Hvordan kalsium behandler luorindusert nyreskade?
Mar 16, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Nøkkelord: Kalsium, Nyre, Apoptose
ABSTRAKT
Langvarig overdreven inntak av fluor (F) kan gi ossøs og ikke-ossøs skade. Denyreer kroppens viktigste fluorutskillelsesorgan. Denne studien hadde som mål å undersøke om kostholdkalsiumtilskudd kan lindrenyreskader forårsaket av fluorose og å undersøke ytterligere effektene avKalsiumpå avbøtningsmekanismen tilnyrecelleapoptoseutløst av F. Vi evaluerte den histopatologiske strukturen,nyrefunksjonsindikatorer, og gen- og proteinekspresjonsnivåer av dødsreseptor-mediertapoptoseveier i Sprague Dawley (SD) rotter behandlet med natriumfluorid (NaF) og/ellerkalsiumkarbonat (CaCO3) i 120 dager. Resultatene viste at 100 mg/L NaF indusertenyrehistopatologisk skade ogapoptose, økte konsentrasjonene av kreatinin (CRE), urinsyre (UA), ureanitrogen i blodet (BUN), kalium (K), fosfor (P) og F (p < {{0}}.05)="" ,="" og="" redusere="" nivået="" av="" serummagnesium="" (mg)="" (p="">< 0,05).="" videre="" økte="" naf="" mrna-="" og="" proteinekspresjonsnivåene="" til="" fas-celleoverflatedødsreseptor="" (fas),="" tumornekrosefaktor="" (tnf),="">apoptose-induserende ligand (TRAIL), Caspase 8, Caspase 3 og poly ADP-ribose polymerase (PARP) (p < 0.01),="" som="" til="" slutt="" aktiverte="" dødsreseptorveien.="">Kalsiumtilskudd reverserte reduksjonen av CRE, BUN, UA, F og P-nivåer indusert av F, lindret histopatologisk skade ogapoptose, og reduserte gen- og proteinekspresjonsnivåene til dødsreseptorvei-relaterte markører. Avslutningsvis 1 prosentKalsiumlindrer F-indusertnyreapoptosegjennom FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL signalveier.
Introduksjon
Fluor er mye tilstede i jord, vann og mat. Men noen naturlige faktorer (forvitring av mineraler og bergarter, dannelse avkalsiumog magnesiumsalter, infiltrasjon av grunnvann, etc.) og menneskelige aktiviteter (industrielt avløpsvann, agrokjemikalier, husholdningsprodukter, etc.) forårsaker fluorforurensning i miljøet (Daiwile et al., 2019). For tiden er den største eksponeringsfaktoren for fluorid (F) drikkevann, og den anbefalte konsentrasjonen av F i drikkevann av Verdens helseorganisasjon er mindre enn 1,5 mg/L (Guidelines for Drinking-Water Quality, 2017). Epidemiologiske bevis tyder på at høyere enn denne konsentrasjonen øker risikoen for dental fluorose, og den økende konsentrasjonen vil øke risikoen for skjelettfluorose (Guidelines for Drinking-Water Quality, 2017; National Research Council, 2006). Langvarig eksponering for høye konsentrasjoner av fluor kan øke kroppens absorpsjon av fluor gjennom luftveiene
og fordøyelseskanalene. Overdreven inntak av F kan forårsake skade på bein- og ikke-benete organer i kroppen. Bløtvevsskade utenfor beinet omtales generelt som ikke-benet skade. For tiden har det blitt funnet at skaden på ikke-benvev forårsaket av F involverer fordøyelseskanalen, leveren,nyre, hjerne osv. (Jha et al., 2011; Perumal et al., 2013).
Denyre, kroppens viktigste utskillelsesorgan, er ansvarlig for metabolismen av giftige stoffer og eksogene giftstoffer i kroppen. Studier har rapportert at omtrent 50–80 prosent av fluoret som inntas av kroppen filtreres og reabsorberes avnyrer, og det gjenværende fluoret akkumuleres i andre vev og organer (Chen et al., 2013; Dharmaratne, 2019). Mange typer litteratur har vist at 50 og 100 mg/LF eksponering kan føre til utvidelse av nyrekapselhulen, atrofi avnyretubuli, uregelmessig arrangement av papillære celler, innsnevring av lumen, noe som resulterer iapoptoseavnyreceller og forringelse av biokjemiske funksjoner som kreatinin (CRE), urinsyre (UA),kalsium(Ca), og fosfor (P) (Song et al., 2014; HW Wang et al., 2020; Wei et al., 2018a).
Apoptose, en slags celledød kontrollert av gener, som er delt inn i endogeneapoptoseog eksogeneapoptose. Nylige rapporter har indikert detapoptoseforårsaket av høy F inkluderer hovedsakelig mitokondrie-mediert, endoplasmatisk retikulum er stress-mediert, og dødsreseptor-medierte veier (Wei et al., 2018a). Tidligere eksperimenter i vår gruppe påpekte at NaF induserer bein og leverapoptosegjennom den intracellulære endoplasmatiske retikulumveien (ER) og mitokondriell vei (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). I tillegg har studier også vist at mitokondriebanen er involvert i NaF-indusertapoptoseav musnyrer(Wei et al., 2018b). Det er imidlertid ingen systematisk studie på dødsreseptormediert vei i F-indusertnyreapoptose. Dødsreseptorveien dominerer hvert stadium av eksogenapoptose, inkludert Fas celleoverflatedødsreseptor (FAS) pathway, tumor necrosis factor (TNF) pathway, og TNF-relatertapoptose-induserende ligand (TRAIL)-vei (Grunert et al., 2012; Lu et al., 2017; Wang og Su, 2018). FAS pathway er det primitive signaltransduksjonssystemet som mediererapoptose. FAS har egenskapene til en membranreseptor og danner en trimer etter binding med FAS-liganden (FAS-L). Deretter binder det spesifikke domenet til trimeren med dødsdomenet (DD) til det tilsvarende connexin-molekylet FAS-assosiert dødsdomeneprotein (FADD) for å danne et dødsindusert signalkompleks (DISC) (Wang og Su, 2018). I følgende biologiske signaltransduksjonsprosess kan FADD aktivere Caspase 8 og Caspase-familien samtidig, og til slutt føre tilapoptosegjennom deltakelse av Caspase 3 og poly ADP-ribose polymerase (PARP) effekt (Kischkel et al., 2000; Meynier og Rieux-Laucat, 2019). Nyere studier har vist at FAS-banen formidlerapoptosei T-celler og undernyresvikt indusert av cisplatin (Djiadeu et al., 2017; Linkermann et al., 2011). I tillegg har en studie også rapportert at NaF indusererapoptosehos mus gjennom FAS-veien (Sun et al., 2017). TRAIL er et anerkjent cytokin i TNF-superfamilien. Det binder seg til sine homologe agonistreseptorer, nemlig dødsreseptorer (DR4 og DR5). Det er en DD i celleområdet. DD er nødvendig for rekruttering av adaptivt protein FADD. FADD induserer på sin side frigjøring av kaspaser i cytoplasmaet, aktivert kaspase 3 spalter PARP og hemmer DNA-reparasjonspotensialet, noe som resulterer iapoptose(Bodmer et al., 2000; Micheau, 2018). Det har blitt antydet at TRAIL/DR5-banen er involvert i NaF-indusertapoptosehos mus (Song et al., 2021). Osteoprotegerin (OPG) er en friløselig reseptor som mangler et transmembrant domene. Det kan begrense TRAIL-mediertapoptoseved å hemme bindingen av TRAIL og andre dødsreseptorer (Duiker et al., 2006; Kiraz et al., 2016; Micheau, 2018). Bindingen av TNF- og TNF-reseptor (TNF-R1) kan aktivere rekruttering av TNFR-assosiert dødsdomene (TRADD) protein gjennom DD. Deretter interagerer TRADD med FADD, noe som fører til rekruttering av pro-Caspase 8, som spaltes til aktiv Caspase 8 av proteolytiske enzymer. Caspase 8 aktiverer deretter Caspase 3, som er ansvarlig for celleapoptose(Kiraz et al., 2016; Sedger og McDermott, 2014). Det er rapportert at NaF induserer hepatocyttapoptosehos mus gjennom TNF-R1-signalveien (Lu et al., 2017)
Kalsiumspiller ulike roller i sammensetningen av bein og tenner, og den kan også kontrollere nerveoverføring og materialfrigjøring (Cao et al., 2016), delta i systemiskkalsiumhomeostase (Carmeliet et al., 2003; Yang et al., 2016), endre membranpermeabilitet (Lappe et al., 2017), aktivere utskillelsen av en rekke enzymer og hormoner (Kim et al., 2012), etc. Mange tidligere studier har funnet at F og Ca har en antagonistisk effekt i biologi (Dure-Smith et al., 1996; Nobrega et al., 2019). Når F er absorbert av kroppen, vil det gå inn i blodet for å danne uløselige CaF2-utfellinger. Hvis kosttilførselen av Ca er utilstrekkelig og Ca i blodet ikke når det tilskrevne nivået, vil det være patologiske endringer som hypokalsemi og osteolyse, så et kosttilskudd av Ca spiller en viktig rolle for å forebygge og forbedre fluorose (Dure-Smith et al. al., 1996; Li et al., 2021; Yang et al., 2021). Vår gruppe har bekreftet at diettenkalsiumkan lindreapoptoseav bein og lever gjennom PI3K-AKT-signalveien, ER-veien og mitokondriell vei (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019; Yang et al., 2021). For ytterligere å bevise omKalsiumsvekker nefrotoksisiteten til F gjennom dødsreseptor-mediertapoptosetrase etablerte vi en rottemodell for kosthold med høyt fluoridkalsiumog evaluertenyreskadeindeks, graden avapoptose, og endringene av markørgen og proteinekspresjon i dødsreseptor-mediertapoptosevei.
Materialer og metoder
Kjemikalier og instrumenter
Destillert vann ble tilberedt av Heal Force vannrensingssystem (Shanghai, Kina). Radioimmunutfellingsanalyse (RIPA) lysisbuffer og natriumfluorid (NaF) ble levert av Sigma-Aldrich (Shanghai, Kina). 10 prosent formalin, glysin, natriumdodecylsulfat (SDS), TRIS, fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), CaCO3, nitrocellulose (NC) membran, bicinchoninsyre (BCA) Kit og hematoxylin-eosin (H&E) fargesett ble hentet fra Solarbio Technology Co. ., Ltd. (Beijing, Kina). Trizol-reagens ble kjøpt opp fra Takara Biological Engineering Company (Dalian, Kina). CRE, UA, blod urea nitrogen (BUN), magnesium (Mg), P og kalium (K) sett ble kjøpt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). In situapoptosedeteksjonssett, FAS Rabbit Polyclonal antibody (BA0484) og FAS-L Rabbit Polyclonal antibody (PB0042) ble kjøpt fra Boster Biotechnology (Wuhan, Kina). -aktin kanin polyklonalt antistoff (20536-1-AP), FADD kanin polyklonalt antistoff (14906-1-AP), Caspase 8 kanin polyklonalt antistoff (13423-1-AP), Caspase 3 kanin polyklonalt antistoff ({{9 }}AP), og HRP-konjugert Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H plus L) (SA00001–2) ble kjøpt opp fra Proteintech Group (Wuhan, Kina). TRAL kanin polyklonalt antistoff (bs-1214R), TNF alfa kanin polyklonalt antistoff (bs2081R), PARP kanin polyklonalt antistoff (bs-55164R) ble kjøpt fra Bioss (Beijing, Kina). Elektrokjemisk luminescens (ECL) og 3,3'-diaminobenzidin (DAB) ble kjøpt fra KeyGen Biotech (Jiangsu, Kina). PrimeScript® RT Master Mix og SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit ble levert av Promega Biotechnology (Beijing, Kina).
Dyr og behandlinger
Førti friske {{0}}uker gamle Sprague-Dawley (SD) hannrotter (120 ± 20 g) ble hentet fra Experimental Animal Center ved Shanxi Medical University (Shanxi, Kina). Rottene ble akklimatisert i én uke, tilfeldig delt inn i fire grupper (10 rotter per gruppe): Kontrollgruppe (C), NaF-gruppe (F), NaF pluss 0,5 prosent CaCO3-gruppe (F pluss 0,5 prosent Ca), NaF pluss 1 prosent CaCO3-gruppe (F pluss 1 prosentKalsium) og behandlet som tabell 1. Alle rottene ble holdt i plastbur ved 22–25 ◦C (55 ± 5 prosent fuktighet, 12 timer lys/mørke syklus), kosthold og drikkevann er fritt tilgjengelig.
Etter 17 ukers oppdrett fastet rottene i 24 timer, og vann var fritt å drikke. Deretter ble rottene bedøvet med natriumpentobarbital og avlivet ved cervikal dislokasjon etter at blodet ble samlet fra øyeepler. Noe blod ble samlet inn av rørene som inneholdt antikoagulerende heparinnatrium for BUN-testen. En del av blodet ble satt i vanlige prøverør, plassert ved romtemperatur i 2 timer, og deretter sentrifugert ved 3000 rpm/min i 10 minutter for å skille serum. Serumet ble separert for CRE-, UA-, Mg-, P-, K- og F-tester. Åtte prøver avnyrerfra hver gruppe ble tilfeldig valgt og raskt frosset i flytende nitrogen, og deretter lagret ved -80 ◦C for qRT-PCR og western blotting-eksperimenter. De andre prøvene avnyrerble fiksert i 10 prosent formalin for histopatologisk undersøkelse og terminale deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick end labeling (TUNEL) eksperimenter. Alle dyrerelaterte eksperimentelle operasjoner ble strengt implementert under forskriftene til dyrepleieinstitusjonen og brukskomiteen ved Shanxi Agricultural University, Shanxi, Kina.
Nyrekoeffisient
Rottene ble veid først; og sånyrevev ble fjernet og veid. Denyrekoeffisient ble oppnådd ved følgende formel.
Nyrekoeffisient=[nyrevåtvekt (g) / kroppsvekt (g)] ×100 prosent.
Histopatologisk undersøkelse
Nyreprøver ble innebygd i parafin. Seksjon (5 μm tykkelse) avnyreble farget av H&E. Deretter ble objektglassene observert ved bruk av et lysmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Alvorlighetsgraden avnyreSkaden ble bedømt etter histopatologisk poengsum.Nyretubulær skade er definert somnyreblodlegemer blir atrofiert og deformertnyrekapsel hulrom utvidet, dennyretubuli danner gips, og epitelceller faller av. Ved 200 ganger forstørrelse ble følgende kriterier brukt for å evaluere graden av leverskade. 1: 0–25 prosent skade; 2: 25–50 prosent skade; 3: 50–75 prosent skade; 4: 75–100 prosent skade (Baranova et al., 2016).
Fastsettelse avnyre-relaterte indikatorer
Nivået av F ble målt av en F-ionespesifikk elektrode (Quadri et al., 2018). Nivåene av CRE, UA, BUN, Mg, P og K ble målt ved å bruke kommersielt tilgjengelige sett. Alle relaterte prosedyrer ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.
Påvisning avapoptosenivå etter TUNEL
For å kvantifisereapoptoseinyreceller, ble eksperimentell analyse utført ved å bruke en situapoptosedeteksjonssett. Denyreseksjoner ble avparafinisert og deretter utsatt for fordøyelse ved bruk av Proteinase K. Terminal deoksynukleotidyltransferase kan markere digoksinmerket dUTP (DIG-dUTP) til 3'-OH-enden, og DIG-dUTP binder seg til DNA-bruddpunktet etter å ha reagert med biomarkøren anti -dig-Biotin. Kombinert med DAB ble lagt til visning. For å visualisere
alle kjernene ble seksjonene motfarget med hematoksylin. Mørkebrune signaler indikerer positive celler og blå indikerer ikke-responsive celler. Deapoptoseindeksen ble beregnet i henhold til følgende formel.
Andelen apoptotiske celler=(antall apoptotiske celler per node / totalt antall celler per node) ×100 prosent .
Kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR)
Totalt RNA franyreble ekstrahert ved å bruke Trizol-reagens. Vi brukte et ND{{0}}-spektrofotometer (nano-drop, USA) og agarosegelelektroforese for å sjekke kvaliteten og kvantiteten til RNA. Revers transkripsjon (RT) ble utført på 500 ng totalt RNA ved å bruke PrimeScript® RT Master Mix. Spesifikke primere for -aktin og FAS, TRAIL, TNF og andre gener ble designet av Primer Premier 7.0 programvare (tabell 2) og syntetisert av Sangon Biotech (Shanghai, Kina). Quantstudio 7 flex sanntids PCR-system (termo-fisher, USA) og SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit ble brukt for RT-PCR. PCR-reaksjonsvolumet var 20 μL, og RT-PCR-forholdene var: 95 ◦C 10
min, 40 sykluser på 95 ◦C 15 s, 55 ◦C 30 s, 72 ◦C 30 s, og til slutt en syklus på 95 ◦C 15 s, 60 ◦C 15 s, 95 ◦C 15 s. Alle reaksjoner ble gjentatt tre ganger. Den relative 2-ΔΔCt-metoden ble brukt til å beregne de relative mRNA-ekspresjonsnivåene, og -aktin ble brukt som en kalibrator. I prosessen er effektivitetsforskjellen mindre enn 5 prosent.
Total proteinekstraksjon og western blotting-analyse
Denyrevev ble vasket med PBS, tørket med filterpapir og dekomponert i RIPA-lyse (inneholdende PMSF), ved 12, 000 rpm/min, 4◦C i 10 min. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke Bicinchoninic Acid (BCA) Kit (Solarbio Science & Technology, Beijing, Kina). 35 ng proteinprøve ble vellykket ekstrahert og separert på 8 prosent SDS-polyakrylamidgel ved elektroforese. Målproteinet ble overført til en NC-membran, og NC-membranen ble blokkert med 5 prosent fettfri melk ved romtemperatur i 2 timer. Etter det ble NC-membranen inkubert med primære antistoffer av -aktin (1:1000), TRAIL (1:500), FAS (1:500), FAS-L (1:100), TNF (1:500), FADD (1:500), Caspase 8 (1:500), Caspase 3 (1:500) og PARP (1:1000) ved 4 grader over natten. Etter vask 3 ganger med PBST, ble NC-membranen inkubert med HRP-konjugerte sekundære geit-anti-kanin-IgG-antistoffer (1:2000) ved romtemperatur i 2 timer. ECL ble brukt til å visualisere målproteinbåndene. Optisk tetthet ble beregnet av AlphaView-programvaren (versjon: 3.2.2.0) på FluorChem Q-systemet (Alpha Innotech, CA, USA).
Statistisk analyse
GraphPadPrism{{0}}-programvare ble brukt til å organisere og analysere de eksperimentelle dataene, og hver data ble representert med gjennomsnitt ± SEM. Signifikansen av forskjellen mellom gjennomsnitt ble bestemt ved variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys test med P < 0,05="" som="" ble="" ansett="" som="">
Resultater
Endringer inyrekoeffisient og biokjemiske funksjonsindikatorer
Denyrekoeffisient og nivåene av F, CRE, BUN, UA, Mg, P, K ble vist i fig. 1. Sammenlignet med C-gruppen,nyrekoeffisienten ble signifikant redusert i F-gruppen (p < 0.05).="" imidlertid="" er="" nyrekoeffisienten="" i="" f="" pluss="" 1="">Kalsiumgruppen viste en signifikant økning sammenlignet med F-gruppen (p < {{0}}.05).="" f-nivået="" i="" f-gruppen="" var="" markant="" høyere="" enn="" i="" c-gruppen="" (p="">< 0,001).="" interessant="" nok,="" sammenlignet="" med="" f-gruppen,="" var="" f-nivået="" i="" f="" pluss="" 1="" prosent="" ca-gruppen="" signifikant="" redusert="" (p=""><>
CRE, BUN og UA ble evaluert for å reflektere graden avnyreskader og funksjonsendring. Nivåene av CRE, BUN og UA var tydelig økt i F-gruppen sammenlignet med de i C-gruppen (p < 0.05),="" men="" i="" forhold="" til="" f-gruppen="" var="" de="" tre="" ovennevnte="" indikatorene="" spesielt="" redusert="" i="" f="" pluss="" 1="">Kalsiumgruppe (p < 0.05).="" mg,="" p="" og="" k="" var="" elektrolyttindikatorene="" nært="" knyttet="">nyrefunksjon. Sammenlignet med C-gruppen var nivået av serum-Mg signifikant redusert, nivåene av P og K ble dramatisk økt i F-gruppen (p < 0.05).="" likevel="" legger="" man="" til="" 1="">kalsiumtil dietten økte serum-Mg-nivåene med 15,3 prosent (p < 0.05)="" og="" reduserte="" serum-p-nivåene="" markant="" med="" 16,9="" prosent="" (p="">< 0,05).="" innholdet="" av="" serum="" k="" har="" vist="" en="" nedadgående="" trend="" uten="" betydning="" etter="" tilskudd="" 1="" prosent="">
Endringer inyremorfologi
De morfologiske endringene avnyrevev ble undersøkt av H&E (fig. 2I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ). I C-gruppen,nyrerørformede celler var kompakt arrangert, morfologien var regelmessig og morfologien til glomeruli var intakt. Grensene mellom cellene var imidlertid uklarenyreblodlegemer ble atrofiert og deformertnyrekapsel hulrom utvidet, dennyretubuli dannet en gips, og epitelceller løsnet i F-gruppen. I forhold til F-gruppen, med økningen påKalsiumkonsentrasjon, arrangementet avnyrecellene ble gradvis mer ryddig, morfologien tilnyrekorpuskler kom seg gradvis, og skadegraden ble gradvis lindret. I tillegg evaluerte vi skaden ved å brukenyrepoengsum (fig. 2Ⅴ). Poengsummen til F-gruppen var signifikant høyere enn for C-gruppen (p < 0.01);="" likevel="" skåren="" i="" f="" pluss="" 1="">Kalsiumgruppen reduserte markant sammenlignet med F-gruppen (p < 0.05).
TUNEL oppdagernyrecelleapoptose
Vi utførte TUNEL-analysen for å oppdage og analysere omnyreceller har gjennomgåttapoptosei denne studien (fig. 3I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ).Nyrevev i C-gruppen var pent arrangert, med færre apoptotiske celler (4,67 ± 1,15 prosent). F-gruppen viste et stort antall TUNEL-positivenyretubulære epitelceller (48,17 ± 3,94 prosent). I kontrast, F pluss 1 prosentKalsiumgruppen viste en dramatisk reduksjon i antall TUNEL-positive celler (28,83 ± 4,81 prosent) (fig. 3Ⅴ).
Effekten avKalsiumpå F-induserte endringer i dødsreseptorvei-relaterte gener
De relative mRNA-ekspresjonsnivåene av oppstrømsfaktorer relatert til dødsreseptor-mediertapoptosevei (TRAIL, DR5, TNF, TNFR1, TNF-R2, FAS, FAS-L, OPG) ble avslørt i fig. 4a. I forhold til C-gruppen var mRNA-ekspresjonsnivåene til TRAIL, DR5, TNF, TNF-R1, TNFR2, FAS og FAS-L betydelig forbedret i F-behandlede rotter (p < 0.01).="" derimot="" ble="" de="" relative="" mrna-uttrykkene="" til="" trail,="" tnf,="" tnf-r2,="" fas="" og="" fas-l="" markant="" redusert="" i="" f="" pluss="" 1="">Kalsiumgruppe sammenlignet med F-gruppen (p < {{0}}.05).="" sammenlignet="" med="" c-gruppen="" ble="" det="" observert="" en="" åpenbar="" reduksjon="" i="" mrna-ekspresjonsnivåene="" til="" opg="" i="" f-gruppen="" (p="">< 0,01).="" imidlertid,="" i="" forhold="" til="" f-gruppen,="" opg="" i="" f="">Kalsiumgruppene ble økt. Nedstrøms faktorer FADD, TRADD, Caspase 8, Caspase 3 og PARP relative mRNA-ekspresjonsnivåer ble vist i fig. 4b. Proteinuttrykkene til FADD, TRADD, Caspase 8, Caspase 3 og PARP var åpenbart forbedret i F-gruppen sammenlignet med C-gruppen (p < 0.01),="" men="" ble="" tydeligvis="" redusert="" i="" f="">Kalsiumgrupper, sammenlignet med F-gruppen (p < 0.05).
Effekten avKalsiumpå F-induserte endringer iapoptose-relaterte proteiner
Proteinekspresjonen til TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, Caspase 8, Caspase 3 og PARP ble påvist ved Western blotting (fig. 5a, b). Sammenlignet med C-gruppen var proteinuttrykkene til TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, Caspase 8, Caspase 3 og PARP i F-gruppen markert forhøyet (p < 0.01).="" proteinuttrykkene="" for="" alle="" faktorene="" ovenfor="" ble="" merkbart="" redusert="" i="" f="" pluss="" 1="">Kalsiumgruppe sammenlignet med F-gruppen (p < 0.05).
