 bp parede endeavlesninger. De resulterende fastq-dataene ble justert til den humane referansesekvensen (GRCh37/hg19), og vi utførte nukleotidvarianter ved å bruke DRAGEN Bio-IT-plattformen (Illumina). VCF-filen ble analysert i CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, USA). Identifiserte varianter ble merket som patogene/sannsynlig patogene, variant av usikker betydning (VUS), eller godartet, i henhold til American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) klassifisering, ved bruk av VarSome-programvaren, og vi sammenlignet varianter som fantes i ClinVar , HGMD og dbSNP-databaser. Påviste patogene, sannsynlige patogene og VUS-varianter ble bekreftet ved Sanger-sekvensering. For Sanger-sekvensering ble PCR-produktene renset med reke alkalisk fosfatase/eksonuklease I (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) behandling og deretter utsatt for sekvensering fra begge ender ved termosykler-sekvensering ved bruk av BigDye® terminator 31. kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) etter analyse på en ABI 3730XL DNA-analysator (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Segregeringsanalyse ble utført dersom DNA var tilgjengelig fra familiemedlemmer. Ekson 2, 3, 4 og 5 av UMOD ble screenet ved Sanger-sekvensering i probandet til 221 CKD-familier bortsett fra DY5-familien, som mottok exome-sekvensering. NCBI Ref-sekvensen NM_003361.4 brukes for UMOD. Standardnomenklaturen anbefalt av Human Genome Variation Society (http//www.hgvs.org/; tilgjengelig 18. juli 2022.) ble brukt til å nummerere nukleotider og navngi mutasjoner eller varianter.

2.3. Cellekultur og forbigående transfeksjon

HEK293-celler (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, USA) ble dyrket i Kaighns modifikasjon av Hams F-12-medium (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, USA) supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt storfeserum (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 enheter/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin (10378016, Fisherco Scientific, Thermo, ), og 10 enheter/ml -interferon (IF002, Merck/Millipore Sigma). Cellene ble holdt ved 37 ◦C i en fuktet atmosfære med 5 % CO2.

Forbigående transfeksjon av HEK293-celler ble utført ved bruk av Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kort fortalt ble 2,5 µL Lipofectamine 2000 tilsatt direkte i 100 µL Optimum-medium (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur. Totalt 1 µg DNA ble tilsatt Lipofectamine 2000-Optimum-blandingen og inkubert i ytterligere 20 minutter. DNA-blandingen ble tilsatt til cellekulturplater med et serumfritt medium dråpevis ved slutten av inkubasjonen. For helsestatusen til cellene etter forbigående transfeksjon brukte vi LUNA-II™ Automated Cell Counter (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Korea) for å oppdage trypanblåfarging av cellelevedyktighet på et annet tidspunkt, og de fleste transfekterte celler forble i live ved forskjellig uromodulin-overekspresjon (data ikke vist).

2.4. Sted-rettet mutagenese

Den HA-merkede villtype uromodulin-vektoren ble hentet fra Dr. Rampoldi [27]. Mutasjonskonstruksjonene til p.Cys41Arg og p.Gly60Asp ble opprettet ved bruk av QuikChange II Site-Directed Mutagenese Kit (200523, Agilent) i henhold til produsentens instruksjoner. Mutasjonene ble bekreftet ved Sanger-sekvensering

2.5. ELISA og fraksjonering

Tom vektor, villtype uromodulin, p.Cys41Arg uromodulin og p.Gly60Asp uromodulin ekspresjonskonstruksjoner ble transient transfektert til HEK293 celler. Etter forbigående transfeksjon ble kulturmediet samlet ved 8, 24 og 32 timer, deretter lagret ved -80 ◦C før måling. For immunoblotting ble kulturmediet kondensert med Centri con (YM3, ikon, Merck/Millipore Sigma) før SDS-PAGE-elektroforese. ELISA ble brukt til å utføre målinger av uromodulin i kulturmediet i henhold til produsentens instruksjoner (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Kort fortalt ble kulturmediet og standardene fortynnet i et analysefortynningsmiddel levert i settet og tilsatt til brønner i duplikat. Etter 2,5 timers inkubering ved romtemperatur ble brønnene vasket med PBS, og det biotinylerte uromodulin-antistoffet ble tilsatt. Etter 1 times inkubering ved romtemperatur ble brønnene vasket på nytt, og et sekundært streptavidin-pepperrotperoksidase-antistoff ble tilsatt. Etter 45 minutters inkubering ved romtemperatur ble brønnene vasket på nytt, og fargen ble utviklet ved å tilsette TMB-substratløsning og inkubering i mørket ved romtemperatur i 30 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette stoppløsningen som ble levert i settet, etterfulgt av avlesning umiddelbart ved OD450 og OD550. Kulturmediets uromodulinkonsentrasjon ble bestemt ved interpolering på standardkurven.

