Hva er fordelene med Cistanche Polysakkarid på immunfunksjon

Ansvarlig: emily.li@wecistanche.com

Den immunologiske aktiviteten og mekanismen til Cistanche Polysakkarid

Zeng Qunli, Zheng Yifan, Lu Zhiliang

[Abstrakt]Hensikt: Å studereimmunaktivitet avCistanchePolysakkarid(CDPS) og mekanismen forimmunregulering in vitro. Metoder: Den tiazolblå kolorimetriske metoden (MTT) ble brukt til å observere reguleringseffekten av CDPS (Cistanche polysakkarid) på IQS DEX TNFβ som hemmer spredningen av mus thymiske lymfocytter in vitro; CDPS (Cistanche polysakkarid) ble brukt til å utføre cellesyklus- og cellesyklusanalyse ved hjelp av strømningscytometri. Bestemmelse av intracellulær Ca2. Resultater: CDPS (Cistanche polysakkarid) ved en høyere konsentrasjon kan motstå den hemmende effekten av ISQDEX på lymfocyttproliferasjon og den hemmende effekten av høy konsentrasjon TNFβ på lymfocyttproliferasjon, og synergisere spredningsfremmende effekten av lav konsentrasjon TN Fβ på lymfocytter;100μg/ml 200 μg/ml CDPS (Cistanche polysakkarid) kan øke cellene i divisjonsfasen betydelig. høyere konsentrasjon (100 μg/ml) CDPS (Cistanche polysakkarid) kan fremme konsentrasjonen av Ca ion i mus thymocytter betydelig. Konklusjon: CDPS (Cistanche polysakkarid) kan fremme celler for å komme inn i divisjonsfasen, og det er antydet at dens fremmende effekt på spredning av mus thymiske lymfocytter er relatert til fremme av kalsiumfrigjøring i mus thymiske lymfocytter.

Cistanche(CistancheDeserticolaY C Ma) er et sjeldent og dyrebart kinesisk medisinsk materiale i mitt land. Den er oppført som toppkarakter i "Shen Nongs Materia Medica".Cistanchehar funksjonene til nærende blod, nærer nyrene og hjelper yang, fukter tarmene og forsinker aldring. Moderne farmakologisk forskning viser atCistanchePolysakkaridkan forbedre kroppensimmunfunksjon, fremme DNA-syntese, styrke fysisk styrke, forbedre intelligens og har åpenbare anti-aldringseffekter [1]. Forfatteren studerte reguleringen av CDPS(Cistanche Polysakkarid), en polysakkaridkomponent iCistanche, klikker duimmunfunksjonav muselymfocytter.

Cistanche polysakkaridFremmespredning avLymfocytter

1 Materiale og metoder

1.1 Reagenser og narkotika.

RPM, I 1640 medium: GIB-CO; HEPES: FARCO; L-glutamin: Shanghai Dongfeng reagensfabrikk; Penicillin og Streptomycin: Nord-Kina farmasøytisk fabrikk; Concanavalin (Cona), MTT: SIGM A Selskap; Phytohemagglutinin (PHA): Shanghai medisinske laboratorium; Isoproterenol (ISO): Shanghai Tianfeng farmasøytiske fabrikk; Mercaptoetanol: Fluka Company; Nyfødt kalv serum: Sijiqing Bioengineering Company; Dexamethasone (DEX) ble presentert av Dr. Ma Liang, det første tilknyttede sykehuset i Zhejiang University School of Medicine; Tumor Suppressor Factor (TNF) ble levert av Yu Yuehan, professor, Institutt for celler, School of Life Sciences, Zhejiang University; Resten av reagensene er alle hjemmeproduserte analytiske karakterer.

1.2 Eksperimentelle dyr.

ICR mus, mann, 68 uker gammel, veier 18-20g, 22, ble kjøpt fra Zhejiang Experimental Animal Center.

