Bredt målrettet metabolomisk analyse for å avsløre transformasjonsmekanismen til Cistanche Deserticola aktive forbindelser under dampings- og tørkeprosesser

Cistanche deserticola er en av de mest dyrebare plantene, tradisjonelt som kinesisk medisin, og har nylig blitt brukt i farmasøytisk og sunn matindustri. Damping og tørking er to viktige trinn i behandlingen av Cistanche deserticola.

Dessverre er en omfattende forståelse av endringene i kjemisk sammensetning av Cistanche deserticola under termisk prosessering begrenset. I denne studien ble ultraytende væskekromatografi-tandem massespektrometri (UHPLC-MS/MS)-basert bredt målrettet metabolomikkanalyse brukt for å undersøke transformasjonsmekanismen til Cistanche deserticola aktive forbindelser under damp- og tørkeprosesser. Totalt 776 metabolitter ble identifisert i Cistanche deserticola under termisk prosessering, blant dem ble 77 metabolitter differensielt regulert (p < 0.05) hvor 39 ble oppregulert (UR) og 38 ble nedregulert (DR). Førtisyv (17 UR, 30 DR) og 30 (22 UR, 8 DR) differensielle metabolitter ble identifisert under henholdsvis damping og tørking.

Den største variasjonen av kjemikaliene ble observert under prosessen med damping. Metabolsk veianalyse indikerte at fenylpropanoid, flavonoidbiosyntese og alaninmetabolisme ble observert under damping, mens glycin-, serin- og treoninmetabolisme, tiaminmetabolisme og umettet fettsyrebiosyntese ble observert under tørking. De mulige mekanismene for de kjemiske endringene under termisk prosessering ble også gitt av Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway-analyse. Dessuten skjedde svertingen av utseendet til Cistanche deserticola hovedsakelig i dampingsstadiet i stedet for tørkestadiet, som er assosiert med metabolismen av aminosyrene. Alle resultater indikerte at dannelsen av aktive forbindelser under behandlingen av Cistanche deserticola hovedsakelig skjedde i dampfasen.

klikk cistanche tubulosa supplement effekter produkter

INTRODUKSJON

Cistanche deserticola, som tilhører familien Orobanchaceae, er en av de mest kjente styrkende medisinene og distribueres hovedsakelig i de tropiske og subtropiske områdene i verden, som Kina, Iran, India, Mongolia og så videre (1–3). Cistanche deserticola fungerer som en av de mest brukte urtemedisinene for behandling av nyresvikt, impotens, kvinnelig infertilitet, sykelig leukorrhea, rikelig metrorrhagia og senil (4, 5). Moderne farmakologisk forskning viste at Cistanche deserticola har effekten av å forbedre immunitet, antifatigue, anti-aldring og forbedre lærings- og memoreringsevnen (6). På grunn av disse helsefordelene har Cistanche deserticola-te laget av stammeknollene blitt utviklet som et nærende supplement og blir stadig mer foretrukket av forbrukere. De aktive ingrediensene i Cistanche deserticola er ansvarlige for dens medisinske funksjoner (7). Noen aktive ingredienser i Cistanche deserticola, som fenylpropanoider (for eksempel fenyletanoidglykosider), flavonoider, polysakkarider, oligosakkarider, iridoider og lignaner er rapportert i tidligere studier (6, 8).

På grunn av de lett bedervelige og sesongmessige egenskapene, er forsyningen av fersk Cistanche deserticola ikke tilgjengelig hele året, og derfor blir den bearbeidede Cistanche deserticola den viktigste forbruksformen. Kvaliteten på Cistanche deserticola er avhengig av mange faktorer, som klima, habitater, verter, høstingstid, prosesseringsteknologi og plantens plassering, blant annet prosessteknologi er spesielt viktig (4). Damping og tørking er to viktige trinn i behandlingen av Cistanche deserticola. Vanligvis ble det høstede Cistanche deserticola rhizom dampet i en dampkoker ved 93◦C i 30 minutter og deretter tørket ved 60◦C inntil fuktighetsinnholdet på 10 prosent på våt basis (vb) (9).

Tidligere studier har vist at damping kan fremme akkumulering av aktive ingredienser i Cistanche deserticola, slik som fenyletanoidglykosider, løselige sukkerarter og polysakkarider, ledsaget av sverting av utseendets farge (9–11). De fleste av de tidligere studiene fokuserte imidlertid på visse spesifikke forbindelser, og svært sjelden forskning handler om endringene i alle de kjemiske forbindelsene og metabolittkonverteringsmekanismen under prosessering. Derfor er det nødvendig å klargjøre metabolittendringene til Cistanche deserticola i forskjellige prosessstadier.

Metabolomics brukes vanligvis til kvalitativ og kvantitativ analyse av alle små molekyler (nemlig målrettede og ikke-målrettede forbindelser) påvist i prøven (12). Analyse av endringer i ulike kjemiske komponenter under matforedling bidrar til å utdype forståelsen av mekanismen for kjemisk komponenttransformasjon i matforedling (12). De siste årene har metabolomikk også blitt brukt til studiet av Cistanche deserticola for å skille mellom forskjellige deler (11) og forskjellige Cistanche deserticola-arter (13).

Deteksjonsmetodene for metabolitter i disse studiene var for det meste basert på målrettet og ikke-målrettet metabolomikk. Blant dem er målrettet metabolomikk basert på standardprodukter, med høy datanøyaktighet og pålitelighet, men begrenset dekning av metabolitter. Målrettet metabolomikk er en viktig del av metabolomikkforskning, det er målrettet og spesifikk påvisning og analyse av spesifikke metabolittgrupper, snarere enn alle komponentene i prøven. Ikke-målrettet metabolomikkteknologi kan kvalitativt bestemme metabolittene basert på eksisterende databaser, med høy dekning av forbindelser, men lav nøyaktighet. Nøkkelmetabolittene må bekreftes av standardprodukter (14). Bredt målrettet metabolomikk er en ny teknologi som integrerer fordelene med ikke-målrettede og målrettede metabolittdeteksjonsteknologier for å oppnå bred dekning, høy gjennomstrømning og følsomhet (15).

