2.6. Uttrykk for Caspase-3 og Caspase-6

Glykosid av cistanche kan også øke aktiviteten til SOD i hjerte- og levervev, og redusere innholdet av lipofuscin og MDA i hvert vev betydelig, effektivt rense ulike reaktive oksygenradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) og beskytte mot DNA-skader forårsaket av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en sterk renseevne for frie radikaler, en høyere reduserende evne enn vitamin C, forbedrer aktiviteten til SOD i sædsuspensjon, reduserer innholdet av MDA og har en viss beskyttende effekt på sædmembranfunksjonen. Cistanche-polysakkarider kan øke aktiviteten til SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevev hos eksperimentelt senescent mus forårsaket av D-galaktose, samt redusere innholdet av MDA og kollagen i lunge og plasma, og øke innholdet av elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlenger hypoksitiden hos eldre mus, forbedrer aktiviteten til SOD i serum og forsinker den fysiologiske degenerasjonen av lunge hos eksperimentelt eldre mus. Med cellulær morfologisk degenerasjon har eksperimenter vist at Cistanche har den gode antioksidantevnen og har potensial til å være et medikament for å forebygge og behandle aldringssykdommer. Samtidig har echinacoside i Cistanche en betydelig evne til å rense DPPH-frie radikaler og har evnen til å rense reaktive oksygenarter og forhindre frie radikal-indusert kollagen-nedbrytning, og har også en god reparasjonseffekt på anionskader av tymin frie radikaler.

Klikk her for å vite Cistanche Tubulosa for antioksidant

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

TgAPP-mus viste en økning i caspase{{0}}-genekspresjon (Figur 8C1, H1), som var signifikant og større enn 30 prosent sammenlignet med hippocampi til WT-mus (Figur 8H1; p < 0,05). Når det gjelder caspase-6-uttrykk, ble det ikke observert noen forskjeller mellom transgene og ikke-transgene mus (figur 8C2, H2).

Quercetin- og rutinbehandlinger var i stand til å senke caspase{0}}-mRNA-nivåer i hippocampus på en statistisk signifikant måte (Figur 8H1; p < 0.05), med inhiberingsprosent på rundt 17 prosent og 27 prosent for henholdsvis hunn- og hannmus. I hjernebarken ble det kun observert signifikante forskjeller i behandlingen med rutin hos menn (Figur 8C1; p < 0,05).

Om caspase-6, quercetin- og rutinbehandlinger utviste ingen statistisk signifikant effekt i cortex eller hippocampus (Figur 8C2, H2), men i sistnevnte viste Caspase-6 hos TgAPP-hanner en tendens til å reduksjon (Figur 8H2).

2.7. Betennelsesmarkører

Resultatene oppnådd for genekspresjon av de inflammatoriske mediatorene IL-1, TNF- og IFN- er vist i figur 9.

I TgAPP var det en signifikant økning i IL{0}}-genuttrykk på rundt 20 prosent i cortex og hippocampus hos begge kjønn sammenlignet med WT-mus (Figur 9C1, H1; p < 0,05). Når det gjelder TNF-, selv om høyere mRNA-nivåer er vist i TgAPP, er de ikke statistisk signifikante i WT-mus (Figur 9C2, H2). Når det gjelder IFN-, var det en økning på rundt 30 prosent i uttrykket hos menn, som kun var statistisk signifikant i cortex (Figur 9C3; p < 0,05).

Behandlinger med quercetin og rutin, både hos hunner og hanner, var i stand til å redusere IL{{0}}-uttrykk i hjernebarken og hippocampus sammenlignet med kontroll-TgAPP-mus (Figur 9C1, H1; p < {{8 }}.05), som oppnår lignende verdier som de for WT-mus, og spesielt lavere i hippocampi til hannmus (figur 9H1; p < 0,05).

Den samlede effekten av begge flavonoidbehandlingene på IL{{0}}-ekspresjon ble ikke observert med TNF- og heller ikke med INF-. Således gjennomgikk TgAPP-hanner, etter quercetin-behandling, en signifikant reduksjon i hippocampus TNF- (Figur 9H2; p < 0.05) og i kortikalt IFN-uttrykk (Figur 9C3; p < 0,05).

2.8. Vurdering av degenererende nevroner og deres projeksjoner

Ingen karakteristiske tegn på nevrodegenerasjon ble observert i alderen da de transgene TgAPP-musene ble testet, sammenlignet med WT-mus, og heller ikke viste behandlinger med quercetin og rutin noen endring i 4 uker sammenlignet med TgAPP (figur S1, tilleggsdata).