1.3 Utvinning av Cistanche Polysakkarid [2]:

CistanchePolysakkaridekstraheres av vårt laboratorium! Etter å ha knust rå stoffetCistanche, den er nedsenket i varmt etanol, ekstrahert i kokende vann og utfelt i etanol. Nøytralt enzym kombinert med Sewag metode for deproteinisering, anion DEAE-Sephadex A- 50 utveksling kromatografi og Sephacry S-200 gelfiltrering kromatografi for å oppnå en enkelt komponent av CDPS (Cistanche polysakkarid)). Hold deg tørr, bruk ufullstendig RPMI1640 for å lage en viss konsentrasjon før bruk, og steriliser ved ultrafiltrering

1.4 Fremstilling av milt og tymuslymfecytter [3]:

Musene ble ofret av nakkefjerning. Milten eller tymusen ble tatt aseptisk og siktet gjennom et 200-nett stålnett. Hanks-løsningen som inneholder grøt nyfødt kalveserum ble brukt til å forberede en encellet suspensjon. Etter sentrifugering ved 1500 r/min i 10 min ble røde blodlegemer lysnet med 0,01 mol/L Tris-NHCl hypotonisk oppløsning i 1 min, og deretter vasket med Hanks flytende sentrifugering. Til slutt ble cellene suspendert i RPMI1640 som inneholder 10% fersk kalveserum for fullstendig kultur Løsning (inneholder 2 mmol/LL glutamin, 100 mmol/l natriumpyminert, 1 mmol/L mercaptoetanol, tilsett penicillin 100 U/ml og streptomycin 100 μg/ml like før bruk), trypanblått antall, leve For celler> 93, juster konsentrasjonen av miltceller til X 10 /ml og konsentrasjonen av tymocytter til × 10 ml/ml

1.5 Lymfocyttproliferasjonsreaksjon:I henhold til Mosmanmn-metoden [4] Forbedring: 96-brønns cellekulturplate, tilsett 10/ml miltcellefjæring eller vann 10/ml tymocyttsuspensjon 100M1 og forskjellige konsentrasjoner av legemidler 10041 i hver brønn. Dyrk i en CO2.37C inkubator i 72 timer. 4 timer før slutten av kulturen, tilsett 8μ1 MTT (5 mg/ml) til hver brønn. På slutten av kulturen aspirerer du 150"1 av supernatanten fra hver brønn, og tilsett 0,5N isopropanolhydroklorid 150M1. Rist forsiktig på mikro shaker for å fullstendig oppløse de blå krystallene. Mål OD570 på mikroplateleseren. Angi hvert eksperimentelt punkt som tre repliker brønner.

1.6 Bestemmelse av påvirkning på cellesyklus [5]:

124-brønns cellekulturplate, tilsett 4 10° / ml tymocyttfjæring 1 ml til hver brønn, tilsett ulike reagenser og polysakkaridløsning til 2 ml i sterk CO, 37 inkubatorer Etter kultivering i 72 timer, sentrifuger ved 1500r/min i 15min, kast supernatanten, tilsett 7 etanol for å fikse de utfelte cellene, lagre ved 4C for standby-testing, vask cellene to ganger med PBS, sentrifuge ved 1500r/min i 15min, kast supernatanten og tilsett Etter 0,5 ml0,1 RNaseA ble fordøyd ved 4C i 30min, 50μg/ml bromoacetat ble farget i 30min ved 4C, og fluorescensintensiteten til celleprøvene ble målt på FACScan flow cytometer. 10 000 celletestpunkter ble samlet inn for hvert utvalg, og dataene brukte Mul-trehjulssykkelprogramvareanalyse.

1.7 Bestemmelse av intracellulær kalsiumionkonsentrasjon [6]

Ta musen thymocytes på samme måte som ovenfor. Suspender ufullstendig RPMIl640 kulturmedium og juster cellekonsentrasjonen til × 10'/ml. Tilsett 1 ml tymocyttfjæring og 1 μM til hvert eksperimentelt rør Fluo-3AM fargingsoppløsning 5μ1, 2% F-275μ1, etter inkubasjon ved 37 i 30 minutter, vask to ganger med ufullstendig RPM1640, 1500r/ min, sentrifuge i 10 min, kast supernatanten og legg til forskjellige konsentrasjoner av polysakkarider og polysakkarider til de utfelte cellene Etter ConA ble fluorescensintensiteten målt på FACScan-strømningscytometeret. Dataene til 10,000 celle testpunkter ble samlet inn for hver prøve og analysert av CELLQUEST programvare. 1.8 Statistiske metoder ble brukt til variansanalyse, og cellesyklusen og kalsiumionmålingen ble analysert av programvaren til strømningscytometeret.

Cistanche Polysakkarid fra cistanche deserticola

2 Resultater

2.1 Cistanche Polysakkarid in vitro hemmer spredningen av mus thymiske lymfocytter av ISO DEX TNFβ

Den β-adrenerge reseptoragonisten isoproterenol (ISO) og en klasse binyrebarkhormon deksametason (DEX) hemmer lymfocyttproliferasjon CDPS (Cistanche polysakkarid) ved høyere konsentrasjon (75 125 μg/ml) kan motstå den hemmende effekten av ISO DEX på lymfocyttproliferasjon (P<0.01) as="" shown="" in="" figure="" 1.="" tumor="" necrosis="" factor="" (tnf="" β)="" on="" lymphocytes="" at="" high="" concentration="" cdps="">Cistanche Polysakkarid) (125 μg/ml) ved høyere konsentrasjon kan motstå den hemmende effekten av TNFβ, og synergistisk fremme spredning av lymfocytter med lav konsentrasjon av TNFβ (figur 2)

2.2 Cistanche Polysakkarid regulering av thymus lymfocytt syklus

CDPS (CistanchePolysakkarid) 25μg/ml 100μg/ml 200 #g/ml tre konsentrasjoner ble utført på mus thymiske lymfocytter i 72 timer, DNA-innholdet i cellene ble målt ved FACS, og spredningsindeksen (PI) ble beregnet i henhold til formelen. Resultatene viser at både 100μg/ml og 200μg/ml kan øke cellene i divisjonsfasen betydelig, og spredningsindeksen (68,0%, 56,6) av begge er betydelig høyere enn kontrollgruppen (44,6), og 200μg/ml-gruppen er litt lavere enn 100μg /ml-gruppen fordi effekten på celleproliferasjon har blitt en nedadgående trend [7]. P I-verdien (47,5 %) av gruppen på 25 μg/ml var ikke signifikant høyere enn kontrollgruppens.

2.3 Effekten av Cistanche Polysakkarid på kalsiumionkonsentrasjonen i mus thymocytter

De eksperimentelle resultatene viser at en høyere konsentrasjon (100 μg/ml) av CDPS (Cistanche Polysakkaride) kan fremme økningen i kalsiumionkonsentrasjonen i mus thymocytter betydelig Sammenlignet med kontrollgruppen er det en signifikant forskjell (P<0.01), and="" there="" is="" a="" certain="" effect="" relationship="" with="" the="" action="" time="" (figure="">

3 Diskusjon

Cistanche, vanligvis kjent som"ørken ginseng"er en tørr, skjellete, kjøttfull stamme avCistanche。Cistanchehar funksjonene til nærende nyre yang, nærende essens, blod og tarmer. Det tilhører en slags spenning av hypofysen-binyrebarken eller har en hormonlignende effekt som ligner binyrebarken. En verdifull kinesisk medisin som kan regulereimmunfunksjonkroppen. Våre tidligere forskningsresultater viser at CDPS (Cistanche polysakkarid) in vitro kan fremme spredning av tymiske T-lymfocytter som ikke er aktivert eller aktivert av ConA PHA. Kombinert med ConA PHA finnes det to typer T-cellestimulator, vi tror at CDPS (Cistanche polysakkarid) er en Badjuvant for T-celler, og vi fant også ut at CDPS (Cistanche polysakkarid) kan øke sekresjonen av mus spleniske lymfocytter betydelig ved høyere konsentrasjoner [8]

Noen studier har funnet ut at rekombinant TNF kan forårsake apoptose av normal mus og humane T-lymfocyttklynger in vitro, og denne effekten kan potensielt hemmes av IIL-2 IL-1 IFN og IIL-4 med deksametason (DEX) Det kan hemme lymfocyttproliferasjon ved å hemme lymfocyttuttrykk og sekresjon av IL-2 og nedregulere produksjonen av høy affinitet IL-2R. Dette eksperimentet fant at en høyere konsentrasjon av CDPS (CistanchePolysakkarid) kan motvirke effekten av høy konsentrasjon av TN Fβ på lymfocyttproliferasjon. Hemming, synergistisk med lav konsentrasjon av TNFβ for å fremme spredning av lymfocytter, og kan motvirke den hemmende effekten av ISQ DEX på lymfocyttproliferasjon. Disse effektene er nøyaktig gjennom CDPS (CistanchePolysakkarid) for å fremme spredning av T-lymfocytter og er autocrine av T-celler IL-2 og andre cytokiner å fullføre.