Følgelig har denne teknologien blitt mye brukt i studiet av ingrediensendringer i forskjellige materialer under prosessering, for eksempel aktive ingredienser i funksjonelle matvarer ved forskjellige prosesseringsmetoder (16), flavonoider og fenylpropanoider-forbindelser i kinesisk vannkastanje behandlet med forskjellige metoder (17) , risgulningsmekanisme under gulningsprosessen (18), og dannelsesmekanismen for karakteristisk ikke-flyktig kjemikalie utgjøres under oolong-te-fremstillingsprosessen (19). Derfor er det teoretisk mulig å bruke bredt målrettet metabolittteknologi for å studere mekanismen for omdannelsen av aktive ingredienser under behandlingen av Cistanche deserticola.

Målet med denne studien var således å (1) gi nyttig informasjon om de kjemiske endringene i Cistanche deserticola under damp- og tørkeprosesser ved å bruke ultraytelses væskekromatografi-tandem massespektrometri (UHPLC-MS/MS) kombinert med en bredt målrettet metabolomikk. nærme seg; (2) identifisere differensialmetabolittene og deres reguleringsregler, og avsløre mulige konverteringsveier i Cistanche deserticola under prosessering. Denne studien forventes derfor å gi en teoretisk referanse for dannelsesmekanismen til høykvalitets Cistanche deserticola.

MATERIALER OG METODER Materialer og kjemikalier

Råvarer: Friske Cistanche deserticola-prøver ble hentet fra Hetian-regionen i Xinjiang-provinsen i Kina. Prøvene ble nøye utvalgt med samme størrelse (gjennomsnittlig lengde, diameter og vekt var henholdsvis 11,7 ± 1,1 cm, 7,0 ± 1,1 cm og 360 ± 8,9 g). Prøvene ble lagret ved romtemperatur i et mørkt miljø med et initialt fuktighetsinnhold på ca. 78,56 prosent ± 3,47 prosent. Før eksperimentene ble prøver fra Cistanche deserticola vasket med vann fra springen for å fjerne støvet på overflaten. Overflødig vann på overflaten ble fjernet ved å tøye papir.

Kjemikalier: Metanol, acetonitril og maursyre var væskekromatografisk massespektrometrikvalitet (LC-MS) og kjøpt fra Merck (Sigma Aldrich, MO, USA). De andre analytiske standardene viste en renhet høyere enn 98 prosent (Sigma Aldrich, MO, USA).

Eksperimentelt design

Tidligere studier har vist at de kjemiske forbindelsene fordeler seg ujevnt i lengderetningen til Cistanche deserticola (1). Derfor, for å oppnå det samme innledende innholdet av kjemiske forbindelser i hver prøve, i den nåværende forskningen ble alle utvalgte Cistanche deserticola kuttet i tre like deler for den ferske gruppen (A), dampet uten tørkegruppe (B) og tørket etter dampingsgruppen (C), henholdsvis ved langsgående segmentering med den langsgående symmetriaksen som sentrum (20).

For gruppe B ble prøvene suksessivt dampet i 8 minutter i henhold til foreløpige eksperimenter. Et pulserende vakuum dampende utstyr (egenutviklet av China Agricultural University, Beijing, Kina) ble brukt til dampbehandling av ferske Cistanche deserticolas. Dampte prøver ble tørket i en vakuum frysetørker (LGJ-25C, Si Huan Scientific Instrument Factory Co., Beijing, Kina). Temperaturen på varmeplaten og kuldefellen var henholdsvis 30 og −60◦C. For gruppe C ble prøvene suksessivt dampet ved bruk av pulsert vakuumutstyr i 8 minutter og tørket i varmluftstørkeren (egenutviklet av China Agricultural University, Beijing, Kina) til det endelige fuktighetsinnholdet på 10 prosent (wb). Luftstrømmen og temperaturen ble satt til henholdsvis 6 m/s og 60◦C, med henvisning til forskningsresultatene til Zou et al. (11). Alle prøver ble lagret ved -20◦C ikke mer enn 7 dager før videre analyse.

Bestemmelse av utseendefargen til Cistanche Deserticola

Utseendefargen til Cistanche deserticola før og etter hver termisk behandling ble målt ved hjelp av et kolorimeter (SMY2000SF, Shengming Yang Co., Beijing, Kina), og svartheten ble karakterisert av en L ∗-verdi.

Prøveforberedelse og ekstraksjon

Metabolittekstraksjonen ble utført i henhold til metoden rapportert tidligere av Chen et al. (21) med noen mindre modifikasjoner. Kort fortalt ble de tørkede prøvene knust ved bruk av en blandemølle (MM 400, Retsch Company, Haan, Tyskland) med en zirkoniumoksidperle i 2 minutter ved 60 Hz. Deretter ble 50 mg pulver (siktet gjennom en 65 mesh sikt) av hver prøve nøyaktig veid, overført til et Eppendorf-rør og ekstrahert med 1 ml metanol/vann-blanding (v:v=3:1). Etter 30 s vortex ble blandingen homogenisert to ganger ved 35 Hz i 4 minutter, sonikert i 15 minutter i et isvannbad og deretter ristet over natten ved 4◦C. Etter sentrifugering ved 12,000 rpm i 15 minutter ved 4◦C, ble supernatanten oppsamlet og filtrert gjennom en 0,22-µm membran, deretter ble det oppnådde ekstraktet overført til 2 ml hetteglass og lagret ved -80◦C til UHPLC-MS/MS-analysen.

Metabolitteranalyse ved UHPLC-MS UHPLC-betingelser

UHPLC-separasjonen ble utført ved bruk av et EXIONLC-system (Sciex Technologies, Framingham, MA, USA). De analytiske forholdene var som følger: kolonne: Waters ACQUITY UHPLC HSS T3 C18 (1,8 µm, 2,1 × 100 mm); løsningsmiddelsystem: mobil fase A (0,1 prosent maursyre i vann) og mobil fase B (inneholdende av acetonitril). Gradientprogrammet: 98 prosent A/2 prosent B ved 0 min, 50 prosent A/50 prosent B ved 10 min, 5 prosent A/95 prosent B ved 11 min, 98 prosent A/2 prosent B ved 13,1 min, og 98 prosent A/2 prosent B ved 15 min. Strømningshastighet: 0,40 ml/min; kolonnetemperatur: 40◦C; injeksjonsvolum: 2 ul; automatisk injeksjonstemperatur: 4◦C.

ESI-QTRAP-MS/MS-betingelser

Et trippelt kvadrupol (QQQ)-lineært ionefelle-massespektrometer (QTRAP, API 6500 QTRAP UHPLC-MS/MS) pluss QQQ-spektrometer utstyrt med et ESI turbo-ion-spray-grensesnitt (Sciex Technologies, Framingham, MA, USA) ble brukt for MS analyse. De analytiske forholdene var som følger: ionesprayspenning: pluss 5500 V (positiv ionemodus)/−4500 V (negativ ionemodus), gardingass: 35 psi, kildetemperatur: 400◦C, ionekildegass 1: 60 psi, ionekildegass 2: 60 psi, deklusjonspotensial: ±100 V. QQQ-skanninger ble innhentet som multiple reaksjonsovervåking (MRM) eksperimenter med kollisjonsgass (nitrogen) satt til 5 psi.

Kvalitativ og kvantitativ analyse av metabolitter

Kvalitative og kvantitative analyser av metabolitter ble utført i henhold til metodene til Liu et al. (18). Primære og sekundære massespektrometridata ble kvalitativt analysert basert på den selvbygde humane metabolomdatabasen (MWDB) (Metware Biotechnology Co., Ltd. Wuhan, Kina) og den offentlige databasen. I mellomtiden, for å sikre nøyaktigheten av den kvalitative analysen av noen stoffer, ble interferenser fra gjentatte signaler av Na pluss, NH pluss 4, K pluss og ioner, og repeterende signaler fra fragmentioner avledet fra andre relativt store molekyler og isotopsignaler fjernet under identifikasjon. Metabolittstrukturanalyse ble utført angående de offentlige databasene (Mass Bank, KNApSAcK, HMDB, MoTo DB og METLIN).

Metabolittkvantifisering ble utført ved å bruke MRM-modusen til QQQ massespektrometri. I MRM-modus ble forløperionene (foreldreionene) til målstoffene og ekskluderte ioner tilsvarende andre stoffer med forskjellig molekylvekt screenet først ved å bruke kvadrupolstaven for å eliminere interferens. Forløperionene bryter deretter gjennom kollisjonskammeret for å danne mange fragmentjern etter ionisering, som ble filtrert av QQQ for å velge enkeltfragmentioner med de ønskede egenskapene samtidig som interferens fra ikke-målioner elimineres. Til slutt, etter å ha innhentet metabolittmassespektrometridata for forskjellige prøver, ble massespektrumtoppene for alle stoffene integrert, og massespektratoppene til samme metabolitt i forskjellige prøver ble integrert og korrigert ved bruk av Multi Quant versjon 3.0 .2 (ABSCIEX, Concord, Ontario, Canada). Det tilsvarende relative metabolittinnholdet ble representert som kromatografiske topparealintegraler.

Databehandling og analyse

De metabolske dataene ble behandlet ved hjelp av ortogonal partiell minste kvadraters-diskriminerende analyse (OPLS-DA) og hierarkisk klyngeanalyse (HCA). OPLS-DA ble brukt til å diskriminere hver gruppe; den er mer sensitiv enn andre statistiske metoder for variabler med lave korrelasjoner (17). OPLS-DA-modellene ble validert gjennom en permutasjonsanalyse (200 ganger). Modellen ble ansett som stabil når modellparametrene (R2 og Q2) begge var nær 1.

Verdiene for variabel betydningsprojeksjon (VIP) for metabolitter ble beregnet. Enhver metabolitt med VIP-verdier større enn 1.0 og p-verdier mindre enn 0.05 ble valgt som biomarkører for hver paret sammenligning mellom forskjellige termiske behandlingstrinn av Cistanche deserticola. Screeningen av forskjellige metabolitter ble visualisert i form av en vulkanplott. Metabolittakkumulering blant forskjellige prøver ble analysert ved å bruke R-pakken (www.rproject.org/). Venn-diagrammet ble bygget i henhold til programmets nettbaserte smartdiagram R (https://cloud.smartdraw.com/). Kommersielle databaser, som Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (https: //www.kegg.jp/kegg/), Pub Chem (https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/), Small Molecule Pathway Database (SMPDB) (https://smpdb.ca/), og HMDB (https://hmdb.ca/), ble brukt til anrikningsanalyse av differensielle metabolitter og finne metabolske veier.

RESULTATER OG DISKUSJON Utseende Fargeendringer av Cistanche Deserticola under termisk behandling

Forskjellen i utseendefarge på Cistanche deserticola mellom de ferske, dampede og tørkede prøvene er representativt vist i figur 1. Fra ferske til tørkede prøver under behandlingsstadiet endret utseendet til prøvene seg fra gulbrun til mørk svart , og mørket i fargen ble mer og mer tydelig (den tilsvarende L ∗-verdien ble redusert fra 50,26 til 24,90). Utseendeendringene til Cistanche deserticola skjedde hovedsakelig i dampingsprosessen. Maillard-reaksjonen, hvor sukkerarter reagerer med aminosyrer under termiske forhold (22), vil i stor grad være ansvarlig for det mørkfargede utseendet til bearbeidede jordstengler av Cistanche deserticola. Tidligere forskningsstudier har vist at forløpere ble omdannet til fargestoffer og genererte stoffer med mørk farge i Maillard-reaksjonen (23). Lignende funn ble også observert i tidligere studier for damping av Polygonum multiflorum (24) og rhizomer av Polygonatum cystoma (25). Mørket til de dampede prøvene ble ytterligere utdypet etter tørking. Dette fenomenet skyldtes sannsynligvis forekomsten av en reduksjon i pigmentkonsentrasjonen under tørkeprosessen.

Oversikt over metabolittene i rå- og termisk behandlede Cistanche Deserticola-prøver

Det totale ionekromatogrammet (TIC) av kvalitetskontrollprøven (QC) (en blanding av alle prøvene som ble undersøkt) og et flertoppdeteksjonsplott av kjemikalier i MRM-modus for samme prøve er illustrert i tilleggsfigur 1. Ulike fargede topper representert ulike komponenter i prøven. Som vist i figur 2 ble en total mengde på 776 metabolitter identifisert i den nåværende studien (tilleggstabell 1) i de ferske Cistanche deserticola-prøvene, som ble delt inn i 15 klasser, inkludert 40 aminosyrer og derivater, 33 fenylpropanoider, 23 flavonoider, 68 flavoner, 67 terpener, 67 fenoler, 87 alkaloider, 13 karbohydrater, 28 nukleotider og derivater, 5 alkoholer og polyoler, 3 purinnukleosider, 15

karboksylsyrer og derivater, 14 organiske syrer og derivater, 12 fytohormoner og 28 andre kjemikalier. Blant dem var den største gruppen aminosyrer og derivater, hvis relative innhold utgjorde 30,26 prosent av den totale metabolittsammensetningen. I tillegg ble 10 typer fenyletanoidglykosider, som echinacoside og verbascoside, påvist og klassifisert i fenylpropanoider-gruppen.

Akkumuleringsmønsteret av metabolitter blant forskjellige behandlingsgrupper ble analysert av HCA. Som vist i figur 3 ble 107 identifiserte metabolitter av Cistanche deserticola gruppert i varmekart basert på euklidisk avstandsaritmetikk. Metabolitter identifisert ved forskjellige termiske prosesseringstrinn ble samlet i tre klynger i henhold til dendrogrammet. Den lysere fargen indikerer det høyere innholdet av en bestemt metabolitt i den respektive prøven. Varmekartet til HCA viste større forskjeller i overflod mellom de ferske og dampede prøvene enn de mellom dampede og tørkede prøver, noe som indikerer at metabolitter i Cistanche deserticola kan ha forskjellige transformasjoner under dampings- og tørkestadiet, og typene og mengdene av metabolitter som er involvert i dampingsprosessen er flere enn de i tørkeprosessen.

Differensiell metabolittanalyse av Cistanche Deserticola ved forskjellige termiske behandlingsstadier

For en bedre forståelse av virkningen av hver prosessering på metabolittene til Cistanche deserticolas, er OPLS-DA-spredningsskårene for parvise sammenligningsgrupper vist i figur 4A, som viser at de ferske, dampede og tørkede etter damping av Cistanche deserticolas var signifikant forskjellige. Dessuten indikerte R2Y og Q2 (som vist i tilleggsfigur 2) med høye testverdier at denne modellen var svært pålitelig uten overmontering.

For å screene ekspresjonsnivået til metabolitter mellom de ferske, dampede og tørkede etter damping av Cistanche deserticola, ble analysen av vulkanplottet videre brukt blant alle 776 metabolitter identifisert i henhold til fold-endringen, kombinert med VIP-verdier for å screene de differensielt uttrykte metabolitter. Signifikante differensielle metabolitter ble valgt i henhold til kriteriet om at en fold endrer score på større enn eller lik 2 eller mindre enn eller lik 0.5 med en VIP større enn eller lik 1. Screeningsresultatene er illustrert i Figur 4B. I det vulkanske kartet representerer hvert punkt en metabolitt og fargen på de spredte prikkene representerer det endelige screeningsresultatet. Rødt representerer metabolitter som er betydelig oppregulert (UR), grønt representerer de som er betydelig nedregulert (DR), og grått representerer de som er ubetydelig forskjellige. Som vist i figur 4B, 47 metabolitter i den ferske vs. dampede gruppen (17 UR og 30 DR), 30 metabolitter i den dampede vs. tørkede gruppen (22 UR og 8 DR), og 65 metabolitter i den ferske vs. tørkede gruppen (29 UR og 36 DR) ble valgt til å være signifikant differensial. Antallet signifikant forskjellige metabolitter i den ferske vs. dampede gruppen var høyere enn de i den dampede vs. tørkede gruppen, noe som indikerer at påvirkningen på metabolitter i dampingsprosessen er høyere enn i tørkeprosessen.

De differensielle metabolittene produsert under den termiske behandlingen av Cistanche deserticola ble videre klassifisert og sammenlignet. Disse differensielt uttrykte metabolittene ble klassifisert i 21 klasser, hovedsakelig aminosyrer og deres derivater, flavonoider og deres derivater, fenylpropanoider, alkaloider, terpener, fenoler og nukleotider og deres derivater (tabell 1). I gruppen fersk vs. dampet kan det bli funnet at flavonoider (som isoquercitrin, troxerutin, cyanidin og fisetin), fenylpropanoider (som klorogensyre og 3-(3,4-dihydroksy{ {5}}metoksy)-2-propensyre), og nukleotid og deres derivater (uracil og beta-Nikotinamidmononukleotid) var signifikant DR, mens aminosyrer og deres derivater (som N6-acetyl-L-lysin , 1- Mety-L-histidin og L-Phenylalanine) var signifikant UR.

I gruppen dampet vs. tørket var imidlertid uttrykkstrendene for disse typene differensielle metabolitter motsatt. Noen aminoer og deres derivater (som N, N-dimetylglysin), nukleotid og deres derivater (som 2'-Deoksyuridin; Deoksyuridin) var signifikant DR, mens de fleste av fenolene (som metylgallat og 4'-Prenyloksyresveratrol), flavonoider (som isoquercitrin og cyanidin), fenylpropanoider (verbascoside) og terpener (som terpinolen og furanon) var signifikant UR. Disse resultatene viste at den kjemiske sammensetningen av Cistanche deserticola har gjennomgått omdannelse under termisk prosessering, noe som hovedsakelig gjenspeiles i omdannelsen av flavonoider, fenylpropanoider og aminosyrer, og omdannelsesmekanismen til disse komponentene er forskjellig i forskjellige prosesstrinn.

Bruk av høy temperatur under dampings- og tørkeprosessene ble tidligere funnet å fremme hydrolyse, redoks, isomerisering, substitusjon og andre termofysiske og kjemiske reaksjoner av metabolitter (26). I denne studien ble det funnet at metabolittene, som flavonoider og fenylpropanoider, ble betydelig akkumulert i den dampede Cistanche deserticola sammenlignet med deres tilsvarende ferske, noe som indikerer at noen viktige fysiologiske og metabolske aktiviteter som fører til syntese av flavonoider og fenylpropanoider kan være aktivert under høy temperatur og fuktighet. Dette resultatet kan også støttes av rapporten fra Peng et al. (10) som fant at innholdet av PhG (som tilhører fenylpropanoider) økte etter damping. Akkumuleringen av disse komponentene i den tørkede prøven etter damping viste imidlertid en betydelig nedgang, noe som kan tilskrives den termiske nedbrytningen av disse varmefølsomme komponentene under den langsiktige tørkeprosessen. Tidligere studier har vist at flavonoidglykosider kan dekomponeres til sukkerlegemer og flavonoidaglykoner under termiske forhold, og flavonoidtapet under tørkeprosessen ble syntetisk påvirket av temperatur og tørketid (26, 27). Oppreguleringen av aminosyrer og deres derivater (N6-Acetyl-L-lysin, 1-Methy-L-histidin og fenylalanin) tilskrives den høytemperaturfremmende proteinnedbrytningen under dampbehandling. I tillegg ble det også observert at noen andre aminosyrer og deres derivater av N, N-dimetylglysin, L-Kynurenin, glycin, serin og treonin var DR. Nedgangen i innholdet av disse aminosyrene kan være assosiert med en termisk-indusert Maillard-reaksjon der reduserende sukker reagerer med aminosyrer for å generere 5-HMF, noe som bidrar til produksjonen av et svart utseende i Cistanche deserticola (22) .

Resultatene av seksjonsutseendefargeendringer av cistanche deserticola under termisk prosessering bekreftet ytterligere denne hypotesen. Derfor var svertingen av Cistanche deserticola under damping sannsynligvis relatert til metabolismen av aminosyrer. Venn-diagram ble brukt for å differensiere de vanlige og eksklusive metabolittene til Cistanche deserticola under forskjellige termiske prosesseringstrinn. Som vist i figur 4C eksisterer både vanlige og unike metabolitter mellom de forskjellige sammenligningsgruppene. 21 vanlige metabolitter ble observert mellom den ferske og dampede gruppen, mens bare 5 og 10 metabolitter ble funnet felles mellom henholdsvis den ferske og tørkede gruppen og den dampede og tørkede gruppen. Således ble totalt 23 og 17 eksklusive metabolitter (p < 0,05) observert i Cistanche deserticola under det termiske prosesseringsstadiet med henholdsvis damping og tørking. Dette resultatet bekreftet videre at damping var spesielt kritisk for omdannelsen av metabolitter under behandling av Cistanche deserticola.

Anrikningsanalyse og KEGG Pathway Impact Analysis av differensielle metabolitter

De differensielle metabolittene (p < 0.05) i ferske og bearbeidede prøver ble kartlagt til KEGG, HMDB og PubChem online databaser, som inneholder kunnskap om molekylær interaksjon, reaksjon og relasjonsnettverk, og berikelsesresultatene og detaljerte metabolske veier er vist i tilleggstabell 2 og figur 5. Som vist i figur 5a1 og a2 avslørte virkningen av traseen berikelsen av fenylpropanoidbiosyntese, flavonoidbiosyntese, alaninmetabolisme, riboflavinmetabolisme, taurin- og hypotaurinmetabolisme og nikotinamidmetabolisme og nikotinamidmetabolisme. metabolisme under damping av Cistanche deserticola. Mens, under tørkeprosessen etter damping, inneholdt de metabolske banene til de differensielle metabolittene hovedsakelig glycin-, serin- og treoninmetabolisme, tiaminmetabolisme, pyrimidinmetabolisme og umettede fettsyrebiosyntese.

Videre overlappet noen metabolske veier mellom disse to parvise sammenligningene, slik som nikotinat- og nikotinamidmetabolisme, fenylpropanoidbiosyntese og flavonoidbiosyntese, men berikelsesnivåene deres var svært forskjellige i de to parvise sammenligningene. Disse resultatene antydet at omdannelsesveiene til metabolitter mellom dampings- og tørkeprosessene til Cistanche deserticola var forskjellige, og forskjellene i metabolske veier kunne forklare forskjellene i tilstedeværelsen av differensielt eksklusive metabolitter under termisk prosessering. Disse biokjemiske endringene kan brukes til å forstå virkningen av termiske prosesstrinn på Cistanche deserticola-sammensetningen.

fire metabolske veier (fenylpropanoidbiosyntese, flavonoidbiosyntese, alaninmetabolisme og glycin-, serin- og treoninmetabolisme) ble valgt som nøkkelmetabolitter for å karakterisere omdannelsen av de viktigste aktive komponentene i Cistanche deserticola under termisk prosessering (figur 5b1,b2). Den nåværende studien indikerte at fenylpropanoider og flavonoider ble akkumulert, men aminosyrer ble degradert i dampet Cistanche deserticola sammenlignet med ferske og tørkede prøver. Fenylpropanoid biosynteseveien er oppstrøms for biosynteseveien til flavonoider. Lignende konklusjoner ble publisert av Liu et al. (18) som rapporterte at akkumuleringsnivået av fenylpropanoider i prosessen med gulning av ris har økt betydelig sammenlignet med vanlig ris. Fenylpropanoider er avledet fra kanelsyre, og deres forløper er fenylalanin, som kan syntetiseres ved å aktivere aktiviteten til fenylalanin ammoniakklyase (PAL) ved oppvarming (28).

Tidligere studier rapporterte at fenylpropanoid-banen fører til biosyntesen av kumariner, flavoner, isoflavoner og flavonoler, som er viktige våpen for planteforsvar (29), og for å forhindre celledød forårsaket av det sterke varmestresset i dampprosessen, fenylpropanoiden. vei kan bli forbedret på grunn av biologisk stress forårsaket av høy temperatur (30, 31). Flavonoider er de viktigste sekundære metabolittene avledet fra fenylpropanoider (32), og deres akkumulering kan beskytte planter mot oksidativ skade ved å rense frie radikaler (33). Sammenlignet med den ferske og tørkede Cistanche deserticola, kan den høyere biosyntesen av flavonoider i den dampede Cistanche deserticola være assosiert med økt varmestress under dampingsprosessen som beskytter reaktive oksygenarter (ROS) (34, 35). Som vist i figurene 5b3 og b4, spilte aminosyremetabolisme en viktig rolle i den termiske prosesseringen av Cistanche deserticola. Innholdsendringer av alanin, glycin, serin og treonin etter damping funnet i medisinske urter har blitt brukt for å indikere forekomsten av Maillard-reaksjonen (36).

Ikke desto mindre, på grunn av den kompliserte prosessen med Cistanche deserticola-damping, bør en omfattende evaluering av Cistanche deserticola-dampingen, slik som sverting i utseende, aktive forbindelser og metabolske biomarkører, undersøkes ytterligere.

KONKLUSJONER

I denne studien ble UHPLC-MS/MS-basert bredt målrettet metabolomikk-tilnærming brukt for å studere dannelsesmekanismen til aktive forbindelser ved forskjellige termiske prosesseringsstadier av Cistanche deserticola. De nåværende resultatene avslørte at biosyntesen av noen nøkkelmetabolitter, som fenylpropanoider og flavonoider, ble betydelig forbedret under dampingsprosessen. Ekspresjonsnivået av aminosyrer i dampet Cistanche deserticola ble forbedret, noe som indikerer transformasjonen mellom primære og sekundære metabolitter. I tillegg skjedde svertingen av utseendet til Cistanche deserticola hovedsakelig i dampingsstadiet i stedet for tørkestadiet, denne egenskapen er assosiert med aminosyremetabolismen. Nivåene av metabolittene ovenfor sank imidlertid betydelig under tørkeprosessen, noe som tyder på at dannelsen av aktive forbindelser hovedsakelig skjedde i dampingsfasen under den termiske behandlingen av Cistanche deserticola. Så vidt vi vet, er dette første gang den bredt målrettede metabolomiske metoden ble brukt for å avsløre mekanismen for endringer i aktive forbindelser under termisk prosessering og deres avgjørende bidrag til Cistanche deserticola-svertingen. Det er imidlertid behov for ytterligere undersøkelser for en bedre forståelse av forholdet mellom biosyntesen av aktive forbindelser og svertingen av utseendet under termisk prosessering.

Anrikningsanalyse og KEGG Pathway Impact Analysis av differensielle metabolitter

De differensielle metabolittene (p < 0.05) i ferske og bearbeidede prøver ble kartlagt til KEGG, HMDB og PubChem online databaser, som inneholder kunnskap om molekylær interaksjon, reaksjon og relasjonsnettverk, og berikelsesresultatene og detaljerte metabolske veier er vist i tilleggstabell 2 og figur 5. Som vist i figur 5a1 og a2 avslørte virkningen av traseen berikelsen av fenylpropanoidbiosyntese, flavonoidbiosyntese, alaninmetabolisme, riboflavinmetabolisme, taurin- og hypotaurinmetabolisme og nikotinamidmetabolisme og nikotinamidmetabolisme. metabolisme under damping av Cistanche deserticola. Mens, under tørkeprosessen etter damping, inneholdt de metabolske banene til de differensielle metabolittene hovedsakelig glycin-, serin- og treoninmetabolisme, tiaminmetabolisme, pyrimidinmetabolisme og umettede fettsyrebiosyntese. Videre overlappet noen metabolske veier mellom disse to parvise sammenligningene, slik som nikotinat- og nikotinamidmetabolisme, fenylpropanoidbiosyntese og flavonoidbiosyntese, men berikelsesnivåene deres var svært forskjellige i de to parvise sammenligningene. Disse resultatene antydet at omdannelsesveiene til metabolitter mellom dampings- og tørkeprosessene til Cistanche deserticola var forskjellige, og forskjellene i metabolske veier kunne forklare forskjellene i tilstedeværelsen av differensielt eksklusive metabolitter under termisk prosessering. Disse biokjemiske endringene kan brukes til å forstå virkningen av termiske prosesstrinn på Cistanche deserticola-sammensetningen.

Basert på KEGG-annoteringen og berikelsesanalysen ble fire metabolske veier (fenylpropanoidbiosyntese, flavonoidbiosyntese, alaninmetabolisme og glycin-, serin- og treoninmetabolisme) valgt som nøkkelmetabolitter for å karakterisere omdannelsen av de viktigste aktive komponentene i Cistanche deserticola under behandlingen. behandling (figur 5b1,b2). Den nåværende studien indikerte at fenylpropanoider og flavonoider ble akkumulert, men aminosyrer ble degradert i dampet Cistanche deserticola sammenlignet med ferske og tørkede prøver. Fenylpropanoid biosynteseveien er oppstrøms for biosynteseveien til flavonoider. Lignende konklusjoner ble publisert av Liu et al. (18) som rapporterte at akkumuleringsnivået av fenylpropanoider i prosessen med gulning av ris har økt betydelig sammenlignet med vanlig ris. Fenylpropanoider er avledet fra kanelsyre, og deres forløper er fenylalanin, som kan syntetiseres ved å aktivere aktiviteten til fenylalanin ammoniakklyase (PAL) ved oppvarming (28).

Tidligere studier rapporterte at fenylpropanoid-banen fører til biosyntesen av kumariner, flavoner, isoflavoner og flavonoler, som er viktige våpen for planteforsvar (29), og for å forhindre celledød forårsaket av det sterke varmestresset i dampprosessen, fenylpropanoiden. vei kan bli forbedret på grunn av biologisk stress forårsaket av høy temperatur (30, 31). Flavonoider er de viktigste sekundære metabolittene avledet fra fenylpropanoider (32), og deres akkumulering kan beskytte planter mot oksidativ skade ved å rense frie radikaler (33).

Sammenlignet med den ferske og tørkede Cistanche deserticola, kan den høyere biosyntesen av flavonoider i den dampede Cistanche deserticola være assosiert med økt varmestress under dampingsprosessen som beskytter reaktive oksygenarter (ROS) (34, 35). Som vist i figurene 5b3 og b4, spilte aminosyremetabolisme en viktig rolle i den termiske prosesseringen av Cistanche deserticola. Innholdsendringer av alanin, glycin, serin og treonin etter damping funnet i medisinske urter har blitt brukt for å indikere forekomsten av Maillard-reaksjonen (36). Ikke desto mindre, på grunn av den kompliserte prosessen med Cistanche deserticola-damping, bør en omfattende evaluering av Cistanche deserticola-dampingen, slik som sverting i utseende, aktive forbindelser og metabolske biomarkører, undersøkes ytterligere.

KONKLUSJONER

I denne studien ble UHPLC-MS/MS-basert bredt målrettet metabolomikk-tilnærming brukt for å studere dannelsesmekanismen til aktive forbindelser ved forskjellige termiske prosesseringsstadier av Cistanche deserticola. De nåværende resultatene avslørte at biosyntesen av noen nøkkelmetabolitter, som fenylpropanoider og flavonoider, ble betydelig forbedret under dampingsprosessen. Ekspresjonsnivået av aminosyrer i dampet Cistanche deserticola ble forbedret, noe som indikerer transformasjonen mellom primære og sekundære metabolitter. I tillegg skjedde svertingen av utseendet til Cistanche deserticola hovedsakelig i dampingsstadiet i stedet for tørkestadiet, denne egenskapen er assosiert med aminosyremetabolismen. Nivåene av metabolittene ovenfor sank imidlertid betydelig under tørkeprosessen, noe som tyder på at dannelsen av aktive forbindelser hovedsakelig skjedde i dampingsfasen under den termiske behandlingen av Cistanche deserticola. Så vidt vi vet, er dette første gang den bredt målrettede metabolomiske metoden ble brukt for å avsløre mekanismen for endringer i aktive forbindelser under termisk prosessering og deres avgjørende bidrag til Cistanche deserticola-svertingen. Det er imidlertid behov for ytterligere undersøkelser for en bedre forståelse av forholdet mellom biosyntesen av aktive forbindelser og svertingen av utseendet under termisk prosessering.

