Karkirurgipasienter med forhøyet nøytrofil-til-lymfocytt-forhold har nedregulert uttrykk for nøytrofil komplement RNA

Forhøyet nøytrofil-til-lymfocytt-ratio (NLR) hos pasienter som gjennomgår elektiv vaskulær kirurgi (EVS) har økt dødelighet uavhengig av perioperative kirurgiske utfall. For å forstå hvorfor høy NLR er assosiert med høyere dødelighet, undersøkte vi nøytrofil- og lymfocyttranskriptomuttrykk hos pasienter som gjennomgikk EVS. Blodprøver ble tatt fra pasienter som gjennomgikk EVS og friske givere for NLR-beregning. RNA-prøver ble isolert fra pasientenes nøytrofiler og lymfocytter og delt inn i NLR_Lav (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

Introduksjon

Kardiovaskulær sykdom (CVD) er en ledende dødsårsak over hele verden. Det er i stor grad på grunn av aterogenese og åreforkalkning som, i tillegg til individuell genetikk og kosthold, medieres av inflammatoriske og immunmekanismer.1-3 Nylig har det differensielle leukocytttallet (nøytrofiler og lymfocytter) kommet i fokus. å forutsi kardiovaskulære (CV) utfall. Forholdet mellom absolutt nøytrofil-til-lymfocytttelling (NLR) har blitt anerkjent som en prediktor for total dødelighet i flere små studier av akutte koronarintervensjoner,4-6 hypertensjon,7,8 og hjertesvikt.9

Tabell 1. Kliniske kjennetegn ved elektiv karkirurgipasienter undersøkt med RNA-seq.

Tidligere undersøkelser har også vist at NLR er en prediktor for langsiktige utfall hos pasienter med perifer vaskulær sykdom.10-13 Våre retrospektive studier av pasientpopulasjoner for karkirurgi støtter denne konklusjonen. I 1 studie av 108 pasienter med elektiv endovaskulær abdominal abdominal aortaaneurismereparasjon, var det ingen forskjell i 30-dagen postoperativ mortalitet mellom en NLR på<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 pasienter, 42,6 % hjerneslagrisiko) enn de med en NLR på<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] henholdsvis NLR-grupper).16 Pasienter med lavere preoperativ NLR oppnådde signifikant større amputasjonsfri overlevelse ved 4-års oppfølging (lav NLR 65,5 %, middel NLR, 37,5 % og høy NLR, 17,6 % [P < 0,0001]).16

I denne studien utførte vi RNA-sekvensering (RNA-seq) av nøytrofiler og lymfocytter fra pasienter som kvalifiserte seg for elektiv vaskulær kirurgi (EVS) reparasjon for å bestemme potensielle mekanismer for forhøyet NLR. Studiene undersøkte om det er molekylært grunnlag for forhøyet NLR. Våre undersøkelser viser at pasienter med forhøyet NLR som hadde EVS-reparasjon utmerker seg ved svært signifikant nedregulering av immunoglobulin- og komplementgener i nøytrofiler.

cistanche fordeler-styrker immunforsvaret

Metoder

Pasienter

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL), røykestatus, statinbehandling, en medisinsk historie med kronisk obstruktiv lungesykdom, kreft, kronisk nyresykdom, koronararteriesykdom (CAD), perifer arteriell sykdom, cerebrovaskulær sykdom og kronisk hjertesvikt. Alle pasientene hadde en fullstendig blodtelling med differensialt antall hvite blodlegemer. Pasientene ble delt inn i lav NLR (NLR_Lav [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Blodseparasjon

Fullblod (20 ml per pasient) ble samlet i 10 ml vacutainer-rør antikoagulert med EDTA, og blodet ble separert innen en time etter innsamling. Nøytrofil- og lymfocyttcellepopulasjoner ble hver isolert fra 8 mL blod ved å bruke EasySep direkte humane celleisolasjonssett (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) og Big Easy EasySep-magneten (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) i henhold til produsentens protokoller. Magneten ble avkjølt på is før, og blodcellene og reagensene ble forsiktig blandet ved å snu røret i motsetning til pipettering. Reagensforholdene ble også justert på følgende måte for å optimalisere utvinningen: 400 ml antistoffblanding, 400 ml magnetiske perler og 4 ml fosfatbufret saltvann ble tilsatt blodet før den første separasjonen, etterfulgt av 200 ml antistoff blanding og 400 ml perler før den andre separasjonen og 200 ml perler før den tredje og siste separasjonen. En liten alikvot på 200 ml ble tatt fra de endelige gjenvinningsvolumene for celletelling og klargjøring av objektglass. Resten av gjenvinningsvolumet ble sentrifugert ved 1000 omdreininger per minutt i 7 minutter for å pelletere cellene.