Diskusjon
De nyeste bevisene viste at F kan forårsake lesjoner i bløtvev, og graden av F-skade avhenger av konsentrasjonen av F, eksponeringstid og organtype (Wei et al., 2019). I denne studien ble 100 mg/L NaF brukt i 17 uker for å etablere en dyremodell med subakutt NaF-eksponering for drikkevann. Doseringen av NaF velges i henhold til forurensningsgraden av F i miljøet og de usikre faktorene til forskjellige arter. Gitt at den naturlige F-konsentrasjonen målt i lokalt grunnvann er ca. 4,5 mg/L, ble det destillerte vannet med 100 mg/L NaF brukt i denne studien (F-konsentrasjonen er ca. 45 mg/L) beregnet etter usikker faktor for dyr-til-menneske ekstrapolering ved 10 (Guidelines for Drinking-Water Quality, 2017; Mukherjee og Singh, 2021; Wen et al., 2013; Zhang et al., 2020). Tidlige studier har funnet ut at diettkalsiumkan påvirke absorpsjonen av fluor, fremme utskillelsen av fluor i kroppen, redusere absorpsjonshastigheten av fluor, og dermed redusere toksisiteten til F (Harrison et al., 1984; Larsen et al., 1981). Våre nyere eksperimentelle studier har vist at Ca lindrer F-indusert bein- og leverskade ved å hemme den iboende veien tilapoptose(Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). Så langt er imidlertid forskningen på den beskyttende effekten av Ca på F-indusert nefrotoksisitet og dens relaterte mekanisme enestående. Her rapporterer vi at Ca lindrer F-indusertnyreskader. I tillegg fant vi også at Ca reverserer F-indusertnyrecelleapoptosegjennom dødsreseptor-mediertapoptosetrase (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL-veier). Den langsiktige akkumuleringen av F inyrekan føre til vevsstruktur og funksjonsskade. I denne studien fant vi at NaF-eksponering forårsaketnyrecelleapoptosehos rotter, ledsaget av glomerulær atrofi og deformasjon,nyrekapselhulrom utvidelse,nyretubuli danner gips, og epitelceller faller av. Men,nyreskaden ble betydelig lindret etter tilskudd på 1 prosent Ca. Disse resultatene var lik resultatene oppnådd i tidligere rapporter (Cao et al., 2015; HW Wang et al., 2020).
CRE er metabolitten til muskler, UA er sluttproduktet av purinmetabolismen, og BUN er hovedsluttproduktet av kroppens proteinmetabolisme, som skilles ut ved glomerulær filtrasjon og brukes vanligvis til å oppdagenyrefunksjon (Myers et al., 2006; HW Wang et al., 2020). Den biokjemiske undersøkelsen av høy F-regionen viste at de glomerulære filtrasjonshastighetene ble betydelig redusert, og F, UA og BUN endret seg betydelig (Malin et al., 2019). Dyreforsøkene viste at serum CRE,Kalsium, og P-konsentrasjoner ble betydelig redusert hos mus eksponert for 100 mg/L NaF, noe som tyder på at F forstyrretnyrefunksjon samt Ca- og P-metabolisme (HW Wang et al., 2020). F-indusert nefrotoksisitet er relatert tilnyredysfunksjon. Nårnyrefunksjonen forringes, utskillelsen av F i kroppen reduseres, noe som fører til overdreven akkumulering av fluor inyreog forverrende F-toksisitet (Kido et al., 2017). Nårnyrerer sterkt svekket, de
utskillelse av F i urinen avtar, og serum F-konsentrasjon øker ytterligere (Dharmaratne, 2019). I denne studien observerte vi at nivåene av BUN og serum CRE, UA, P, K hos rotter behandlet med 100 mg/L NaF økte betydelig, noe som tyder på at høy F-eksponering forårsaket endringer inyrebiokjemiske indikatorer hos rotter og førte tilnyreinsuffisiens. Videre påpekte vi også at de ulike indikatorene pånyrepleier å være normalt etterpåKalsiumtilskudd. Det viser at Ca (spesielt 1 prosentKalsium) har en betydelig lindrende effekt på F-indusertnyreskader hos rotter.
Cistanchekan hjelpe mednyreskader.