2.9. Ekspresjon av ionotrope glutamatreseptorer

Ingen signifikante forskjeller ble funnet i reseptoruttrykk, sammenlignet verdiene oppnådd for kontroll-TgAPP-musene med de oppnådd for WT-musene. Det var heller ingen merkbare effekter på uttrykket av disse ionotrope reseptorene i nærvær av quercetin- eller rutinbehandling (tabell S5, tilleggsdata).

3. Diskusjon

Formålet med vår nåværende studie var å vurdere virkningen av to flavonoider, quercetin og rutin, i de første stadiene av AD-patogenesen, uavhengig av deres effekt på nevrodegenerasjon og/eller kognitiv funksjon. Cortex og hippocampus var områdene i hjernen som ble analysert, da de er de mest berørte hjernestrukturene i AD. Det bør tas i betraktning at quercetin og rutin ble administrert gjennom en formulert diett som inneholder en av de to flavonoidene, for å etterligne, i en AD-dyremodell, inntaket av et sunt menneskelig kosthold som inneholder en aktiv ingrediens.

Spesielt utøvde transgenet APPswe i C57B6-musen en betydelig innvirkning på GSH/GSSG-forhold, MDA-nivåer, antioksidantenzymkapasitet, APP-ekspresjon, BACE1-aktivitet og caspase-3- og IL-1-uttrykk. Mens APP-mutasjoner hos mennesker generelt resulterer i typisk AD, er de overveiende knyttet til utelukkende amyloidpatologi hos APP-transgene mus, og det er ingen merkbar nevrodegenerasjon [14,15], siden det ikke ble observert noen karakteristiske tegn hos våre transgene mus TgAPP, i motsetning til WT-musene (tilleggsdata, figur S1). Motfarging med 40 -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) av hippocampale nevroner tillot oss å observere kjernemorfologien, siden denne forbindelsen er et fluorescerende fargestoff for nukleinsyrer. Vi observerte ikke fragmenterte eller lobulære kjerner, typisk apoptotiske; Vi observerte heller ingen bemerkelsesverdige forskjeller ved å sammenligne de hippocampale histologiske seksjonene av den transgene kontrolllinjen TgAPP angående WT-seksjonene; Vi observerte heller ingen forskjeller mellom quercetin- og rutinbehandlingene angående kontroll-TgAPP-musene.

I panelet av AD biokjemiske egenskaper som skal analyseres, fokuserte vi først og fremst på å bestemme GSH/GSSG-forholdet på en av de to flavonoiddiettene, siden uttømming av GSH-nivåer representerer en av de viktigste tidlige biokjemiske markørene i AD [16,17 ] og har blitt observert under patogenesen og sykdomsprogresjonen. Måling av GSH-nivåer i hjernen [18] og, mer nylig, GSH-nivåer i blodet [19] har vært lovende som diagnostiske markører for de tidlige stadiene av AD. Dessuten har det også blitt gjort forsøk på å supplere endogene GSH-lagre av seg selv eller deres forløpere [20–22]. I vår studie ble en nedgang i den cellulære reduserende kraften (GSH/GSSG) observert i TgAPP-musene angående WT-dyr, både hos hanner og hunner, og i begge hjerneområdene. I cortex og hippocampus til både WT- og TgAPP-mus var GSH/GSSG-forholdet lavere hos hanner enn hos kvinner. Quercetin- og rutindietter økte GSH/GSSG-forholdet betydelig sammenlignet med ubehandlede TgAPP-mus, og denne økningen var mer uttalt i hippocampus. Endringene i GSH- og GSSG-nivåer og GSH/GSSG-forhold ved quercetin- eller rutinbehandling av menn, angående økende redokskraft, var mer fremtredende enn hos kvinner. Resultatene fra våre bestemmelser kan avsløre et viktig grunnlag som ligger til grunn for kjønnsassosierte forskjeller i Tg2576-mus i mottakelighet for oksidativ skade av makromolekyler på den ene siden, siden glutationsystemet er en allsidig reduksjonsmiddel i flere biologiske funksjoner, og i virkningen av forebyggende flavonoid dietter for å gjenopprette sin fysiologiske status på den annen side. Som vi vil se gjennom denne diskusjonen, har vi satt økningen i GSH/GSSG-forholdet som hovedaksen som kan forklare settet med effekter observert i TgAPP-musene.

Det har nylig blitt foreslått at GSH/GSSG-forholdet, i stedet for bare å fungere som en redoksbuffer, i stedet vil fungere som en hovedregulatorisk mekanisme, som lar proteiner oppnå sin opprinnelige konformasjon og funksjonalitet ved å tett kontrollere tioldisulfidbalansen i cellene. proteom. Kort sagt oppstår glutationsystemet som essensielt for å bevare et sunt proteom, noe som viser at forstyrrelse av glutationredokshomeostase (dvs. genetisk eller farmakologisk) øker proteinaggregering på grunn av forstyrrelser i effekten av autofagi [23]. Derfor kan strategier rettet mot å opprettholde glutationredoks-homeostase ha terapeutisk potensial i sykdommer assosiert med proteinaggregering, som AD. Nært knyttet til bevaringen av proteomet er ubiquitin-proteasom-nedbrytningsmaskineriet, som er involvert i patogenesen av AD. Proteasomet bryter selektivt ned flere substrater som er avgjørende for å opprettholde nevronal homeostase, inkludert katabolismen av oksiderte og aggregerte proteiner. BACE1 gjennomgår ubiquitinering, og det er vist at blokkering av ubiquitin-proteasom-banen vil hemme BACE1-nedbrytning og følgelig føre til økt produksjon av BACE1 enzymatisk aktivitet, mer -spaltningsprodukt C99, og økninger i både A 1-40 og A { {8}} i nevronale og ikke-nevronale celler [10]. Våre tidligere studier har funnet at både flavonoider, quercetin og rutin, påvirker ulike signalveier og molekylære nettverk assosiert med modulering av proteasomfunksjon i neuroblastomceller [9]. I tillegg har det blitt demonstrert at nevroner supplert med redusert glutation (GSH) gjenvunnet proteasomaktiviteten og redusert aggregatdannelse [11] siden proteasomfunksjonen er redoksstatusregulert [24]. Derfor er økningen i GSH/GSSG-forholdet opplevd av dyrene etter å ha et quercetin- eller rutin-diett i samsvar med moduleringen av proteasomet med quercetin og rutin, vist ex vivo tidligere.

Som tidligere nevnt, fører redoksubalanse til svært oksidativt modifiserte proteiner som har en tendens til å akkumulere og skape aggregater som resulterer i svekkelse av proteasom [25]. Gitt den avgjørende rollen til oksidativt stress i patogenesen av AD, ble biomarkører for oksidativt stress, inkludert lipidperoksidasjon (MDA-nivåer) og antioksidantenzymer, vurdert i cortex og hippocampus i TgAPP- og WT-musene. SOD, CAT, GR og GPx er de viktigste antioksidantenzymene som virker mot frie oksygenradikaler og regulerer metabolismen av frie radikaler i kroppen og spiller en rolle i frie radikaler som fjerner systemet, og beskytter cellene i kroppen mot lipidperoksidasjon . I vår studie, som en konsekvens av APP-overuttrykk, ble det observert en generalisert reduksjon i antioksidantenzymaktiviteter hos TgAPP-mus sammenlignet med WT-mus, som var statistisk signifikant for CAT. I samsvar med reduserte GSH-nivåer ble lipidperoksidasjon betydelig økt i TgAPP-musene. Mens kilden til oksidativt stress i human AD er svært kompleks og multifaktoriell, synes amyloidpatologien utviklet hos mus å være tilstrekkelig til å starte den patologiske prosessen som fører til økt oksidativt stress i hjernen [26]. Dyr behandlet med rutin opplevde en økning i CAT-aktivitet i cortex og GR-aktivitet i hippocampus, både hos hanner og hunner. Bare dyr behandlet med rutin opplevde endringer i genuttrykk av CAT og GR i cortex og hippocampus hos både hanner og hunner og GPx i hippocampi hos hunnmus. I denne sammenheng har flere naturlige forbindelser vist seg å påvirke krysstalen mellom proteasom- og redoksreguleringen. Mer presist er quercetin en kjent Nrf2-aktivator [27] som viser antioksidantegenskaper gjennom stimulering av proteasomfunksjon, fremmer økt motstand mot oksidativt stress og gir forbedret cellelevetid [28].

Vevsspesifikk uttrykk for BACE1 er kritisk for normal APP-behandling, og dets dysreguleringsuttrykk kan spille en rolle i AD-patogenesen. BACE1 er hovedsakelig uttrykt i hippocampale nevroner, cortex og cerebellar granulære lag [10]. Det skal bemerkes at tidligere studier har vist at svenske mutante APP transgene mus hadde betydelig økte hjernenivåer av A ved en steady state [29], noe som tyder på at BACE1 spiller en viktig rolle i den amyloidogene veien i AD patogenese og er et godt terapeutisk mål. for AD-behandling. I vår studie observerte vi en signifikant reduksjon av BACE1-aktivitet ved quercetin- og rutinbehandlinger, noe som kan bidra til reduksjon av A-avsetning hos mus. Vi argumenterer for at mer enn bare å fungere som BACE1-hemmere av enzymet, quercetin og rutin kan utøve en reduksjon i BACE1-aktivitet relatert til en økning i forholdet GSH/GSSG, basert på hypotesen om å øke utvinningen av proteasomaktivitet. I denne forstand er det kjent at målretting av BACE1-hemmere til -spaltningsstedet til APPswe (svensk mutasjon) skjer før den når plasmamembranen, mens APPwt (Wild-type) behandles i et tidlig endosom med opprinnelse på celleoverflaten. Derfor er BACE1 som spalter APPwt noen ganger bundet til BACE1-hemmeren på celleoverflaten før APP-prosessering, men enzymet som behandler APPswe er ikke [30]. Det er av denne grunn at den avvikende lokaliseringen av APPswe-behandling kan redusere styrken av quercetin og rutin som BACE1-hemmere betydelig. Dermed er vi mer tilbøyelige til å støtte at BACE-aktivitetens reduksjon i denne in vivo-modellen ikke så mye skyldes hemming av enzymet, men økningen i GSH/GSSG-forholdet. I alle fall kan redusert BACE1-aktivitet tolkes som et antatt forsøk på å redusere -amyloidproduksjon i TgAPP-musene. Når det gjelder den mest bemerkelsesverdige effekten av quercetin og rutin i hippocampus på BACE1 aktivitetsdempning, er det verdt å merke seg at cortex har en betydelig høyere nevrontetthet enn hippocampus [31], og selektiv svekkelse av proteasomet i AD patologisk fenotype gjør at cortex mer sårbar og påvirket enn hippocampus [32].

Etter å ha bestemt effekten av behandlingene på BACE1 enzymaktivitet, var vi interessert i å evaluere uttrykket. Merkelig nok ble ingen signifikante forskjeller i BACE1-ekspresjon funnet mellom TgAPP-mus sammenlignet med WT-mus, og ingen merkbare endringer ble observert med quercetin- eller rutinbehandling. Derfor ser det ut til at økningen i BACE1-enzymaktivitet ikke er assosiert med en økning i ekspresjon. I denne sammenheng er det bemerkelsesverdig at Apelt et al. [14] fant en økning i kortikal BACE1-aktivitet i Tg2576-mus i alderen 9 til 13 måneder, mens ekspresjonsnivået til BACE1-protein og mRNA ikke endret seg med alderen. Videre er det funnet bevis som støtter at fibrillær amyloid A 1–42., snarere enn løselig amyloid A 1–42, kan oppregulere BACE1-proteinekspresjon, og derfor kan små modifikasjoner i forholdet mellom amyloidisoformer modulere amyloidaggregatkonformasjoner og celleskade [ 33]. Dermed kan fraværet av endring i BACE1-uttrykk ved en økning av aktiviteten som vi fant forklare forekomsten av løselig amyloid A 1–42 over den fibrillære amyloid A 1–42-isoformen i vår musemodell TgAPP.

Etter bestemmelsen av genuttrykk av enzymene involvert i APP-prosessering, evaluerte vi effekten av quercetin og rutin på enzymet -sekretase involvert i den ikke-amyloidogene behandlingen av APP. Vi fokuserte på ADAM10 fordi det er den fysiologisk viktigste konstitutive isoformen av -sekretase. ADAM10 motvirker dannelsen av nevrotoksiske oligomere A-plakk ved å spalte APP innenfor A-domenet for å produsere sAPP og C-terminale fragmenter (-CTF) [34,35]. Selv om endringene i ADAM10-ekspresjon funnet i vår studie ikke var statistisk signifikante, ble det observert en liten reduksjon i ADAM10-ekspresjon hos TgAPP-mus i forhold til WT-mus. Rutinbehandling viste hovedsakelig en tendens til å øke ADAM10-genekspresjonen i begge hjerneområdene som ble undersøkt. Postina et al. [36] viste at oppreguleringen av villtype ADAM10 i hippocampus til en AD-musemodell medierte sAPP-sekresjon, noe som førte til hemming av generering av A-plakk. Effekten av quercetin har blitt studert i en aluminiumklorid-indusert AD rottemodell som viser en signifikant forbedring av -sekretase (ADAM10 og ADAM17) i hippocampus sammenlignet med ubehandlede. Dette indikerer at quercetin har potensialet til å øke den ikke-amyloidogene veien gjennom aktivering av -sekretase-gener [37]. Prekliniske data forsterker hypotesen om at forbedring av hjernens sAPP-nivåer er en potensiell strategi for å forbedre AD-relaterte symptomer og dempe synaptiske underskudd. ADAM10 og BACE1 konkurrerer om APP-spalting, derfor kan potensering av ADAM10-aktivitet hemme den nevrotoksiske amyloidgenereringen. Dessuten kan sAPP forhindre aktivering av stress JNK-signalveien, noe som fører til aktivering av NF-KB-indusert fosforyleringsaktivitet, noe som fører til proteasomnedbrytning [38]. Derfor reduseres dannelsen og akkumuleringen av sykdomsrelaterte proteinaggregater betydelig, og den cellulære proteasomaktiviteten økes, og gir dermed bevis for en funksjon av sAPP i reguleringen av proteostase [39]. Videre har det blitt demonstrert at sAPP spesifikt oppregulerer glutamat AMPA-reseptorsyntese og dens handel [40]. I vår studie undersøkte vi om den svake økningen av ADAM10-ekspresjon ved rutinbehandling har en viss innflytelse på glutamatergisk synaptisk overføring. Som vist i tilleggsdata-delen, ble det ikke observert noen signifikante effekter på uttrykket av denne ionotropiske reseptoren på quercetin- og rutin-dietter, kanskje på grunn av en svak økning i ADAM10-ekspresjon, som ikke er tilstrekkelig for oppregulering av AMPA-reseptoren (tilleggsdata). , Figur S2 og Tabell S5).

Det bør tas i betraktning at in vitro-studier har vist et bredt utvalg av ADAM10-substrater [41], og derfor kan uønskede effekter oppnådd ved ikke-spesifikk ADAM10-målretting bli funnet i kreftproliferasjon, celleadhesjon, promotering av T-celle/NK-celle-forløper og inflammasjon, etc. [42]. For å omgå denne begrensningen, foreslår vår studie en strategi som tar sikte på å fremme frigjøringen av sAPP mer fysiologisk. Denne tilnærmingen kan være basert på et langsiktig inntak av en aktiv ingrediens (quercetin eller rutin), som konsumeres gjennom et sunt menneskelig kosthold. Det er imidlertid behov for ytterligere studier for å finne ut om økningen i ADAM10 er flavonoiddoseavhengig og om de potensielle fordelaktige effektene oppveier de antatte bivirkningene.

Når det gjelder uttrykket av APPswe, selv om innsettingen av det humane APP-transgenet i musegenomet garanterer at APPswe er overuttrykt fra fødselen, har det blitt rapportert at APP mRNA- og proteinhippocampus-nivåer viser betydelige svingninger under dyreutvikling, og er maksimale når mus er asymptomatisk (1-måned gammel) og avtagende når full symptomatologi oppstår [43]. Til tross for dette problemet, var APP-uttrykk både i cortex og hippocampus signifikant høyere sammenlignet med WT-mus i vår studie. Videre behandling med quercetin eller rutin var i stand til å redusere slikt uttrykk betydelig for både hann- og hunnmus, i begge områder av hjernen. Disse funnene er i tråd med de som er rapportert av Augustin et al. [44] som studerte et standardisert ekstrakt av Ginkgo biloba (Egb761), rik på flavonoler som quercetin, i 4-måned gamle TgAPP-hunnmus, og fant reduserte APP-mRNA- og proteinnivåer. Tatt i betraktning at oppregulering av APP-translasjon i Tg2576-mus forekommer i prodromal og tidlig symptomatiske stadier [45], er det sannsynlig at gjenoppretting av APP-translasjon med quercetin eller rutin kan ha funnet sted i våre TgAPP-mus og, sannsynligvis, i en tidlig symptomatisk stadium, noe som resulterer i en reduksjon av kortikale og hippocampale nivåer av APP, BACE1-aktivitet og kaspase{10}}-aktivering.