Figur 1. Helt transkriptom av RNA fra nøytrofiler og lymfocytter samlet fra pasienter med NLR, høy (NLR_Høy), lav (NLR_Lav) eller kontroll (NLR_kontroll) . Bokstavkoden "N" eller "L" i prøvenavnet betyr at enten nøytrofiler eller lymfocytter var kilden til RNA. Det var 6 pasienter innenfor hver kategori. Blå=redusert uttrykksnivå; rød=høyt uttrykksnivå.

Celletelling og klargjøring av objektglass

Celler resuspendert i fosfatbufret saltvann ble ytterligere alikvotert, blandet med trypanblått og manuelt talt ved bruk av et hemocytometer. Vanligvis ble 9 × 106 til 15 × 106 nøytrofiler og 3 × 106 til 10 × 106 lymfocytter isolert per prøve. Objektglass av de isolerte cellene ble fremstilt ved bruk av en cytosentrifuge, sentrifugert med 600 omdreininger per minutt i 3 minutter, og deretter farget med Wright-Giemsa-farge. Renheten til hver cellepopulasjon ble bestemt ved manuell telling, der minst 1000 celler ble skilt ut per lysbilde. Gjennomsnittlig renhet av nøytrofil- og lymfocyttseparasjonen ved celletelling var henholdsvis 98,3 % og 96,2 %. Flowcytometri ble utført på 1 prøvepar av nøytrofiler og lymfocytter og indikerte henholdsvis 90,6 % og 92,2 % renhet. De andre cellene i nøytrofilpreparatet ble brutt ned til lymfocytter (4 %), monocytter (2 %), eosinofiler (2,3 %) og basofile (0,3 %). I lymfocyttpreparatet var de andre cellene nøytrofiler (1,2%), monocytter (1,4%), eosinofiler (1,2%) og basofile (1,8%). Bulk RNA-seq-data fra alle individuelle prøver ble også brukt for å bestemme omfanget av monocyttkontaminering i cellepreparatene ved å bestemme om nøytrofiler eller lymfocytter fra NLR_Høy eller NLR_Lavprøver hadde økt CD14 betydelig , CD68, CD83 eller CD163. Uavhengig ble RNA-seq-dataene lagt inn for å estimere andelen immun- og kreftceller (EPIC), et program designet for å estimere andelen immun- og kreftceller i bulk-genekspresjonsdata.17 Referanseprofilen som ble brukt ble gitt av EPIC for blodsirkulerende immunceller og inneholder profilen for B-celler, CD4- og CD8-T-celler, monocytter, nøytrofiler og naturlige drepeceller. Utgangen som er rapportert er gitt som cellefraksjoner per prøve.

Figur 2. Signifikant differensielt uttrykte gener fra nøytrofiler og lymfocytter. (A) Antall signifikant differensielt uttrykte gener i nøytrofiler (blå) og lymfocytter (oransje). (B) Hovedkomponentanalyseplottet av signifikant differensielt uttrykte gener i nøytrofiler (grønne og lilla) og lymfocytter (røde og blå) i NLR_Høy (sirkler) og NLR_Lav (firkanter). (C) Et varmekart av signifikant differensielt uttrykte gener fra NLR_Høy vs NLR_Lavt nøytrofilt RNA. (D) Et varmekart over signifikant differensielt uttrykte gener fra NLR_Høy vs NLR_Lavt lymfocytt-RNA.

RNA-seq og statistisk analyse

Detaljerte metoder for RNA-ekstraksjon og sekvensering er presentert i tilleggsmetodene. Sekvensavlesninger ble vurdert for kvalitet, og adapteren ble trimmet med TrimGalore! (Babraham Institute), et innpakningsskript for FastQC og CutAdapt. Lesninger som bestod kvalitetskontroll ble justert til det humane referansegenomet GRCh38 ved å bruke STAR aligner-programvaren. De justerte avlesningene ble behandlet ved bruk av Cufflinks versjon 2.2.1 for differensiell ekspresjonsanalyse ved bruk av GENCODE-genannotasjonen for GRCh38, og ekspresjonsdata på gennivå ble rapportert i fragmenter per kilobase-transkript per million avlesninger kartlagt.18 Signifikant differensielt uttrykte gener ble identifisert ved bruk av en falsk funn rate cutoff P verdi på<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Resultater

Pasientkarakteristikker

Seks par pasientprøver ble valgt ut av 7 NLR_Høy og 9 NLR_Lav basert på den høyeste kvaliteten på RNA i paret, vurdert av RNA-integritetsnummeret (RIN) (tabell 1 ). Seks kontroller fra 8 friske givere ble også undersøkt. Hos pasientene inkludert i studien var gjennomsnittet ± standardavvik NLR for NLR_Høyt 4,37 ± 0,66 vs for NLR_Lav, 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Gjennomsnittlig ± standardavvik for alder for pasientene var 61,0 ± 17,0 år for NLR_Høy og 64,5 ± 7,5 år for NLR_Lav (P= .68). Alle unntatt 1 pasient hadde aortaaneurismesykdom, 9 var thorax/thoracoabdominale og 2 var abdominale. Begge pasientene med abdominal aortaaneurisme var i NLR-_lav-gruppen. Elleve av de 12 pasientene hadde en historie med hypertensjon. Fire av 6 pasienter i både NLR_Høy eller NLR_lave grupper hadde en medisinsk historie med lipidavvik. Fire pasienter i NLR_Høy og 3 pasienter i NLR_lave grupper var tidligere røykere. En pasient i NLR_lavgruppen var en aktiv røyker. Fem pasienter i NLR_Høy og 4 i NLR_lave grupper var på statiner. Bare 3 pasienter i begge gruppene var diabetikere. Én pasient i hver gruppe hadde en historie med CAD, og ​​2 pasienter i NLR_lav-gruppen hadde perifer arteriesykdom.

Figur 3. RNA-seq-dataene i denne undersøkelsen ble brukt som et uavhengig middel for å bestemme annen celleforurensning i nøytrofil- og lymfocyttpreparatene. Kun data fra nøytrofilene vises. En EPIC-analyse ble utført for å estimere andelen immun- og kreftceller i bulk-genekspresjonsdata. Denne analysen ga prosentandelen av nøytrofiler, monocytter, B-celler, CD4 T-celler, CD8 T-celler, naturlige dreperceller (NK) og andre celler i nøytrofilpreparatet.

Helt transkriptom

Vi observerte globale forskjeller i hele transkriptomet når vi sammenlignet genekspresjonsprofiler mellom nøytrofiler og lymfocytter (figur 1). Dette funnet var ikke overraskende ettersom celletypespesifikk genuttrykk tidligere har blitt karakterisert som forskjellig.19 I nøytrofildelen, på tvers av pasientene i NLR_Høy, NLR_Lav og NLR{{ 4}}Kontrollgrupper, det var mange gener oppregulert som tydeligvis ikke var oppregulert i lymfocyttdelen og omvendt. På hele transkriptomnivået var de cellespesifikke forskjellene mellom nøytrofiler og lymfocytter distinkte og dominerende uavhengig av NLR eller om det var en pasient eller kontroll. Men ved nærmere undersøkelse begynte forskjellene å dukke opp. Et hovedkomponentanalyseplot viste at NLR_kontroll for enten nøytrofiler eller lymfocytter overlappet med NLR_Høy og NLR_lav i begge cellene (tilleggsfigur 1). Undersøkelser forsøkte deretter å finne ytterligere forskjeller mellom NLR_Høy og NLR_lave grupper i de signifikant differensielt uttrykte genene. Det ble observert at 900 (74,5 %) signifikant differensielt uttrykte gener ble observert i nøytrofiler i NLR_Høy vs NLR_lave grupper (Figur 2A). Til sammenligning hadde lymfocytter bare 190 (15,7 %) signifikant differensielt uttrykte gener. Et hovedkomponentanalyseplott av NLR_Høye gener vs NLR_Lav gener i nøytrofiler og lymfocytter avslørte at gruppen av NLR_Høye vs NLR_Lav gener i nøytrofiler segregerte i 2 distinkte områder, mens genene for NLR_Høy og NLR_Lav lymfocytter overlappet (figur 2B). Igjen, som med hele transkriptomdataene, overlappet NLR_Kontroll med NRL_Høy og NLR_Lav signifikant differensielt uttrykte gener i både nøytrofiler og lymfocytter (tilleggsfigur 2). De fleste av de signifikant differensielt uttrykte genene i NLR_Høy av nøytrofiler ble nedregulert fra NLR_Lav (Figur 2C). Et lignende, men mye lavere antall gener ble nedregulert i NLR_High av lymfocytter enn for nøytrofiler (figur 2D). Disse dataene antydet at NLR-nivåer stort sett var assosiert med endret genuttrykk i nøytrofiler. Videre måtte den sammenlignes med pasienter fra sykdomsgruppen NLR_Lav, ikke NLR-kontroll, fordi den førstnevnte gruppen klart skilte seg fra NLR_Høy, men ikke NLR_kontroll ( figur 2B; tilleggsfigur 2).