Etter at kulturmediet var samlet, fortsatte cellene festet til kulturskålen til fraksjonering ved bruk av et subcellulært proteinfraksjoneringssett (78840, Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt samlet vi like mengder av tre forskjellige typer uromodulincellelysat og fjernet all supernatanten til den er så tørr som mulig. Vi tilsatte iskald cytoplasmatisk ekstraksjonsbuffer som inneholder proteasehemmere til cellepelleten, inkubert ved 4 ◦C i 10 minutter med forsiktig blanding, og sentrifugert ved 500× g i 5 minutter. Vi fjernet umiddelbart supernatanten (cytoplasmatisk ekstrakt) til et rent forhåndskjølt rør på is og tilsatte en iskald membranekstraksjonsbuffer som inneholdt proteasehemmere til pelleten. Membrandelen ble vortexet i 5 s på høyeste innstilling og inkubert ved 4 ◦C i 10 minutter med forsiktig blanding. Vi overførte supernatanten (membranekstrakt) til et rent forhåndskjølt rør på is etter sentrifugering ved 3000 x g i 5 min. Den subcellulære membranen og cytoplasmatisk protein ble analysert ved western blotting.

2.6. Immunoblotting-analyse

Proteinprøvene ble samlet fra cellene med en RIPA-buffer (R0278, Merck/Millipore Sigma) eller fraksjoneringstrinnet. Deretter ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved bruk av et proteinanalysefargestoff (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) og tilgang til en lik mengde protein, deretter separert ved elektroforese på SDS-PAGE. Etter at proteinene ble overført til polyvinylidendifluorid (PVDF)-membraner (1620177, BIO-RAD), ble PVDF-membranen nedsenket i 5 % skummet melk ved 1X TBST, blokkert i 1 time ved romtemperatur, og vasket tre ganger med 1X TBST for 5 min. Deretter inkuberte vi PVDF-membranen med det primære antistoffet ved 4 ◦C over natten, vasket det tre ganger med 1X TBST i 5 minutter og inkuberte det med det sekundære antistoffet i 1 time ved romtemperatur. Det ble vasket tre ganger med 1X TBST i 5 minutter etter sekundær antistoffinkubering, deretter tilsatte vi substratsettet for forbedret kjemiluminescens (ECL) (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) og oppdaget proteinsignalet ved hjelp av en røntgenprosessor (MXP{{ 19}}, KODAK, Rochester, NY, USA) på røntgenfilm (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Primære og sekundære antistoffer ble fortynnet med 5 % skummet melk i 1X TBST, og den detaljerte informasjonen er som følger 1:2000 for uromodulin (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) og 1:20 000 for kanin HRP andre antistoff (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, USA).

2.7. Forutsigelse av proteinstruktur

Dynamitt ble brukt for 3D-strukturprediksjon av villtype og mutant uromodulin (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; tilgang til 15. juni 2022.) ved å bruke full-lengdestrukturen til det opprinnelige humane uromodulin (Protein) Databank: 7PFP) [28]. DiANNA ble brukt for disulfifidbindingsprediksjonen (http://clavius.bc.edu/~clotelab/ DiANNA/; tilgjengelig 16. juni 2022.) av villtypen og mutant uromodulin [29–31].

2.8. Statistisk analyse

ImageJ analyseprogramvare analyserte og kvantifiserte western blot-båndene. De statistiske analysene og grafene ble utført og forberedt ved bruk av GraphPad Prism8-programvare (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, USA), og gjennomsnittet ± SEM ble presentert. En uparet t-test ble brukt for en to-grupper sammenligning. De statistiske resultatene ble merket som følger: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger.

Støttetjeneste:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Butikk:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop