Helgenomsekvensering for diagnostisering av nevrologiske gjentatte ekspansjonsforstyrrelser i Storbritannia: En retrospektiv diagnostisk nøyaktighet og prospektiv klinisk valideringsstudie

For mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com

Sammendrag

Bakgrunn

Gjentatte ekspansjonsforstyrrelser påvirker omtrent 1 av 3000 individer og er klinisk heterogene sykdommer forårsaket av utvidelser av korte tandem-DNA-repetisjoner. Genetisk testing er ofte locus-spesifikk, noe som resulterer i underdiagnostisering av personer som har atypiske kliniske presentasjoner, spesielt hos pediatriske pasienter uten tidligere positiv familiehistorie. Helgenomsekvensering brukes i økende grad som en førstelinjetest for andre sjeldne genetiske lidelser, og vi hadde som mål å vurdere dens ytelse i diagnostisering av pasienter mednevrologiskegjentatte ekspansjonsforstyrrelser.

Metoder

Vi vurderte retrospektivt den diagnostiske nøyaktigheten av helgenomsekvensering for å oppdage de vanligste gjentatte ekspansjonsstedene assosiert mednevrologiskeutfall (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT og TBP) ved bruk av prøver innhentet innen National Health Service i England fra pasienter som ble mistenkt for å hanevrologiskelidelser; tidligere PCR-testresultater ble brukt som referansestandard. Den kliniske nøyaktigheten av helgenomsekvensering for å oppdage gjentatte utvidelser ble prospektivt undersøkt hos tidligere genetisk testede og udiagnostiserte pasienter rekruttert i 2013–17 til 100 000 Genomes Project i Storbritannia, som ble mistenkt for å ha en genetisknevrologiskelidelse (familiær eller tidlig debuterende former for ataksi, nevropati, spastisk paraplegi, demens, motorneuronsykdom,parkinsoniskbevegelselidelser, intellektuell funksjonshemming eller nevromuskulære lidelser). Hvis et gjentatt utvidelsesanrop ble foretatt ved bruk av helgenomsekvensering, ble PCR brukt for å bekrefte resultatet.

Funn

Den diagnostiske nøyaktigheten av helgenomsekvensering for å oppdage gjentatte utvidelser ble evaluert mot 793 PCR-tester tidligere utført innen NHS fra 404 pasienter. Helgenomsekvensering klassifiserte 215 av 221 utvidede alleler korrekt og 1316 av 1321 ikke-ekspanderte alleler, og viste 97,3 prosent sensitivitet (95 prosent KI 94,2–99,0) og 99,6 prosent spesifisitet (99,1–99) ·9) på tvers av de 13 sykdomsassosierte lociene sammenlignet med PCR-testresultater. I prøver fra 11 631 pasienter i 100 000 Genomes Project, identifiserte helgenomsekvensering 81 gjentatte utvidelser, som også ble testet ved PCR: 68 ble bekreftet som gjentatte utvidelser i hele patogenområdet, 11 var ikke -patogene mellomliggende utvidelser eller permutasjoner, og to var ikke-ekspanderte gjentakelser (16 prosent falsk oppdagelsesrate).

Tolkning

I vår studie viste helgenomsekvensering for påvisning av gjentatte utvidelser høy sensitivitet og spesifisitet, og det førte til identifisering avnevrologiskegjentatte ekspansjonsforstyrrelser hos tidligere udiagnostiserte pasienter. Disse funnene støtter implementeringen av helgenomsekvensering i kliniske laboratorier for diagnostisering av pasienter som har ennevrologiskepresentasjon forenlig med en gjentatt ekspansjonsforstyrrelse.

Finansiering

Medical Research Council, Department of Health and Social Care, National Health Service England, National Institute for Health Research, og Illumina.

Introduksjon

Til tross for nylige fremskritt i vår forståelse av det genetiske grunnlaget for sjeldnenevrologiskelidelser forblir opptil 70 prosent av pasienter med slike lidelser genetisk udiagnostisert.1–3 Dette skyldes delvis de tekniske utfordringene med å teste for komplekse og repeterende genetiske varianter, inkludert gjentatte utvidelser; slike utvidelser anslås å påvirke rundt 1 av 3000 mennesker (vedlegg s. 1) og er den ledende årsaken til mer enn 40 nevrogenetiske lidelser,4 inkludert Huntingtons sykdom og fragilt X-syndrom. Gjentatte ekspansjonsforstyrrelser er klinisk og genetisk heterogene, og gjentatt ekspansjon kan være assosiert med ulike sykdommer. For eksempel kan ekspansjoner i C9orf72 presenteres som enten amyotrofisk lateral sklerose eller frontotemporal demens.5 Gjentatte ekspansjoner i forskjellige loci kan også gi lignende fenotypiske trekk, noe som gjør dem vanskelige å skille klinisk: gjentatte utvidelser i minst ti spinocerebellare ataksi-gener som ofte er tilstede som voksen -begynnende ataksi,6 og de i C9orf72 og AR kan begge forårsake motornevronsykdom.7,8

Gjentatte ekspansjonsforstyrrelser er forårsaket av en økning i antall repeterende korte tandem-DNA-sekvenser, og patogenisitetsterskler for hver lidelse er lokusspesifikke. Størrelsen på utvidelsen varierer fra færre enn 30 repetisjoner (f.eks. i CACNA1A) til flere tusen gjentatte enheter (f.eks. i FMR1, DMPK, C9orf72 og FXN, som kan utvide seg til 5 kb i størrelse). Gjentatte ekspansjoner viser molekylær ustabilitet, noe som kan føre til endringer i repetisjonsstørrelsen (vanligvis økende i lengde) på tvers av generasjoner og vev.4 Under disse forholdene fører en økning i antall repetisjoner ofte til en tidligere oppstart og en mer alvorlig sykdom etter hvert. generasjoner.4 Pediatrisk debut av gjentatte ekspansjonsforstyrrelser kan presentere seg som multisystemsyndromer uten spesifikke fenotypiske signaturer,9 og barn med disse lidelsene er derfor mer sannsynlig å bli underdiagnostisert når en familiehistorie med gjentatt ekspansjonsforstyrrelse er fraværende enn når den er tilstede.10– 12

Laboratorievurdering av gjentatte utvidelser er vanligvis begrenset til målrettet molekylær vurdering av et individuelt locus veiledet av den mistenkte kliniske diagnosen ved bruk av PCR-baserte eller Southern blot-metoder13, noe som kan være kostbart og tidkrevende. I tillegg, på grunn av de varierte og overlappende fenotypiske trekk ved disse lidelsene, kan sykdomsassosierte gjentatte ekspansjonssteder forbli uprøvde.14

Helgenomsekvensering dukker opp som et førstelinjediagnostisk verktøy hos pasienter med sjelden sykdom15, men inntil nylig ble det antatt å ha begrenset evne til å vurdere loci som inneholder gjentatte utvidelser.16 Fremskritt innen bioinformatikk har imidlertid gjort det mulig å oppdage sykdom. -forårsaker gjentatte utvidelser fra neste generasjons sekvenseringsdata.17–22 Her rapporterer vi om den diagnostiske vurderingen av en helgenomsekvenseringstilnærming for å oppdage gjentatte utvidelser ved bruk av retrospektive PCR-data, og dens kliniske validering hos pasienter i 100 000 Genomes Project som hadde en mistenkt nevrologisk lidelse, udiagnostisert med tidligere genetisk testing.

Metoder

Studiedesign og deltakere

Denne evalueringen av helgenomsekvensering for påvisning av gjentatte utvidelser inkluderte både diagnostisk nøyaktighet og kliniske nøyaktighetsvurderinger. Diagnostisk nøyaktighet ble evaluert ved å bruke data fra pasienter som tidligere hadde blitt testet med PCR for gjentatte utvidelser kjent for å forårsake nevrologisk sykdom.4 Pasienter ble identifisert fra to kilder: 100 000 Genomes Project og Genomic Laboratory basert på Cambridge University Hospitals ( Cambridge, Storbritannia). For begge sett med pasienter var PCR-testing utført på pasientprøver av laboratorier i National Health Service (NHS) som en del av rutinemessig klinisk vurdering: for prøver i 100000 Genomes Project ble PCR-tester utført før rekruttering til prosjektet av University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (London, Storbritannia); prøver med PCR-bekreftet gjentatte utvidelser ble hentet fra pasienter testet av Genomic Laboratory basert på Cambridge. Pasienter med PCR-positive og PCR-negative testresultater for gjentatte ekspansjonsforstyrrelser ble identifisert for inkludering i vår studie gjennom laboratoriejournalsystemer; alle pasienter hadde gitt skriftlig informert samtykke til bruk av prøven deres til kvalitetssikring og forsknings- og opplæringsformål, som en del av klinisk tjenesteoptimalisering og validering.

Helgenomsekvensering av hver prøve ble utført ved ett av to laboratorier: Genomics England (Hinxton, Storbritannia) for 100 000 Genomes Project-prøvene (n=254) og Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) for prøver innhentet av Genomic Laboratory med base i Cambridge (n=150). Totalt sett ble dette datasettet brukt for den diagnostiske nøyaktighetsdelen av studien, og besto av PCR og helgenomsekvenseringsdata fra 404 pasienter, som dekker 13 loci som representerer de vanligste nevrologiske gjentatte ekspansjonsforstyrrelsene: 11 loci assosiert med ataksi og sen- begynnende nevrodegenerative lidelser (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 og FXN), ett locus assosiert med intellektuell funksjonshemming (FMR1), og ett locus assosiert med myotonisk dystrofi (DMPK). For hvert locus var PCR-testdata tilgjengelig for minst én utvidet allel (vedlegg s 24).

Klinisk nøyaktighet ble vurdert ved å undersøke samsvaret med gjentatte ekspansjoner, som påvist med helgenomsekvensering, med mistenkt klinisk diagnose etter PCR-bekreftelse hos pasienter med mistenkte genetiske nevrologiske lidelser (familiær eller tidlig debuterende former for ataksi, nevropati, spastisk paraplegi, demens , motorneuronsykdom,parkinsoniskbevegelsesforstyrrelser, intellektuell funksjonshemming eller nevromuskulære lidelser) rekruttert til 100 000 Genomes Project i 2013–17. 100000 Genomes Project er et britisk program for å vurdere verdien av helgenomsekvensering hos pasienter med udekkede diagnostiske behov i sjeldne sykdommer og kreft. Etter etisk godkjenning for 100 000 Genomes Project av East of England Cambridge South Research Ethics Committee (referanse 14/EE/1112), inkludert for dataanalyse og tilbakeføring av diagnostiske funn til pasientene, ble disse pasientene rekruttert av helsepersonell og forskere fra 13 Genomic Medicine Centers i England og ble registrert i prosjektet hvis de eller deres foresatte ga skriftlig samtykke til at deres prøver og data ble brukt i forskning, inkludert denne studien. Probander og, hvis mulig, andre familiemedlemmer, ble registrert i henhold til kvalifikasjonskriterier satt for spesifikke sjeldne sykdomstilstander (vedlegg s. 5–11). Pasienter ble rekruttert til 100 000 Genomes Project etter standard-of-care genetisk testing i NHS, som angitt i kvalifikasjonskriteriene. Standardiserte kliniske baselinedata ble registrert ved bruk av Human Phenotyping Ontology (HPO)23 mot sykdomsspesifikke datamodeller.24 Sykdomsstatusen til familiemedlemmer, i forhold til probandens kliniske indikasjon for testing, ble også samlet inn.

For å identifisere kausative gjentatte ekspansjoner hos pasienter med genetisk udiagnostisert sykdom, testet vi pasienter med mistenkte genetiske lidelser i samsvar med en gjentatt ekspansjonssykdom. Pasientene ble valgt på grunnlag av samsvar mellom deres sykdom og HPO-vilkår med gjentatte ekspansjonsassosierte lidelser. Pasientenes helgenomsekvenseringsdata ble forespurt for å søke etter utvidelser i bestemte sett med gjentakelser ved å bruke fire forskjellige gjentatte ekspansjonspaneler i henhold til deres kliniske egenskaper (vedlegg s. 5). De gjentatte utvidelsene valgt for inkludering på disse panelene er de vanligste nevrologiske sykdomsfremkallende gjentatte ekspansjonsstedene. Pasienter med kliniske egenskaper potensielt kompatible med mer enn én gjentatt ekspansjonsforstyrrelse ble testet på flere paneler. Hvis et gjentatt utvidelsesanrop ble utført ved bruk av helgenomsekvensering, ble bekreftende testing ved PCR utført.

For hver pasient med bekreftet gjentatt ekspansjon ble den lokale klinikeren informert om det potensielle diagnostiske resultatet, og bidraget fra gjentatt ekspansjon til pasientens kliniske egenskaper ble vurdert. For gjentatte utvidelser som helt eller delvis forklarte pasientens kliniske egenskaper, ble det utstedt en diagnostisk rapport i henhold til lokale standardprosedyrer.

Prosedyrer

For de historiske NHS-prøvene som ble brukt i den diagnostiske nøyaktighetsdelen av vår studie, hadde gjentatte utvidelser tidligere blitt testet ved bruk av PCR-amplifikasjon og fragmentanalyse. Southern blotting ble utført for store C9orf72-utvidelser. I den kliniske nøyaktighetsdelen av studien vår ble gjentatte utvidelser oppdaget ved hel-genomsekvensering hos pasienter fra 100 000 Genomes Project testet ved PCR i prøver lagret i NHS genetiske laboratorier. Ytterligere detaljer, inkludert primersekvenser, er gitt i vedlegget (s. 2–3, 25–26).

DNA ble klargjort for sekvensering av hele genomet ved bruk av TruSeq DNA PCR-fri bibliotekspreparat, og 150 bp eller 125 bp pared-end sekvensering ble utført på enten HiSeq 2000 eller HiSeq X-plattformer ved høykapasitets genom-anlegget for Genomics England, og ved ICSL . Genomer ble sekvensert til en gjennomsnittlig dybde på 35× (31× til 37×; vedlegg s. 27). Kort-tandem-repetisjonsgenotyping ble utført ved bruk av ExpansionHunter-programvarepakken versjon 3.1.2.25,26 Kort sagt, ExpansionHunter justerer sekvenseringslesninger over et forhåndsdefinert sett med korte tandem-repetisjoner for å estimere størrelsen på begge allelene fra et individ (vedlegg s. 3).