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Før man undersøkte det differensielle uttrykket av gener og anrikning av gensett, karakteriserte ytterligere studier graden av monocyttforurensning i nøytrofilpreparatet. Ved å bruke RNA-seq-dataene observerte vi at uttrykket av monocyttmarkørene CD14, CD68, CD83 og CD163 i NLR_Høy vs NLR_Lav nøytrofiler eller lymfocyttpreparater ikke var signifikant forskjellig. EPIC-analysen av de nøytrofile RNA-seq-dataene viste at ikke-immune celler ("andre celler") og CD4 T-celler var de viktigste forurensningene i nøytrofilpreparatene (figur 3). Bortsett fra NLR{{10}}Lav-CD4-T-celler og B-celler, var ingen av de andre kontaminerende cellene signifikant forskjellige i NLR_Lav-nøytrofile vs. NLR_Høy-nøytrofiler . I nøytrofilpreparatet var monocyttkontaminering ved EPIC-analyse bare 0,17 % ± 0.05 % for NLR_Lav vs 0,1 % ± 0,033 % for NLR_Høye forberedelser (P=.12). Denne verdien indikerer at monocyttforurensning var en størrelsesorden lavere når den ble bestemt ved RNA-seq dataanalyse vs flowcytometri.

Figur 4. Spredningsbobleplott av signifikant uttrykte GO-gensettkategorier for biologiske prosesser mellom NLR_Høy og NLR_Lav. Forholdet mellom k:K på abscissen er antallet gener som er signifikant differensielt uttrykt (k) sammenlignet med det totale antallet gener i kategorien (K). Ordinaten er betydningen av anrikningen uttrykt som loggen (P-verdi). (A) GO-gensett avledet fra nøytrofil RNA-seq som sammenligner NLR_Høy med NLR_Lav. (B) GO-gensett avledet fra lymfocytt-RNA-seq. Gensett i nedre venstre hjørne av begge plottene er minst signifikante. Gensett i øvre høyre hjørne av begge plottene er de mest betydningsfulle.

Figur 4 (fortsettelse)

For å undersøke naturen til de differensielt uttrykte genene, utførte vi en GSEA med Gene Ontology (GO) kategorier for biologiske prosesser ved å bruke de signifikant differensielt uttrykte gensettene mellom NLR_Høy og NLR_Lav. Resultatene er vist i spredningsbobleplottene (Figur 4). Segregering av gensett oppe til høyre i hvert av plottene viser (1) en høy prosentandel av genene i gensettene som er betydelig endret og (2) en høy grad av betydning for anrikningen av gensettet. I vår prøve viste spredningsbobleplottene berikelsen av både komplement og humoral respons GO-kategorier uavhengig for både nøytrofiler og lymfocytter. Hos nøytrofiler var gensettene for den klassiske veien for komplementaktivering, regulering av proteinaktiveringskaskade og humoral immunrespons mediert av sirkulerende immunglobulin de mest signifikante med den høyeste prosentandelen av gensettmedlemmer betydelig endret (Figur 4A). Uavhengig ble de identiske gensettene i lymfocytter også observert å ha et høyt forhold mellom signifikant endrede gener og en grad av betydning som i nøytrofilstudiene (figur 4B).