ERKLÆRING AV DATA TILGJENGELIGHET

De originale bidragene presentert i studien er inkludert i artikkelen/Tilleggsmaterialet, ytterligere henvendelser kan rettes til tilsvarende forfatter/e.

FORFATTERBIDRAG

ZA utførte eksperimentell design, utførte eksperimentene, genererte dataene og skrev dette manuskriptet. YZ utførte metabolomikkanalysen. XL ga den statistiske analysen. WS gjennomførte databehandling og etterforskning. Finansieringsanskaffelse, overordnet rammeverk og skrivegjennomgang ble fullført av YL. Alle forfattere bidro til artikkelen og godkjente den innsendte versjonen.

FINANSIERING

Dette arbeidet ble støttet økonomisk av Institutt for vitenskap og teknologi i Guangdong-provinsen (nr. 2018B020241003).

TILLEGGSMATERIALE

Tilleggsmaterialet for denne artikkelen kan finnes online på: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2021. 742511/full#tilleggsmateriale

REFERANSER

1. Wang X, Wang J, Guan H, Xu R, Luo X, Su M, et al. Sammenligning av de kjemiske profilene og antioksidantaktivitetene til forskjellige deler av dyrket Cistanche deserticola ved hjelp av ultraytende væskekromatografi-quadrupol time-of-flight massespektrometri og 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl-basert analyse. Molekyler. (2017) 22:2011. doi: 10.3390/molekyler22112011

2. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: en oversikt over dens kjemi, farmakologi og farmakokinetiske egenskaper. J Etnopharmacol. (2018) 219:233–47. doi: 10.1016/j.jep.2017.10.015

3. Piwowarczyk R, Carlón L, Kasinska J, Tofil S, Furma ´nczyk P. ´ Mikromorfologisk intraspesifikk differensiering av nektarledere og landingsplattform for pollinatorer i den iberiske parasittiske planten Cistanche phelypæa (Orobanchaceae). Bot Lett. (2016) 163:47–55. doi: 10.1080/12538078.2015.1124287

4. Jiang Y, Tu P. Analyse av kjemiske bestanddeler i Cistanche-arter. J Chromatogr a. (2009) 1216:1970–9. doi: 10.1016/j.chroma.2008. 07.031

5. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng C. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): En av de beste farmasøytiske gaver innen tradisjonell kinesisk medisin. Front Pharmacol. (2016) 7:41. doi: 10.3389/fphar.2016.00041

6. Song Y, Zeng K, Jiang Y, Tu P. Cistanches Herba, fra en truet art til en stor merkevare innen kinesisk medisin. Med Res Rev. (2021) 5:1–39. doi: 10.1002/med.21768

7. Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. Antioksidative effekter av fenyletanoider fra Cistanche deserticola. Biol Pharmac Bull. (1996) 19:1580-5. doi: 10.1248/bob.19.1580

8. Wang L, Ding H, Yu H, Han L, Lai Q, Zhang L, et al. Cistanches herba: kjemiske bestanddeler og farmakologiske effekter. Chin Herbal Med. (2015) 7:135–42. doi: 10.1016/S1674-6384(15)60017-X

9. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Effekt av dampingsprosessen på kvaliteten på Cistanche deserticola etter innhøsting for medisinsk bruk under soltørking. Biol Pharm Bull. (2016) 39:2066–70. doi: 10.1248/bob.b16- 00250

10. Peng F, Chen J, Wang X, Xu C, Liu T, Xu R. Endringer i nivåer av fenyletanoidglykosider, antioksidantaktivitet og andre kvalitetstrekk i Cistanche deserticola-skiver ved dampbehandling. Chem Pharm Bull. (2016) 64:1024–30. doi: 10.1248/CPB.c16-00033

11. Zou P, Song Y, Lei W, Li J, Tu P, Jiang Y. Anvendelse av 1 H NMR-basert metabolomikk for diskriminering av ulike deler og utvikling av en ny prosesseringsarbeidsflyt for Cistanche deserticola. Acta Pharm Sin B. (2017) 7:647–56. doi: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

12. Zheng J, Wu Z, Yang N, Zhou K, Hu W, Ou S, et al. Bredt målrettet UHPLC-MS/MS metabolomisk analyse på den kjemiske variasjonen i blåbærfylte bakverk under bearbeiding. Grenser i ernæring. (2020) 7:569172. doi: 10.3389/fnut.2020.569172

13. Liu W, Song Q, Cao Y, Xie N, Li Z, Jiang Y, et al. Fra 1H NMR-basert ikke-målrettet til LC-MS-basert målrettet metabolomikkstrategi for dyptgående kamillesammenligninger mellom fire Cistanche-arter. J Pharmaceut Biomed. (2019) 162:16–27. doi: 10.1016/j.jpba.2018.09.013

14. Wang H, Hua J, Yu Q, Li J, Wang J, Deng Y, et al. Bredt målrettet metabolomisk analyse avslører dynamiske endringer i ikke-flyktige og flyktige metabolitter under behandling av grønn te. Food Chem. (2021) 363:130131. doi: 10.1016/j.foodchem.2021.130131

15. Koistinen VM, Da Silva AB, Abrankó L, Low D, Villalba RG, Barberán FT, et al. Interlaboratoriedekningstest på bioaktive forbindelser i plantemat og deres metabolitter ved massespektrometribasert umålrettet metabolomikk. Metabolitter. (2018) 8:46. doi: 10.3390/metabo8030046

16. Santin M, Lucini L, Castagna A, Chiodelli G, Hauser M, Ranieri A. UV-B-stråling etter høsting modulerer metabolittprofilen i ferskenfrukt. Postharvest Biol Tec. (2018) 139:127– 34. doi: 10.1016/j.postharvbio.2018.02.001

17. Nie H, Chen H, Li G, Su K, Song M, Duan Z, et al. Sammenligning av flavonoider og fenylpropanoidforbindelser i kinesisk vannkastanje behandlet med forskjellige metoder. Food Chem. (2021) 335:127662. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.127662

18. Liu Y, Liu J, Wang R, Sun H, Li M, Strappe P, et al. Analyse av sekundære metabolitter indusert av gulningsprosess for å forstå risgulningsmekanismen. Food Chem. (2021) 342:128204. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.128204

19. Wu L, Huang X, Liu S, Liu J, Guo Y, Sun Y, et al. Forstå dannelsesmekanismen til oolong-te karakteristiske ikke-flyktige kjemikalier utgjør under produksjonsprosesser ved å bruke integrert bredt målrettet metabolom og DIA-proteomanalyse. Food Chem. (2020) 310:125941. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.125941

20. Xie Y, Li X, Zhang Y, Zheng Z, Huang L, Liu D, et al. Effekter av damping med høy luftfuktighet på Gastrodia elata: dampgrad, vekttap, tekstur, tørkekinetikk, mikrostruktur og aktive komponenter. Food Bioprod Process. (2021) 127:255–65. doi: 10.1016/j.fbp.2021.03.005

21. Chen W, Gong L, Guo Z, Wang W, Zhang H, Liu X, et al. En ny integrert metode for storskala deteksjon, identifikasjon og kvantifisering av vidt målrettede metabolitter: anvendelse i studiet av rismetabolomikk. Mol Plant. (2013) 6:1769–80. doi: 10.1093/mp/sst080

22. Arena S, Renzone GD, Ambrosio C, Salzano AM, Scaloni A. Meieriprodukter og Maillard-reaksjonen: en lovende fremtid for omfattende matkarakterisering ved integrerte proteomikkstudier. Food Chem. (2017) 219:477–89. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.09.165

23. Rizzi G P. Kjemisk struktur av fargede Maillard-reaksjonsprodukter. Food Rev Int. (1997) 13:1–28. doi: 10.1080/87559129709541096

24. Liu Z, Chao Z, Liu Y, Song Z, Lu A. Maillard reaksjon involvert i dampprosessen av roten av Polygonum multiflorum. Planta Med. (2009) 75:84–8. doi: 10.1055/s-0028-1088349

25. Jin J, Lao J, Zhou R, He W, Qin Y, Zhong C, et al. Samtidig identifikasjon og dynamisk analyse av sakkarider under dampbehandling av rhizomer av Polygonatum cystoma ved HPLC-QTOF-MS/MS. Molekyler. (2018) 23:2855. doi: 10.3390/molekyler23112855

26. Wan XC. Biokjemi av te (tredje utgave). Beijing: China Agricultural Publishing House (2003). s. 41–5.

27. Xu Y, Xiao Y, Lagnika C, Li D, Liu C, Jiang N, et al. En sammenlignende evaluering av ernæringsmessige egenskaper, antioksidantkapasitet og fysiske egenskaper til kål (Brassica oleracea var. Capitate var L) utsatt for forskjellige tørkemetoder. Food Chem. (2020) 309:124935. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.06.002

28. Dixon RA, Paiva N L. Stress-indusert fenylpropanoid metabolisme. Plante-celle. (1995) 7:1085-97. doi: 10.1105/tpc.7.7.1085

29. Gupta R, Min CW, Kim SW, Wang Y, Agrawal GK, Rakwal R, et al. Komparativ undersøkelse av frøskaller av brun- vs. gulfargede soyabønnefrø ved bruk av en integrert proteomikk- og metabolomikk-tilnærming. Proteomikk. (2015) 15:1706–16. doi: 10.1002/pmic.201400453

30. Commisso M, Toffali K, Strasser P, Stocchero M, Ceoldo S, Baldan B, et al. Påvirkning av fenylpropanoidforbindelser på varmestresstoleranse i gulrotcellekulturer. Front Plant Sci. (2016) 7:1439. doi: 10.3389/fpls.2016.01439

31. Wahid A, Gelani S, Ashraf M, Foolad M. Varmetoleranse i planter: en oversikt. Environ Exp Bot. (2007) 61:199–223. doi: 10.1016/j.envexpbot.2007.05.011

32. Wu X, Yuan J, Luo A, Chen Y, Fan Y. Tørkestress og gjenvanning øker sekundære metabolitter og enzymaktivitet i dendrobium moniliform. Ind Crop Prod. (2016) 94:385–93. doi: 10.1016/j.indcrop.2016.08.041

33. Wang Y, Ren W, Li Y, Xu Y, Teng Y, Christie P, et al. Ikke-målrettet metabolomisk analyse for å avdekke virkningen av di({1}}etylheksyl)ftalatstress på rotekssudater av alfalfa (Medicago sativa). Sci Total Environ. (2019) 646:212– 9. doi: 10.1016/j.scitotenv.2018.07.247

34. Jia X, Sun C, Li G, Li G, Chen G. Effekter av progressiv tørkestress på fysiologien, antioksidative enzymer og sekundære metabolitter av Radix Astragali. Acta Physiol Plant. (2015), 37:262. doi: 10.1007/s11738-015- 2015-4

35. Paupière MJ, Müller F, Li H, Rieu I, Tikunov YM, Visser R GF, et al. Umålrettet metabolomisk analyse av tomatpollenutvikling og varmestressrespons. Plant Reprod. (2017) 30:81–94. doi: 10.1007/s00497-017-0301-6

36. Chen J, Ho C. Sammenligning av flyktig generasjon i serin/treonin/glutamin-ribose/glukose/fruktose modellsystemer. J Agr Food Chem. (1999) 47:643-7. doi: 10.1021/jf980771a

Interessekonflikt:

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Utgivers merknad:

Alle påstander uttrykt i denne artikkelen er utelukkende de fra forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de fra deres tilknyttede organisasjoner, eller de fra utgiveren, redaktørene og anmelderne. Ethvert produkt som kan evalueres i denne artikkelen, eller krav som kan komme fra produsenten, er ikke garantert eller godkjent av utgiveren.

Copyright © 2021 Ai, Zhang, Li, Sun og Liu. Dette er en åpen artikkel distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution License (CC BY). Bruk, distribusjon eller reproduksjon i andre fora er tillatt, forutsatt at den(e) originale forfatteren(e) og opphavsrettseieren(e) er kreditert og at den originale publikasjonen i dette tidsskriftet er sitert, av akseptert akademisk praksis. Ingen bruk, distribusjon eller reproduksjon er tillatt som ikke er i samsvar med disse vilkårene.

For more information:1950477648nn@gamil.com