Videre er det rapportert andre steder at hos Tg2576-mus (i fravær av nevronalt tap) er det en økning i kaspase-3-aktivering i hippocampus [46], som funnet i vår studie, ved utbruddet av hukommelsessvekkelse , sammen med en reduksjon i dendrittiske spines før avsetning av ekstracellulær amyloid [46]. Det er bevis som støtter ikke-apoptotiske roller for caspaser i nervesystemet uten nevronal død [47], og caspase-3-aktivitet har blitt lokalisert til dendritiske ryggradene der den kan øke kalsineurinnivåene. I sin tur antas defosforyleringen av GluR1-underenheten til AMPA-lignende reseptorer, utløst av kalsineurin, å resultere i postsynaptisk dysfunksjon. Verdiene våre for kaspase-3-ekspresjon, som en konsekvens av transgenese, er i samsvar med de som ble oppnådd av andre forskere som rapporterte en økning i kaspase-{10}}-ekspresjon på nivået av dendritiske ryggradene i hippocampus til TgAPP-mus [48]. Siden APP inneholder tre distinkte spaltningssteder for caspase-3 i sin aminosyresekvens, hvorav to er lokalisert på nivået av det ekstracellulære domenet og ett i den intracellulære C-terminale delen av APP-halen [49], hydrolyse av APP av caspase-3 kan endre den proteolytiske prosesseringen av APP til fordel for den amyloidogene veien [50], som fører til frigjøring av et cytotoksisk C-terminalt avledet peptid med en lengde på 31 aminosyrer (C31), for eksempel [51]. Dette antyder at siden caspase-3 kan mediere amplifikasjonen av frigjøring av toksiske fragmenter fra APP, kan senking av caspase-3-ekspresjon av quercetin eller rutin tillate clearance av aggregert protein. I tillegg, som nevnt tidligere, har vi undersøkt påvirkningen av både økning og reduksjon av caspase-3-ekspresjon i glutamatergisk synaptisk overføring, basert på evnen til kalsineurinaktivert caspase-3 til å defosforylere GluR1-underenheten av AMPA-reseptorer på postsynaptisk nivå. Disse molekylære modifikasjonene endrer glutamatergisk synaptisk overføring og nevronal plastisitet på nivået av dendritiske ryggradene i hippocampus [48]. Teoretisk sett kan farmakologisk hemming av caspase-3-aktivitet i TgAPP-mus redde de AD-lignende fenotypene fra en mekanisme som driver synaptisk svikt. Til tross for økningen i caspase-3-uttrykk i TgAPP-musen vår, fant vi imidlertid ingen signifikante forskjeller i AMPA-reseptoruttrykk sammenlignet med det i WT-mus, som nevnt tidligere. Det kan være at endringene i caspase-3-uttrykk ikke er fremtredende nok til å produsere betydelige modifikasjoner i AMPA-reseptoruttrykk (tilleggsdata, figur S2 og tabell S5).

Når det gjelder verdiene av caspase-6-uttrykk, ble det ikke funnet noen signifikante forskjeller mellom TgAPP- og WT-mus. Aktivering av caspase-6 har blitt identifisert som en viktig mediator av nevronalt stress som spalter viktige cytoskjelettproteiner (Tau og -tubulin), og dermed forstyrrer ubiquitin-proteasom-nedbrytningen av feilfoldede proteiner, og flere aktinregulerende post-synaptiske tettheter proteiner [52]. Det uendrede uttrykket av caspase -6 i vår studie stemmer overens med fraværet av karakteristiske tegn på nevrodegenerasjon i alderen da disse transgene musene ble evaluert, sammenlignet med WT-musene (tilleggsdata, figur S1).

En markant økning i nevroinflammatoriske mediatorer er observert hos AD-pasienter, hovedsakelig rundt senile plakk [53–55]. Astrocytter er hovedleverandøren av GSH til mikroglia og nevroner. Under kronisk betennelse og oksidativt stress frigjør astrocytter giftige inflammatoriske mediatorer og frie radikaler, og akselererer aktiveringen av mikroglia og nevrodegenerasjon [56]. Det er verdt å merke seg at redusert intracellulær glutation er relatert til aktivering av inflammatoriske veier, p38 MAP-kinase, Jun-N-terminal kinase (JNK), NF-KB, i humane mikroglia og astrocytter [57]. I denne forbindelse bestemte vi oss for å kvantifisere nivåene av IL-1, IFN- og TNF- i dyremodellen vår og bestemme effekten av quercetin og rutin på dem. Som kjent fremmer betennelse defekt prosessering av A-peptid og APP, fremmer A-peptidaggregering og i sin tur modifiserer A-reaktivitet [58]. I vår studie observerte vi derfor at TgAPP-mus hadde økte mRNA-nivåer av de pro-inflammatoriske mediatorene IL-1, TNF- og IFN-, sammenlignet med WT-mus, og viste at overekspresjon av APPswe kan indusere nevro-inflammatoriske kaskader utløser en rekke molekylære veier i glia og nevroner, som vil aktivere den inflammatoriske responsen. Quercetin og rutin var i stand til å dempe IL-1-genuttrykk hos både menn og kvinner og hjerneområdene som ble studert. Flere bevis støtter den antiinflammatoriske effekten som utøves av quercetin på CNS-nivå, da det kan hemme aktiveringen av transkripsjonsfaktorer som kjernefaktor-kappa B (NF-κB) [59], involvert i induksjon av iNOS, og redusere derfor frigjøringen av mediatorer som IL-1, TNF- og IFN- [60]. Når det gjelder virkningen av GSH på den inflammatoriske responsen, bør det bemerkes at GSH er involvert i opprettholdelsen av optimale cytokinnivåer på en slik måte at ekspresjonen av pro-inflammatoriske cytokiner (TNF-, IL-1 og IL -6) øker på grunn av GSH-utarming, mens uttrykket av antiinflammatoriske cytokiner (dvs. IL-10) forble uendret. Denne GSH-homeostaseendringen skjer på grunn av oppregulering i NF-KB og JNK signalveier som kan være den mulige apoptotiske veien mot nevronal celledød [61]. I vår studie kan nedregulering av NF-KB av quercetin og rutin være en plausibel mekanisme for å gjenopprette GSH/GSSG-homeostasen og derfor årsaken til balansen mellom pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske cytokiner. Til slutt, siden BACE1-promotoren har et NF-KB-bindingssted, letter inflammasjonsindusert aktivering av NF-KB oppreguleringen av BACE1-ekspresjon, og øker deretter A-produksjonen [62]. Således, hvis nedregulering av NF-KB skjer ved quercetin- og rutin-dietter, vil BACE1-aktiviteten reduseres som et resultat av frigjøringsreguleringen av pro-inflammatoriske og ikke anti-inflammatoriske cytokiner.