Tabell 2. Immunologi-gensett i nøytrofiler og lymfocytter

Tabell 2 viser de mest signifikant endrede immunologigensettene i nøytrofiler (tabell 2, panel A) og lymfocytter (tabell 2, panel B). Denne studien sammenlignet genuttrykk i nøytrofiler eller lymfocytter mellom NLR_høye prøver og NLR_lave prøver. Sunn NLR_Kontrollprøver ble ikke sammenlignet ettersom ekspresjonsnivåene deres overlappet med NLR_Høy og NLR_lave pasientprøver i både hele transkriptomet og signifikant differensielt uttrykte gensett. I tillegg ble de sunne NLR_kontrollprøvene ikke matchet i alder, sykdom og kirurgisk tilstand (tilleggsfigur 1 og 2). I både nøytrofiler (tabell 2) og lymfocytter (tabell 2) indikerte dataene at ekspresjonen av gensett relatert til immunsystemet var svært signifikant forskjellig når NLR_Høy ble sammenlignet med NLR_Lav . På RNA-seq har hver celletype de samme funnene som den andre celletypen. I begge panelene maksimerte signifikansnivåene til de viktigste gensettene ved P < 1E-24. Disse dataene var svært signifikante uavhengig av om nøytrofilen eller lymfocytten ble undersøkt. For å fokusere på det svært signifikante innholdsområdet i denne RNA-seq-undersøkelsen, ble signifikant differensielt uttrykt immunoglobulingenekspresjon undersøkt. Først viste en hovedkomponentanalyseplott av nøytrofilgenene at for NLR_Høy vs NLR_Lav, ble de signifikant differensielt uttrykte immunoglobulingenene segregert i 2 grupper (supplerende figur 3A). Alternativt overlapper lymfocyttgenene til NLR_Høy vs NLR_Lav (tilleggsfigur 3A). Deretter ble et kombinert varmekart over immunrelatert genuttrykk mellom NLR_Høy med NLR_Lav sammenlignet i nøytrofiler og lymfocytter (figur 5). Totalt sett, når hele varmekartet undersøkes, er det åpenbar nedregulering av hele genfamilien av immunoglobulingener i den nøytrofile NLR_Høy-gruppen sammenlignet med den for NLR_Lav. De fleste gener (69/156, 44 %) var immunglobulinrelaterte. Bare 12 av 156 (7,7%) gener var komplementrelaterte: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD og CD59. I lymfocyttgruppen var det også nedregulering av hovedsakelig immunoglobulingener i NLR_Høy-kategorien.

Komplementgensett i nøytrofiler og lymfocytter er beskrevet i tabell 3. I både nøytrofiler (tabell 3) og lymfocytter (tabell 3) var ekspresjonen av gener i 3 gensett relatert til komplementsystemet svært signifikant forskjellig (P < 1E{{ 5}}) når NLR_Høye utvalg ble sammenlignet med NLR_Lavprøver. Denne observasjonen var den samme enten sammenligningen var mellom RNA fra nøytrofiler eller lymfocytter. De 3 gensettene inkluderer komplementaktivering, komplementaktivering klassisk vei og regulering av komplementaktivering. Et hovedkomponentanalyseplott av nøytrofilgenene viste igjen at for NLR_Høy vs NLR_Lav, ble de signifikant differensielt uttrykte komplementgenene segregert i 2 grupper (supplerende figur 3B). Alternativt kan lymfocyttgenene til NLR_Høy vs NLR_Lav overlappe (tilleggsfigur 3B).

Figur 5. Varmekart over signifikant differensielt uttrykte gener i immunglobulingenet i nøytrofiler (venstre) og lymfocytter (høyre). Genene som er oppført til høyre for hvert varmekart er medlemmene av immunglobulinet

Et varmekart over nøytrofiler og lymfocyttekspresjon av et komplement-relatert gensett som sammenligner NLR_Høy med NLR_Lav er vist i figur 6. I nøytrofilene ble et enormt antall gener nedregulert i NLR_Høy befolkning. I dette gensettet, i likhet med immunoglobulingensettene, var de fleste gener (69/ 86, 80 %) immunoglobulinrelaterte. Bare 12 av 86 (14 %) var komplementkomponent- og regulatorgener (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH og CFD). I lymfocyttgruppen totalt sett var det færre uttrykk for komplementgener, og immunglobulingener var litt mer nedregulert i NLR_Høy-gruppen. Fordi det er en større forståelse av genene til komplementsystemet sammenlignet med genene til immunoglobulinsystemene, ble oppmerksomheten rettet mot komplementsystemet som en potensiell kandidat for målgener relatert til høy og lav NLR. Et sammensatt varmekart som sammenlignet NLR_Høy med NLR_Lav ble utarbeidet som viser ekspresjonen av komplementsystemet og relaterte gener i både nøytrofile og lymfocyttprøver (figur 7). Lymfocytten er for det meste ikke et reservoarcellesystem for komplementsystemet. De fleste komplementgener er ikke oppregulert i lymfocytter. Bare C1S, CR2, C5, C8G, C5 og CFB var til stede med en forskjell i uttrykk mellom NLR_Høy og NLR_lave lymfocytter (figur 7). CD81 i lymfocytter er et B-celle tetraspanin. C1S- og C8G-uttrykk ser ut til å være betydelig høyere i lymfocytt-NLR_Høy enn de for lymfocytt-NLR_Lavt, i likhet med KLKB1, genet for plasmaprekallikrein.