Apoptoseer en autonom og ordnet celledød kontrollert av gener, som er preget av DNA-nedbrytning uten åpenbar cellelyse. Denne studien observerte at fluorose forårsaketnyrecelleapoptosehos rotter. FAS spiller en stor rolle i forekomsten avapoptoseog ulike sykdommer. Nyere litteratur avslørte at FAS formidlerapoptoseinyreindusert av iskemi-reperfusjon og humane leukocytterapoptoseindusert av N-nitrosodimetylamin (Iwaniuk et al., 2019; Xu
et al., 2019). Når FAS og FAS-L kombineres for å danne en trimer, utløses det pro-apoptotiske signalet. En fersk studie har vist at F induserer celleapoptosegjennom FAS/FAS-L-veien (Xu et al., 2011). I denne studien økte F signifikant mRNA og proteinekspresjon av FAS og FAS-L inyre. Oppreguleringen av FAS- og FAS-L-nivåer antyder at FAS/FAS-L-relaterte apoptotiske veier kan være involvert i F-indusertapoptose. FAS/FAS-L-trimerrekruttering av FADD fører til spaltning av Pro-Caspase 8 for å produsere aktiv Caspase 8, som igjen aktiverer Caspase 3 og deretter fører tilapoptose(Li et al., 2011; Xu et al., 2011). Denne studien bekreftet at 100 mg/L NaF induserteapoptosei rottenyrergjennom FAS/FAS-L-banen. Det viktigste resultatet er at kosttilskudd av Ca demperapoptose-induserende effekt av F, som tilskrives nedregulering av FAS/FAS-L-aktivering og sekundær aktivering av Caspases.
TNF er et pleiotropisk cytokin som deltar i et bredt spekter av cellulære responser, inkludert differensiering, spredning, betennelse og celledød. TNF-signalet utløser begge delerapoptoseog anti-apoptotiske veier. Mange typer litteratur har rapportert at TNF dominerer lipopolysakkarid-indusertnyreskade og cisplatin-indusert akuttnyreskade (Lee et al., 2016; Li et al., 2018). TNF binder seg til TNF-R1, dens DD rekrutterer TRADD, og deretter samhandler TRADD med FADD, noe som fører til dannelsen av DISC (Kiraz et al., 2016; Sun et al., 2003). Studier har avslørt at F kan indusere lever, nevron ognyreleukocyttapoptosegjennom TNF-signalveien (Lu et al., 2017; Singh et al., 2017; Yan et al., 2016). I likhet med resultatene av disse rapportene, ble de relative uttrykkene for TNF, TNF-R1, TNF-R2 og TRADD i F-gruppen betydelig økt i dette eksperimentet. Derimot sank uttrykket av disse genene betydelig etter 1 prosentenKalsiumsupplement, noe som tyder på intervensjon avKalsiumi TNF-veien.
TRAIL er involvert i reguleringen avapoptose, spredning, immun-inflammatorisk respons, etc. For tiden antas det at TRAIL er nært knyttet til forekomst og prognose avnyresykdom (Candido, 2014). Mer og mer litteratur har bekreftet at TRAIL regulererapoptoseavnyretubulære epitelceller i HBV-assosiert glomerulonefritt ognyreapoptosei Uromodulin-assosiertnyresykdom (Johnson et al., 2017; Yang et al., 2018). Videre rapporterte en studie at uttrykket av TRAIL generelt ble endret under homeostasen og forskjelligenyreskader (Devarapu et al., 2017). TRAIL fester seg til dødsreseptoren DR5 og rekrutterer FADD gjennom interaksjonen av DD, og binder seg deretter til pro-Caspase 8 gjennom dødseffektdomenet som eksisterer i FADD for å danne en DISC (Yuan et al., 2018). Denne studien viste at uttrykket av TRAIL og DR5 var signifikant økt i F-gruppen. Etter å ha supplert medKalsium, ble uttrykket av TRAIL og DR5 hemmet. Det foreslås detKalsiumhemmer TRAIL-banen for å redusere F-indusertapoptose.
Konklusjon
100 mg/L NaF eksponering aktivert dødsreseptor-mediertapoptosevei (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL-veier) og deretter indusertnyrecelleapoptosehos rotter, forårsakernyremetabolske forstyrrelser ognyreinsuffisiens, noe som resulterer inyreblodlegemer ble atrofiert og deformertnyrekapsel hulrom utvidet, dennyretubuli dannet en gips. Men tillegg på 1 prosentKalsiumtil dietten redusert fluorinnholdet i blodet, ytterligere lindretnyremetabolske forstyrrelser ognyreinsuffisiens gjennom dødsreseptor-mediert vei, og reduserte betydelignyreskade (komponent Fig. 6).
Referanser
Kilden er av Haojie Li, College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, PR China og etc.