ExpansionHunter-utdata inkluderer et estimat av antall gjentatte elementer, total størrelse og konfidensgrense for hvert locus som vurderes. Retningslinjer fra Association for Medical Pathology og College of American Pathologists anbefaler visuell inspeksjon av variantanrop under rutinevurderingen av high-throughput sekvenseringsvarianter.27

Korte tandem-repetisjonsvarianter kan imidlertid ikke visualiseres tilstrekkelig med vanlige visualiseringsverktøy som Integrative Genomics Viewer.28 For å undersøke hele genomsekvenseringsdata som ligger til grunn for hvert genotypekall, ble et grafvisualiseringsverktøy brukt, som muliggjør direkte visualisering av haplotyper og den tilsvarende lesepileupen av ExpansionHunter genotyper (vedlegg s. 3, 15). Visuell inspeksjon av pileup-grafen ble utført på alle hele-genom-sekvensering av korte tandem-repetisjoner for å bekrefte at ExpansionHunter-prediksjonen for alleler var fullstendig inneholdt i hver avlesning (dvs. repetisjonssekvensen var mindre enn sekvenseringsavlesningslengden); å bekrefte tilstedeværelsen av en monoallel eller biallel ekspansjon; å oppdage antatte falske positive anrop; og å oppdage falsk-negative alleler i bialleliske gjentatte ekspansjoner, slik som FXN (vedlegg s. 4, 16).

ExpansionHunter estimerer gjentatt størrelse fra helgenomsekvenseringsdata ved å analysere sekvenseringsavlesninger som helt eller delvis inneholder en kort tandemrepetisjon. Hvis en kort tandem repeterende allel er kortere enn leselengden, forutsier ExpansionHunter den nøyaktige størrelsen; hvis en kort tandem repeterende allel er lengre enn leselengden, estimerer ExpansionHunter repetisjonsstørrelsen innenfor en CI, avhengig av lokussekvenssammensetningen, dybden av sekvensering og kvaliteten på sekvenseringen.

Statistisk analyse

Vi klassifiserte gjentakelser som utvidet ved sekvensering av hele genomet hvis størrelsen forutsagt av ExpansionHunter var over premutasjonsgrensen, eller ikke-utvidet hvis den forutsagte størrelsen var under grensen (vedlegg s. 28).

Sensitivitet og CI-er for gjentatt ekspansjonsdeteksjon for helgenomsekvensering ble beregnet som andelen alleler med utvidede repetisjoner blant tidligere PCR-bekreftede alleler med utvidede repetisjoner. Spesifisiteten ble estimert som andelen av ikke-ekspanderte alleler blant tidligere testede ikke-ekspanderte repetisjoner ved PCR. En fullstendig beskrivelse av de statistiske formlene er gitt i vedlegget (s. 1).

For å sammenligne gjentatte størrelser ved PCR med gjentatte størrelsesestimater ved helgenomsekvensering, ble PCR-kvantifiserte alleler sammenlignet med gjentatte størrelser forutsagt av ExpansionHunter for alleler kortere enn leselengden på tvers av alle 13 korte tandem-repetisjonsloci. Konkordansen ble beregnet av prosentandelen gjentatte størrelser forutsagt av ExpansionHunter som var i samsvar med PCR-kvantifisert størrelse, tatt i betraktning PCR-feilen på pluss eller minus én repetisjon. Statistisk analyse ble utført ved bruk av R statistisk programvare versjon 3.6.3.

Finansieringskildens rolle

Studiedesign, pasientregistrering, datainnsamling og sekvensering ble ledet av ansatte i Genomics England og akademiske forskere. Ansatte i Illumina utførte sekvensering av 150 pasientprøver som en planlagt komponent i hele genomsekvenseringsdiagnostisk nøyaktighetsstudie og utviklet ExpansionHunter. Ansatte i Genomics England, akademiske forskere og medforfattere RTH, ED og MAE utførte analysen og tolkningen av gjentatte utvidelser hos pasienter rekruttert til 100 000 Genomes Project. Finansieringskildene hadde ingen rolle i datatolkning eller skriving av rapporten.

Resultater

Den diagnostiske nøyaktigheten av helgenomsekvensering for å oppdage gjentatte utvidelser ble evaluert mot 793 PCR-tester tidligere utført innen NHS fra 404 pasienter (64 pasienter ble testet for mer enn én repetisjon; figur 1). Av disse testene ble 183 klassifisert som å ha en utvidet repetisjon og 610 som ikke å ha en gjentatt ekspansjon ved PCR, noe som ga totalt 221 utvidede og 1321 ikke-ekspanderte individuelle alleler på tvers av 13 sykdomsloki (vedlegg s. 24, 28). Helgenomsekvensering klassifiserte korrekt 215 av 221 utvidede alleler og 1316 av 1321 ikke-ekspanderte alleler sammenlignet med PCR-testresultater (vedlegg s. 27, 29), og viste en initial sensitivitet på 97,3 prosent (95 prosent CI 94·2–99 ·0) og spesifisitet på 99·6 prosent (99·1–99·9; tabell 1). Etter den visuelle korreksjonen av alle samtaler basert på kvaliteten på avlesningene, økte sensitiviteten til 99,1 prosent (96,8–99,9) og spesifisiteten til 100 prosent (99,7–100; figur 2A, tabell 1). Visualisering av de utvidede allelene muliggjorde påvisning av falske positive resultater og reklassifisering av alle falsknegative alleler i FXN, hvorav kun ett allel ble korrekt klassifisert som utvidet i prøver med biallelekspansjon (vedlegg s. 17, 18).

Gjentakelseslengden ble kvantifisert ved PCR i 509 PCR-tester som forhørte 945 alleler på tvers av 13 gjentatte ekspansjonsloci. Korrelasjoner mellom ExpansionHunter og PCR for repetisjonsstørrelser som er kortere og større enn leselengden for sekvensering (dvs. 150 bp) er vist i vedlegget (vedlegg s. 19). Høy konkordans ble observert for repetisjoner kortere enn leselengden, med 92·7 prosent (836 av 902) samsvar mellom PCR og ExpansionHunter. Lokusvariabilitet ble observert, med høy samsvar mellom ExpansionHunter og PCR for ATXN2, ATXN7, CACNA1A og HTT, og lav konkordans for DMPK eller TBP (vedlegg s 30). Lengden på alleler som var større enn avlest lengde ble undervurdert av ExpansionHunter, noe som påvirket nøyaktigheten av å kalle inn DMPK, FMR1 og FXN (figur 2B, vedlegg s. 19, 31).

Selv om ExpansionHunter var i stand til korrekt å identifisere store utvidede alleler i FMR1, DMPK, C9orf72 og FXN (vedlegg s. 29), hadde de forutsagte størrelsesestimatene en tendens til å være lavere enn de som ble oppnådd ved PCR ettersom gjentatt størrelse økte innenfor det patogene området, noe som påvirket evne til å skille mellom store og små utvidelser i DMPK, C9orf72 og FXN, eller mellom fulle utvidelser og permutasjoner i FMR1 (vedlegg s 31). For eksempel hadde loki med en PCR-vurdert repetisjonslengde større enn 200 repetisjoner i FMR1 og klassifisert som en full mutasjon en gjennomsnittlig repetisjonsstørrelse estimert av ExpansionHunter på 92·6 (SD 17·8; vedlegg s. 31).

For å teste muligheten for gjentatt ekspansjonsdeteksjon ved hjelp av helgenomsekvensering for å løse diagnosen til tidligere testede og genetisk udiagnostiserte pasienter, testet vi 11 631 pasienter med en mistenkt genetisk nevrologisk lidelse rekruttert til 100000 Genomes Project (figur 1). Helgenomsekvenseringsdata ble evaluert ved bruk av fire forskjellige gjentatte ekspansjonspaneler i henhold til pasientens kliniske egenskaper. Antall pasienter testet med hvert av de fire panelene er vist i tabell 2.

Totalt sett oppdaget og visuelt bekreftet gjentatte utvidelser i prøver fra 105 pasienter (tabell 2, vedlegg s. 20, 33). Av disse var 81 prøver tilgjengelige for bekreftende testing ved PCR, og 68 ble bekreftet å ha en gjentatt ekspansjon (0·6 prosent utbytte): 45 (1·2 prosent ) av 3692 i panel A, åtte ({ {18}}·3 prosent ) av 2743 i panel B, fem (0·6 prosent ) av 860 i panel C, og ti (0·1 prosent ) av 6731 i panel D. Tretten av 81 utvidelsesanrop ble ikke bekreftet som patogene gjentatte utvidelser (16 prosent falsk oppdagelsesrate). Av disse var to ikke-ekspanderte alleler i ATXN1 og ATXN2, fire var FMR1-mellomstørrelsesanrop (vedlegg s. 21), og syv var FMR1-permutasjoner.

Kliniske detaljer om de 68 pasientene med gjentatte utvidelser bekreftet av PCR, inkludert deres kliniske presentasjoner, gjentatt ekspansjon identifisert og bidraget fra gjentatt ekspansjon til pasientens kliniske egenskaper er gitt i tabell 3; HPO-vilkårene, repetisjonsstørrelse estimert av ExpansionHunter, og om det er utstedt en diagnoserapport er oppført i vedlegget (s. 33).

Utvidelser ble observert hos pasienter med et bredt utvalg av overlappende kliniske presentasjoner testet med panel A (tabell 3, vedlegg s. 22), inkludert en ATXN2 gjentatt ekspansjon hos en pasient med levodopa-responsiv tidlig debuterende Parkinsons sykdom og en historie med progressiv cerebellar ataksi , og AR-utvidelser hos fire pasienter som er klinisk diagnostisert med Charcot-Marie-Tooth sykdom, inkludert en med en genetisk bekreftet demyeliniserende nevropati (dvs. Charcot-Marie-Tooth sykdom type 1, pasient 42; vedlegg s. 33). Et bredt spekter av tidligere kliniske diagnoser ble observert hos pasienter med patogene gjentatte utvidelser.

For eksempel, hos syv pasienter med amyotrofisk lateral sklerose eller annen motorneuronsykdom, ble utvidelser identifisert i AR (n=4) og C9orf72 (n=3). Hos pasienter med mistenkt arvelig ataksi, identifiserte vi utvidelser i loci som ikke hadde blitt vurdert som en del av rutinemessig diagnostisk opparbeidelse innen NHS på rekrutteringstidspunktet, inkludert ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP og HTT ( tabell 3). Vi oppdaget også gjentatte utvidelser hos pasienter med kliniske trekk i samsvar med alternative gjentatte ekspansjonsforstyrrelser, inkludert en C9orf72-utvidelse ved tidlig debut og familiær Parkinsons sykdom (pasient 24, tabell 3) og gjentatte utvidelser i det reduserte penetransområdet i HTT (38 gjentakelser) hos to søstre med en bevegelsesforstyrrelse, demens, depresjon og talevansker (pasienter 44 og 45), noe som understreker den diagnostiske utfordringen som disse gjentatte ekspansjonsforstyrrelsene gir.

Åtte barn testet med panel B ble funnet å ha store gjentatte CAG-utvidelser (figur 3), hvorav syv fullstendig forklarte pasientens kliniske egenskaper. Seks pasienter hadde ikke en informativ familiehistorie og hadde ikke blitt tilbudt gjentatt utvidelsestesting som en del av sin kliniske vurdering ved rekrutteringstidspunktet (pasienter 48–53; tabell 3, vedlegg s. 33). To av disse barna bar store HTT-utvidelser (90–100 CAG-repetisjoner). Merk at ett barn hadde arvet gjentakelsen fra en upåvirket forelder uten familiehistorie med Huntingtons sykdom. Familietesting pågår, men en redusert penetrans-allel er identifisert i den utvidede familien, noe som indikerer at gjentakelsen hadde utvidet seg med over 60 gjentatte enheter i en enkelt generasjon (pasient 52). I skrivende stund viste ingen i familien tegn på Huntingtons sykdom, og genetisk rådgivning og testing pågår for foreldrene. To barn yngre enn 5 år hadde store gjentatte ekspansjoner i ATXN7 og presenterte med kompleks multisystemsykdom. For ett av disse barna (pasient 50) viste foreldrene deres gangproblemer 2 år etter påmelding til 100 000 Genomes Project. På samme måte ble det funnet at en jente på 10 år med intellektuell funksjonshemming hadde en 99-gjentatt ekspansjon i ATXN2, til tross for at begge foreldrene ble angitt som upåvirket, og en jente på 18 år med demens ble funnet å bære en { {19}}gjenta utvidelse i ATN1 (vedlegg s. 33).

Fem ekspansjoner i DMPK (panel C) ble påvist, blant annet hos et barn og en mor med en klinisk diagnose muskeldystrofi, hos to søsken med mistanke om distal myopati og hos en ungdom med medfødt myopati (pasienter 54–58). FMR1-utvidelser (panel D) ble oppdaget hos ni gutter og en jente, og en diagnose av Fragilt X-syndrom forklarte helt eller delvis de presenterende kliniske trekkene (pasienter 59–68).

Diskusjon

Diagnosen gjentatte ekspansjonsforstyrrelser er utfordrende i helsevesenet på grunn av heterogene og overlappende kliniske trekk og uspesifikke kliniske funn, som kan øke i alvorlighetsgrad med alderen og i hver påfølgende generasjon. Gjentatte ekspansjonsforstyrrelser er blant de vanligste årsakene til arvelige nevrologiske sykdommer.4 Likevel kan pasienter være underdiagnostisert, enten fordi utilstrekkelig genetisk testing er utført eller fordi de forårsakende genetiske variantene ennå ikke er oppdaget. Testtilnærminger er for tiden fragmenterte, og pasienter kan få feil gjentatt ekspansjonslokus testet29 eller motta en molekylær test for en annen klasse variant på grunn av overlapping av kliniske trekk med andre nevrologiske genetiske lidelser.30

Helgenomsekvensering har blitt brukt i flere settinger som en førstelinjediagnostisk test for sjeldne nevrologiske lidelser, men har tidligere vært antatt å ha lav evne til å oppdage gjentatte utvidelser.16 Flere verktøy er utviklet for å identifisere gjentatte utvidelser fra hele genomet. sekvensering i forskningsmiljøet31, men ingen av disse tilnærmingene har blitt brukt på helgenomsekvenseringsdata samlet inn fra et stort antall pasienter i en enkelt helsetjeneste. Vi presenterer bevis på at en algoritme designet for å oppdage gjentatte utvidelser fra helgenomsekvensering pålitelig kan vurdere de vanligste sykdomsfremkallende gjentatte utvidelsene og løse tidligere genetisk udiagnostiserte tilfeller i en stor gruppe pasienter med nevrologiske lidelser. Resultatene våre indikerer at helgenomsekvensering kan skille mellom ikke-ekspanderte og utvidede alleler med høy sensitivitet og spesifisitet på tvers av 13 gjentatte ekspansjonsloci (som kan forbedres ytterligere ved visuell inspeksjon), kan nøyaktig beregne størrelsen på alleler som er mindre enn leselengden , og kan undervurdere størrelsen på store utvidelser i FMR1, DMPK, FXN og C9orf72.

Når deteksjon av gjentatte utvidelser ved helgenomsekvensering ble vurdert mot positive og negative resultater tidligere oppnådd ved kliniske diagnostiske genomiske laboratorier ved bruk av gullstandardmetoder, fant vi minimum 97,3 prosent sensitivitet og 99,6 prosent spesifisitet. Videre viste vi at både spesifisiteten og sensitiviteten kan forbedres ved manuell kurering av avlest pileup, noe som muliggjør påvisning av falske positive resultater og reklassifisering av falsk-negative alleler i prøver med biallele ekspansjoner. Av de 6731 pasientene som ble testet for FMR1 (panel D), ble 124 samtaler spådd å bli utvidet. Vi var i stand til å ekskludere 97 gjennom visuell inspeksjon som sannsynlige falske positive. Dette indikerer at 1 av 54 helgenomsekvenseringstester ville ha et FMR1-anrop som må inspiseres visuelt for å forkaste et potensielt falskt positivt anrop. Det pågår arbeid med å forbedre ExpansionHunter-genotypingsmetoden for å redusere antall falske positive anrop for FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 repetisjoner) forårsaker mer alvorlig sykdom, og spinocerebellar ataksi type 36 (NOP56), hvor utvidelser større enn 650 gjentakelser anses som patogene og repetisjonsstørrelser på 15–650 anses som middels og varianter av usikker betydning.

Mer enn 40 gjentatte ekspansjonssteder er identifisert; mange av disse lociene har først blitt identifisert nylig og er nå assosiert med tidligere uforklarlige tilstander, inkludert cerebellar ataksi med nevropati og vestibulært areflexia syndrom (RFC1) 32 og myoklonisk epilepsi (SAMD12).33 De vanligste nevrologiske sykdomsfremkallende gjentatte ekspansjonsstedene var valgt for vår studie basert på tilgjengeligheten av positive og negative kontrollprøver.

Funnene som presenteres her tyder på at ExpansionHunter bør være i stand til å klassifisere ikke-ekspanderte og utvidede alleler nøyaktig ved ethvert gjentatt ekspansjonssted hvis de ikke-ekspanderte allelene er mindre enn leselengden (dvs. 150 bp). Selv om de fleste gjentatte ekspansjonsloci har alleler som er mindre enn 150 bp når de ikke utvides, kan noen loci der størrelsen på den ikke-ekspanderte allelen er nær 150 bp (f.eks. NOTCH2NLC)34 være vanskeligere å genotype ved å bruke denne tilnærmingen. For loci der den utvidede gjentagelsen er betydelig større enn leselengden, kan helgenomsekvensering oppdage patogene utvidelser (f.eks. NOP56,35 RFC120,32). Nye langleste sekvenseringsteknologier kan tilby komplementære tilnærminger ved genotyping av store utvidelser.36

Vurdering av gjentatte utvidelser ved bruk av hel-genomsekvensering hos 11 631 udiagnostiserte pasienter rekruttert til 100 000 Genomes Project ga 68 pasienter med forklarende funn. Pasienter ble rekruttert til 100 000 Genomes Project etter standard-of-care genetisk testing; derfor representerer andelen gjentatte utvidelser identifisert i denne kohorten en økning av det diagnostiske utbyttet fra standard NHS-testing, som inkluderer lokusspesifikk testing for gjentatte ekspansjonsforstyrrelser som FXN eller DMPK. Merk at noen diagnoser ikke ble mistenkt basert på pasientens kliniske trekk, inkludert seks pediatriske pasienter som ikke hadde noen kjent familiehistorie med en gjentatt ekspansjonsforstyrrelse. De gjennomsnittlige gjentatte ekspansjonsstørrelsene spådd av helgenomsekvensering hos pediatriske pasienter beskrevet i denne studien er vesentlig større enn gjennomsnittet hos voksne, i samsvar med forventningen om at større utvidelser er assosiert med tidligere og mer alvorlig debut, selv hos barn. Ytterligere arbeid er nødvendig, men dette funnet antyder at en aldersavhengig og gjentatt størrelsesavhengig vurdering av patogenisitet kan støtte en pediatrisk diagnose ved å redusere den potensielle faren ved å identifisere risikoalleler for voksne, noe som fører til uønsket prediktiv testing hos barn.

Våre funn muliggjør etablering av en klinisk diagnostisk arbeidsflyt for helgenomsekvensering (vedlegg s 23). Vi foreslår at visuell inspeksjon gjøres for alle anrop som er klassifisert som utvidet for å oppdage falske positive, og for bialleliske ekspansjoner der bare én utvidet allel er oppdaget (f.eks. FXN). Vi anbefaler at laboratorier bruker ExpansionHunter for å vurdere forekomsten av en utvidelse uten å følge størrelsesestimat og utføre bekreftende PCR-testing som en standardkomponent i testarbeidsflyten.

Sjeldne arvelige sykdommer inkluderer et bredt spekter av kliniske egenskaper, noe som gjør locus-spesifikk genomisk testing ineffektiv, vanskelig og kostbar. Vi presenterer bevis på at sekvensering av hele genomet av klinisk kvalitet med potensial til å diagnostisere en rekke sjeldne nevrologiske sykdommer som typisk presenteres med en enkelt base-, indel- eller kopinummervarianter, nå kan utvides til gjentatte utvidelser. Fordi helgenomsekvensering gir en enkelt test som kan identifisere de vanligste gjentatte utvidelsene, samt muliggjøre testing av punktmutasjoner og kopinummervarianter i gener assosiert med disse tilstandene samtidig, gir den muligheten til å identifisere de fleste pasienter med disse heterogene lidelsene som ikke har blitt diagnostisert ved bruk av locus-spesifikk testing. I en tid med nye terapier for disse lidelsene, kan tidlig oppdagelse bli avgjørende.37 Disse resultatene støtter implementeringen av helgenomsekvensering for påvisning av gjentatte utvidelser i kliniske diagnostiske laboratorier, en tilnærming som allerede er inkludert i NHS England National Genomic Testkatalog,38 for undersøkelse av udiagnostisert sjelden nevrologisk sykdom.