I motsetning til nøytrofiler viste NLR_Høy nedregulering av komplementkomponentgenene C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 og C3AR1, og deres komplementregulatoriske (hemmende) gener CD59, CFB og CFI . Bare C2- og CFD-gener ble oppregulert hos pasienter med NLR_Høy_N. CD59 og C9 er relativt oppregulert i nøytrofile NLR_Lav_N sammenlignet med de for NLR_Høy_N. FGFR4 er en vekstfaktorreseptor. CFH var til stede, men så ikke ut til å være påvirket av nøytrofil NLR_Høy eller NLR_Lav. Det er mer uttrykt i lymfocytter.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Diskusjon

NLR på det differensielle leukocytttallet har blitt en mye brukt, enkel markør for å gjenkjenne potensielle skadelige utfall i et bredt spekter av lidelser, inkludert CVD, solide svulster og inflammatoriske lidelser som systemisk lupus erythematosus og systemisk sklerose. I våre egne retrospektive undersøkelser på pasienter med aterosklerotisk CVD, observerte vi at pasienter med høy NLR har en høyere sen dødelighet etter elektiv reparasjon av aortaaneurisme, en høyere sen hjerneslag/dødsrate etter profylaktisk karotis endarterektomi og redusert amputasjonsfri overlevelse etter elektiv femoral-popliteal revaskularisering hvis deres NLR er forhøyet.14-16 De nåværende undersøkelsene ble satt i gang for å finne et mekanistisk grunnlag for høy NLR. lymfom, multiple solide svulster og inflammatoriske lidelser som systemisk lupus erythematosus og systemisk sklerose. I våre egne retrospektive undersøkelser på pasienter med aterosklerotisk CVD, observerte vi at pasienter med høy NLR har en høyere sen dødelighet etter elektiv reparasjon av aortaaneurisme, en høyere sen hjerneslag/dødsrate etter profylaktisk karotis endarterektomi og redusert amputasjonsfri overlevelse etter elektiv femoral-popliteal revaskularisering hvis deres NLR er forhøyet.14-16 De nåværende undersøkelsene ble satt i gang for å finne et mekanistisk grunnlag for høy NLR.

Tabell 3. Komplement gensett i nøytrofiler og lymfocytter

For å utvikle en objektiv tilnærming til mekanismen(e) for differensielle effekter av NLR på CV-utfall, utførte vi RNA-seq på både nøytrofiler og lymfocytter fra de samme pasientene. For denne studien ble alle pasienter med aortasykdom prospektivt samlet og gruppert i NLR-kategorier etter deres resultater. De siste 6 prøvene i hver av de 2 celletypene ble valgt etter det høyeste nivået av deres RIN i det forberedte RNA fra de sammenkoblede nøytrofil- og lymfocyttprøvene uten hensyn til kjønn, alder eller tidligere medisinske tilstander. Som det kan ses i tabell 1, var pasientene i NLR_Høy og NLR_lav-gruppene ganske like og skilte seg bare ut av deres NLR.

Kvaliteten på RNA som brukes i denne studien er vist av RIN og den fullstendige segregeringen av mønsteret av genuttrykk mellom nøytrofiler og lymfocytter i alle pasientgrupper samlet (høy NLR, lav NLR og kontroller) (Figur 1). Et hovedkomponentanalyseplot viser at NLR_kontrolldata var irrelevante i denne undersøkelsen fordi pasientenes NLR overlappet med NLR_Høy og NLR_lav i pasientenes nøytrofile og lymfocyttpopulasjoner . GSEA-analysen ga stor innsikt i hvilke gensett som ble beriket i GO-gensettene til biologiske prosesser, og spredningsbobleplottene demonstrerte dette tydelig ved å plotte log-signifikansen vs forholdet mellom antall gener endret over det totale antallet gener i gensettene. Når de ble gjennomgått, var gensettene som skiller seg fra hele listen de i humoralt (immunoglobulin) immunitet og komplementsystem (tabell 2 og 3) basert på forhold og statistisk signifikans i en objektiv tilnærming til oppdagelse.