4. Materiale og metoder

4.1. Forsøksdyr

En transgen mus (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) som uttrykker den svenske dobbeltmutasjonen av humant amyloid forløperprotein (hAPP) ble brukt som dyremodell for eksperimentell AD [14]. Musen er en knock-in heterozygotlinje som uttrykker den humane A PP695 isoformen med den doble svenske mutasjonen (K670N/M671L; Lys670→Asn og Met671→Leu) under kontroll av hamster prionproteinpromotoren [63]. Som et resultat viser denne musen nivåer av humant amyloid-forløperprotein (A PP), seks ganger høyere enn nivåene til en mus A PP. I tillegg viser denne musen høyere nivåer av A 40 og A 42. A-avsetninger begynner ved 9 måneders alder [63]. Innenfor Tg2576 hippocampus og cortex er APPswe transgenekspresjon primært neuronal [64].

Som en negativ kontroll ble villtype (WT) mus fra samme koloni [65,66] brukt. Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) musekoloni ble utviklet i vårt laboratorium fra Tg2576 heterozygote hanner og villtype hunner. De transgene foreldrene ble donert av Dr. Diana Frechilla fra Neuroscience Division ved Center for Applied Medical Research ved University of Navarra (Pamplona, ​​Spania) [67].

Dyrene ble holdt i individuelt ventilerte bur og holdt ved 22–24 ◦C i en 12-t lys/mørke-syklus i 50–60 prosent fuktighet. Dyreprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Complutense University of Madrid og var i full overensstemmelse med det europeiske direktivet 2010/63/om beskyttelse av dyr brukt til vitenskapelige formål og spansk lovgivning om dyrevelferd ( Kongelig resolusjon 53/2013, 1. februar 2013).

4.2. Genotypingsanalyser av mus

Transgenisitet ble bestemt innen 30 dager etter fødselen ved halebiopsi. Genotypingsanalyser av dyr ble utført ved PCR. Tatt i betraktning at Tg2576 (TgAPP) er en heterozygot linje, ble innsettingsgenet (PrP, fra prionprotein) brukt som en positiv reaksjonskontroll. Genomisk DNA ble ekstrahert fra musehaler fordøyd med proteinase K (0,1 µg/µL) i NID-buffer (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM MgCl2, 0,05 prosent gelatin, 0,45 prosent NP-40 og 0,4 prosent Tween 20) ved 56 ◦C i 3 timer og ristet. DNA-fragmenter ble utfelt med isopropanol og vasket med 70% etanol. DNA-presipitater ble oppløst i 30 µL TE-buffer (10 mM Tris-1 mM EDTA). Renheten og konsentrasjonen av DNA ble bestemt ved 260 og 280 nm.

PrP- og APP-genene ble amplifisert ved PCR. Sekvenser av primere brukt for å screene de transgene musene var som følger: PrP fremover: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP omvendt: GTGGATACCCCCTCCCCCAGCCTAGACC; APP bakside: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Trinnene i PCR-reaksjonen var som følger: denaturering ved 94 ◦C i 90 s, 39 sykluser ved 60 ◦C i 60 s og 72 ◦C i 90 s, deretter endelig forlengelse ved 72 ◦C i 7 min.

I alle tilfeller ble negative kontroller (uten DNA-mugg) og positive kontroller av APP-genet vurdert. PCR-produktene som ble oppnådd ble separert ved elektroforese i 1,5 prosent agarosegeler i 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) buffer ved 70 V (konstant spenning) og deretter avbildet ved farging med GelRed (Millipore).

4.3. Dyrebehandlinger

TgAPP-mus og villtype kullkamerater, begge i alderen 6–7 uker med en initial kroppsvekt på 16,2 ± 0,8 g, ble randomisert i følgende fire grupper (n=8/gruppe): ( a) Ubehandlet TgAPP; (b) Quercetin-behandlet TgAPP; (c) Rutin-behandlet TgAPP; og (d) ubehandlet villtype. Siden både hann- og hunnmus ble studert, ble to sett med grupper etablert. I en alder av 45 uker begynte musene å bli behandlet med quercetin eller rutin i 4 uker.

Quercetin (3,30,40,5,7-pentahydroksyflavon) og rutinhydrat (quercetin-3-O-rutinosidhydrat) var større enn eller lik 95 prosent rene og kjøpt fra Sigma–Aldrich. Hver av flavonoidene ble inkorporert i en standard diett (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Spania) i en konsentrasjon på 200 ppm, tilsvarende et inntak på 30 mg flavonoid/kg kroppsvekt/dag. De ubehandlede musene fikk utelukkende den ikke-supplerte standarddietten. Dietter og vann ble gitt for ad libitum inntak.

4.4. Hjernevevsforberedelse for biokjemiske og histologiske analyser

På slutten av behandlingen ble musene fastet over natten, de ble avlivet ved bruk av cervikal dislokasjon, og hele hjernen ble raskt fjernet. Hjernen ble skylt i saltvann ved 4 ◦C og arachnoidmembranen ble forsiktig fjernet. Deretter ble hippocampus og cortex isolert. Prøver ble umiddelbart lagret ved -80 ◦C inntil videre bruk.

Hele hjernen til noen dyr ble brukt for å oppnå histologiske seksjoner, for hvilke, når de først ble avlivet ved bruk av cervikal dislokasjon, ble hjerner frosset ved nedsenking i isopentan ved -80 ◦C. Umiddelbart etterpå ble koronale deler av hjernen (30 µm tykkelse) laget fra luktepæren til lillehjernen, 120 µm fra hverandre i en kryostat (Leica CM1850, Nussloch, Tyskland). Hele prosedyren ble utført ved -20 ◦C. Histologiske snitt ble samlet på objektglass og holdt ved -80 ◦C frem til analyse (se tilleggsmetoder).

4.5. Glutation

For glutationtester ble prøver av hjernebark og hippocampus homogenisert i en redoksslukkingsbuffer -5 prosent triklorideddiksyre (RQB-5 prosent TCA) (tidligere boblet med N2 i 15 minutter på is) i en konsentrasjon på 25 mg/ml (vekt/volum). Prøver ble resuspendert ved sonikering i 10 s, deretter sentrifugert ved 12, 000 x g i 10 minutter ved 4 ◦C, og supernatanter ble samlet.

Deretter, i den oppnådde supernatanten, ble spektrofluorometriske metoder tatt i bruk for å bestemme GSH- og GSSG-nivåer ved å bruke o-ftalaldehydmetoden, beskrevet av Senft et al. [68]. GSH- og GSSG-verdier ble korrigert for spontan reaksjon i fravær av en biologisk prøve. I begge tilfeller ble supernatantene inkubert i 30 minutter ved romtemperatur og etterpå ble fluorescens målt ved bruk av en FLUOSTAR mikroplateleser (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Tyskland), med eksitasjonsfilteret satt til 360 nm (båndbredde 5 nm) og emisjonsfilteret satt til 460 nm (båndbredde 5 nm). Konsentrasjonen av GSH og GSSG i hver prøve ble interpolert fra kjente GSH-standarder. Konsentrasjoner av både GSH og GSSG ble uttrykt som nmol GSH/mg protein, noe som muliggjorde beregningen av glutationredoksforholdet GSH/GSSG.

De gjenværende pellets ble vortexet til de var fullstendig oppløst i 24 0 µL 0,1 M NaOH for å måle proteinkonsentrasjonen ved hjelp av bicinchoninsyre (BCA)-metoden, ved bruk av bovint serumalbumin som standard.

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】