Referanser

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Et diagnostisk tak for eksomsekvensering ved cerebellar ataksi og relaterte nevrologiske lidelser. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Arvelig spastisk paraplegi i Hellas: karakterisering av en tidligere uutforsket befolkning ved bruk av neste generasjons sekvensering. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Diagnostisk utbytte av et målrettet neste generasjons sekvenseringsgenpanel for bevegelsesforstyrrelser i pediatrisk begynnelse: en 3-års kohortstudie. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Gjentatte ekspansjonssykdommer. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporal demens og/eller amyotrofisk lateral sklerose. Seattle, WA: University of Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebellar ataksi. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Klinisk nevrogenetikk: autosomal dominant spinocerebellar ataksi. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Spinal og bulbar muskelatrofi. I: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., red. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Dødelig form for spinocerebellar ataksi type 7 med tidlig debut i barndommen. Arch Pediatr 2018; 25:42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Ataxin-7 aggregering og ubiquitinering i infantil SCA7 med 180 CAG-repetisjoner. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebellar ataksi type 2 med kognitiv regresjon i barndommen. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Spinocerebellar ataksi 3 i barndommen: tungedystoni som en tidlig manifestasjon. Tremor Other Hyperkinetic Mov 2019; publisert på nett 13. september.

13 Fugl TD. Myotonisk dystrofi type 1. I: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, red. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Frekvens av SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS og C9orf72 gjentatte utvidelser hos SCA-pasienter negativ for de vanligste SCA-subtypene. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Helgenomsekvensering av pasienter med sjeldne sykdommer i et nasjonalt helsesystem. Natur 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Mot presisjonsmedisin. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Diagnostisk og klinisk nytte av helgenomsekvensering i en kohort av udiagnostiserte kinesiske familier med sjeldne sykdommer. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profilering av det genomomfattende landskapet med gjentatte tandemutvidelser. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Deteksjon av utvidelser av tandem-repetisjoner i kohorter sekvensert med kortavleste sekvenseringsdata. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Bioinformatikk-basert identifikasjon av utvidede repetisjoner: en ikke-referanse intronisk pentamer-ekspansjon i RFC1 forårsaker CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Kopinummervarianter i klinisk genomsekvensering: distribusjon og tolkning for sjelden og udiagnostisert sykdom. Genet Med 2019; 21:1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Genomomfattende påvisning av tandem-DNA-repetisjoner som utvides ved autisme. Natur 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. The Human Phenotype Ontology: et verktøy for å kommentere og analysere menneskelig arvelig sykdom. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomics England. Sjeldne sykdomstilstander kliniske datamodeller. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (åpnet 4. august 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Deteksjon av lange gjentatte utvidelser fra PCR-frie helgenomsekvensdata. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: et sekvensgrafbasert verktøy for å analysere variasjon i korte tandem-repetisjonsregioner. Bioinformatikk 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Standarder og retningslinjer for validering av neste generasjons sekvenserende bioinformatikkrørledninger: en felles anbefaling fra Association for Molecular Pathology og College of American Pathologists. J Mol Diagn 2018; 20:4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Integrativ genomikkseer. Nat Biotechnol 2011; 29:24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Fenotypisk homogenitet av den Huntington sykdomslignende presentasjonen i en SCA17-familie. Neurology 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntingtons sykdom, ligner på Huntingtons sykdom og godartet arvelig chorea: hva er nytt? Mov Disord Clin Practice 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Nylige fremskritt innen deteksjon av gjentatte utvidelser med kortlest neste generasjons sekvensering. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Biallelisk utvidelse av en intronisk repetisjon i RFC1 er en vanlig årsak til sent oppstått ataksi. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Utvidelser av intronisk TTTCA og TTTTA gjentakelser ved godartet voksen familiær myoklonisk epilepsi. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Ikke-kodende CGG-utvidelser ved nevronal intranukleær inklusjonssykdom, oculopharyngodistal myopati og en overlappende sykdom. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Rask diagnose av spinocerebellar ataksi 36 i en tre-generasjons familie ved bruk av kortleste helgenomsekvenseringsdata. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Langlest sekvensering som dukker opp i medisinsk genetikk. Front Genet 2019; 10:426.

37 Ellerby LM. Gjentatte ekspansjonsforstyrrelser: mekanismer og terapi. Nevroterapeutika 2019; 16: 924–27.

38 Nasjonalt helsevesen. National Genomic Test Directory: testkriterier for sjelden og arvelig sykdom. oktober 2021.