Det store antallet humorale immunoglobulingener involvert er vanskelig å jobbe med fordi viktige forskjeller mellom disse genene ikke er godt kjent. Alternativt er mye mer kjent om komplementsystemet, og fokuset på det klassiske komplementsystemet som aktiveres av immunglobulin er et gjenkjennelig mål for betennelser og sykdom relatert til immunglobuliner. Våre data tyder på at de klassiske komplementkomponentgenene C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 og flere regulatoriske gener (CD59, CFB CFI og CFH) er nedregulert i nøytrofiler hos pasienter med høy NLR (Figur 7). Disse funnene er slående av tre grunner. For det første er de involverte genene de som stort sett tilhører den klassiske komplementveien. For det andre, hos pasienter med høy NLR, er disse komplementgenene for det meste nedregulert sammenlignet med pasienter med lav NLR. Sist, mer F12 uttrykkes i nøytrofiler fra NLR_Høy enn de fra NLR_lave prøver. Enzymatiske former av proteinproduktet til F12 (faktor XII [FXII]) aktiverer den klassiske veien for komplement og nøytrofiler.20 Derimot er PLG, genet for plasminogen og aktivator av FXII, nedregulert i lymfocytter og nøytrofiler fra pasienter innenfor NLR{ {21}}Høyt, noe som tyder på at FXII-aktivering i seg selv kan være en regulator for komplementaktivering.

I tillegg har det vist seg at det klassiske komplementsystemet er involvert i akselerert CVD. Komplementkomponent 1q (C1q) er den initiale faktoren til komplementveien, som har en viktig rolle i både det medfødte og ervervede immunsystemet.21 C1q har vist seg å ha to roller, positive og negative effekter på åreforkalkning.22 I den klassiske komplementvei, C1q har en beskyttende rolle i tidlig stadium av aterosklerose ved å regulere makrofagmolekylært signal gjennom en komplementuavhengig vei, modulere opptak av aterogent lipoprotein, mediere apoptotiske celler og eliminering av cellerester.23,24 En fersk studie av Jia et al23 indikerer at redusert serum C1q er assosiert med CAD. En annen studie av Guo et al24 indikerer at økt C1q-aktivitet er assosiert med CAD. Endelig tyder nyere studier på at pasienter med diabetes med redusert C1q har forkortet overlevelse.25 Disse dataene indikerer at undersøkelse av komplementsystemet kan være viktig for å forstå den betennelsesmedierte patogenesen av CVD.

Figur 6. Varmekart over signifikant differensielt uttrykte gener i komplementgensettet i nøytrofiler (venstre) og lymfocytter (høyre). Genene som er oppført til høyre for hvert varmekart er medlemmene av komplementgensettet. RNA er fra nøytrofiler eller lymfocytter samlet fra pasienter med høy (NLR_Høy) eller lav (NLR_lav) NLR. Seks individuelle prøver fra NLR_Høy sammenlignes med 6 individuelle prøver fra NLR_Lav fra både nøytrofiler og lymfocytter.

Figur 7. Sammensatt varmekart over komplement og relaterte gener fra nøytrofil eller lymfocytt NLR_Høy eller NLR_Lav. I hver kategori ble det sammensatte varmekartet utarbeidet fra 6 individuelle RNA-seq-prøver fra hver celletype.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Selv om lipidsenkning ikke hadde noen innvirkning på NLR, senket antiinflammatorisk behandling med canakinumab, en interleukin 1-hemmer NLR (P < .0001).26 Disse dataene tyder på at NLR kan være en markør for hjerte-kar-sykdom uavhengig av lipider og påvirkning av statiner. Denne ad hoc-analysen av flere prospektive randomiserte studier antyder at NLR kan være en uavhengig risikofaktor for dødelighet ved CVD.

Det er noen begrensninger i denne studien. Våre nøytrofile preparater hadde 4 % lymfocytt- og 2 % monocyttkontaminering ved flowcytometri. Fordi nøytrofilene ikke er kjent for å syntetisere immunoglobulin, kan endringene i nøytrofilimmunoglobingenet være fra kontaminerende B-celler. På EPIC-analysen var det en signifikant økning i B-cellekontamineringen av NLR-Low-prøvene. Denne observasjonen antyder at en økning i nivået av immunoglobulingener i NLR_Lav nøytrofilprøver kan oppstå fra B-cellekontaminering. Dermed kan reduserte immunglobulingener i NLR_Høye prøver skyldes økte B-celler i NLR_lave prøver og ikke nødvendigvis reduserte immunglobulingennivåer i NLR_høye prøver. På samme måte er nøytrofiler ikke kjent for å være komplementproduserende celler. To prosent kontaminering med monocytter kan være kilden til komplementgenene. Ved å bruke RNA-sekvensdataene observerte vi imidlertid at det ikke er noen signifikant forskjell i monocyttkontaminering av nøytrofilpreparatene mellom NLR_Lav og NLR_Høy. Videre, å utføre en EPIC-analyse av RNA-seq-dataene viser at monocyttforurensning var<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

I sum er det kardinalfunn i denne undersøkelsen at i høye NLR-tilstander er mange komplementerende komponentgener og noen av deres regulatorer nedregulert i nøytrofiler. Det er uklart med hensyn til den generelle betydningen og aktiveringstilstanden til de identifiserte nedregulerte komplementgenene. Fordi komplementgensettene er påfallende redusert, spekulerer vi i at individer med NLR_Høy og forkortet postoperativ overlevelse har et tap av viktige CV-beskyttende mekanismer gitt av komplementsystemene. Denne vurderingen må undersøkes prospektivt i kliniske undersøkelser for den(e) underliggende mekanismen(e) for dette utfallet.