De siste årene har det vært mange studier på immunfarmakkologiske effekter av plantepolysakkarider, men få studier påimmunreguleringsmekanismen for polysakkarider, spesielt signaltransduksjonsveien til polysakkarider som virker på lymfocytter med Ca2 som den andre budbringeren. Det er ingen rapport. Dette eksperimentet utførte forundersøkelser på dette området. Intracellulære signalmolekyler inkluderer cAM R Ca", IP3 DG cGMP, etc., blant annet Ca" har en ekstremt viktig fysiologisk effekt på celler. Økningen i intracellulær Ca²-konsentrasjon er Et viktig fenomen i det tidlige stadiet av lymfocyttaktivering og spredning. Denne prosessen skjer hovedsakelig i de første titalls sekundene til minutter når celler aktiveres av stimulatorer. Den klassiske måten å T celle aktivering er fosfatidylinositol (PIB) å metabolisere fosfatidyl muskel. Alkoholmetabolitten 1,4,5-inositol tripfosfat (IP3) kan fremme frigjøring av Ca" lagret i det indre nettet ved å binde seg til de indre maskereseptorene, øke nivået av intracellulær Ca2, og konsentrasjonen av intracellulær Ca * øker. Høy kan fremme produksjon av NF-AT (nudeic faktor av aktivert T celle), sistnevnte har effekten av å fremme uttrykket av IIL-2 gen. Eksperimentelle resultater viser at en høyere konsentrasjon (100 μg/ml) av CDPS (CistanchePolysakkarid) er effektiv i 5 10 min Tid har en betydelig effekt på å øke konsentrasjonen av Ca * i musen thymocytes, og har en synergistisk effekt med ConA. Derfor spekulerer vi i at CDPS (Cistanche polysakkarid) fremmer frigjøring av kalsium i mus thymiske lymfocytter for å øke den intracellulære kalsiumionkonsentrasjonen. Økningen fremmer uttrykket av IL-2-genet og fører til spredning av T-celler, som er et av de teoretiske grunnlagene forCistanchePolysakkariderregulatorisk effekt på kroppen

Cistanche polysakkarid

Referanser

1. IN XiuHin, SU Yuke ( Generell situasjon for farmakologiforskning påCistancheSka 【J】. Kinesiske tradisjonelle og urtemedisiner ((kinesisk urtemedisin). 1993.24(10. 550-552 (på kinesisk))

2. ZHANG Weijiee ( Biokjemisk teknikk av sammensatt polysakkarid [M]. Hangzhou Zhejiang University Pres (Zhejiang University Press), 1994.16-17 (på kinesisk)

3. MA Bo- (Ma Baoli). Immunologi tehnique【M1. Shanghai Medical University Pres (Shanghai Medical University Press), 1984 188-190. (n Chines))

4. Mosmann T. Rapiloloimeric analyse for enklere vekst og overlevelse anvendelse på spredning og cytotoksisitet borte[J J Immun Meth.1983,6 55-58.

5. WU er-hei, WU shailing, Acai-n, et al (Wu Jiahui, Wu Shuibing. Li Carian, etc.), Effekten av zin på spredning av sykliske celler iimmunorgananalyse ved hjelp av strømningscytometri [J]. Kinesisk immunologi (Chinese Journal of Immunology), 1994, 10X5: 278-281. (i Chine)

6. TAO-axin. JIYong-yong, GAO Qi-rong, et al (Tao Jiaxian, Ji Yongpu Gao Qirong, etc.). FACS analyse av endringer i intracellulær C2 under elaktivering [J] Kinesisk tidsskrift for immunologi (China Journal of Immunology), 1993, 9 (2): 97-10L. (på kinesisk)

7. ZENGQu-li.MAO Jum-hao, LU suchiang; Rensing d polysakdarid avCistancheDeserticolaYC Mfa og dets immunmodulerende effekter på Tellfunction[J].burnal av Zhejiang Medical University (Journal of Zhejiang Medical University), 1998.27 (3: 108-111. (på kinesisk)

8. Sarin A, Michelle C. Perre A H Cytotoksisk Efed av TNF og lymfotoxin på T Lymphoblak. J Immunol, 1995, 1553716-3721.