Referanser

1. Ross R. Aterosklerose – en inflammatorisk sykdom. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

2. Getz GS. Tematisk gjennomgangsserie: immunsystemet og aterogenese. Immunfunksjon i aterogenese. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Immunsystemet ved aterosklerose. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.

4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. Nytten av et forhøyet forhold mellom nøytrofil og lymfocytt for å forutsi langtidsdødelighet etter perkutan koronar intervensjon. Am J Cardiol. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Sammenheng mellom innleggelse nøytrofil til lymfocytt-forhold og utfall hos pasienter med akutt koronarsyndrom. Am J Cardiol. 2008;102(6):653-657.

6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH, et al. Preoperativ nøytrofil-lymfocytt-forhold og utfall fra koronar bypass-transplantasjon. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik T, Balta S, et al. Sammenlignende effekter av nebivolol og metoprolol på røde blodlegemers distribusjonsbredde og nøytrofil/lymfocyttforhold hos pasienter med nylig diagnostisert essensiell hypertensjon. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.

8. Karaman M, Balta S, Ay SA, et al. De komparative effektene av valsartan og amlodipin på vWf-nivåer og N/L-forhold hos pasienter med nylig diagnostisert hypertensjon. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, et al. Anvendelse av forholdet mellom nøytrofil og lymfocytt for å forutsi langsiktige utfall ved akutt dekompensert hjertesvikt. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-438.

10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. Nøytrofil lymfocyttforhold i perifer vaskulær sykdom: en gjennomgang. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. Nøytrofil-lymfocytt-forhold forutsier overlevelse på mellomlang sikt etter elektiv større vaskulær kirurgi: en tverrsnittsstudie. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. Nøytrofil til lymfocytt-forhold forutsier perioperativ dødelighet etter åpen elektiv reparasjon av abdominale aortaaneurismer. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. Nøytrofil-lymfocytt-forhold forutsier sykdommens alvorlighetsgrad og utfall etter prosedyrer i nedre ekstremiteter. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.

14. King AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. Forhøyet nøytrofil-lymfocytt-forhold forutsier dødelighet etter elektiv reparasjon av endovaskulær aneurisme. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.

15. King AH, Kim AH, Kwan S, et al. Et forhøyet nøytrofil-til-lymfocytt-forhold er assosiert med dårligere utfall etter karotis-endarterektomi hos asymptomatiske pasienter. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.

16. King AH, Kwan S, Schmaier AH, et al. Et forhøyet nøytrofil-til-lymfocytt-forhold er assosiert med redusert amputasjonsfri overlevelse etter femoropopliteal perkutan revaskularisering. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Samtidig opptelling av kreft- og immuncelletyper fra bulk tumorgenekspresjonsdata. Elife. 2017;6:e26476.

18. Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Differensiell gen- og transkripsjonsekspresjonsanalyse av RNA-seq-eksperimenter med TopHat og mansjettknapper. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.

19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Celletypespesifikke genekspresjonsprofiler av leukocytter i humant perifert blod. BMC Genomics. 2006;7:115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL, et al. Faktor XII og uPAR oppregulerer nøytrofile funksjoner for å påvirke sårheling. J Clin Invest. 2018;128(3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, sang-VM. Komplement og dets rolle i medfødte og adaptive immunresponser. Cell Res. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Komplement i aterosklerose: venn eller fiende? J Thromb Haemost. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Y, Wen W, Yang Y, et al. Den kliniske rollen til kombinert serum C1q og hsCRP i å forutsi koronararteriesykdom. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Serumkomplement C1q-aktivitet er assosiert med obstruktiv koronarsykdom. Front Cardiovasc Med. 2021;8:618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A, et al. Nytten av komplement C1q for å forutsi 10-årsdødelighet hos menn med diabetes mellitus henvist til koronar angiografi. Am J Cardiol. 2018;122(1):33-38.

26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM, et al. Nøytrofil-lymfocyttforholdet og hendelser aterosklerotiske hendelser: analyser fra fem samtidige randomiserte studier. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.