En rask og enkel clearing- og svellingsprotokoll for 3D in-situ-avbildning av nyrene på tvers av skalaer
Mar 23, 2022
De siste årene har det blitt publisert mange lysmikroskopiprotokoller for visualisering av nanoskalastrukturer inyre.Disse protokollene gir forskere nye verktøy for å evaluere både fotprosessens anatomi og utsletting, samt proteinfordelinger i fotprosesser, spaltemembranen og i den glomerulære basalmembranen. Imidlertid involverer disse protokollene enten bruk av forskjellige kompliserte superoppløsningsmikroskoper eller lange prøveforberedelsesprotokoller. Her presenterer vi en rask og enkel, fem timer lang prosedyre for tredimensjonal visualisering avnyremorfologi på alle lengdeskalaer. Protokollen kombinerer optisk clearing og vevsekspansjonskonsepter for å produsere en mild hevelse, tilstrekkelig for å løse nanoskalastrukturer ved hjelp av et konvensjonelt konfokalt mikroskop. Vi viser at protokollen kan brukes til å visualisere et bredt utvalg av patologiske funksjoner hos både mus og menneskernyrer. Dermed kan vår raske og enkle protokoll være gunstig for konvensjonell mikroskopisk evaluering avnyrevevsintegritet både i forskning og eventuelt i fremtidige kliniske rutiner.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKSJONEN
Tallrike optiske protokoller for avbildning av nanoskalastrukturer inyrehar blitt presentert de siste årene.I- Kraften til disse nye teknikkene som verktøy for å kvantifisere filtrasjonsbarriereanatomi og patologi er eksemplifisert i nyere publikasjoner fra vår gruppe og andre.5, prosent ,10Selv om de er kraftige, krever alle disse optiske protokollene bruk av avansert diffraksjons-ubegrenset mikroskopi eller involvere introduksjon av kompleks polymerkjemi i prøven for å deparere og/eller fysisk utvide den. Mange av protokollene er også tidkrevende og krever en betydelig mengde praktisk arbeidskraft. Dette ekstra laget av kompleksitet kan være det som hindrer disse nye metodene fra å bli rutinemessig brukt av både forskere og kliniske patologer. Videre mangler mange av protokollene tilgang til dyp 3-dimensjonal (3D) avbildning av fotprosesser (FP-er) utover 5-15 um i dybden.-1,7,8 Derfor hadde vi som mål å utvikle en drastisk forenklet og rask alloptisk protokoll som tømmer og svulmer oppnyrevevsprøver tilstrekkelig til å tillate in situ 3D høyoppløselig analyse avnyreanatomi og patologi ved bruk av et konvensjonelt diffraksjonsbegrenset mikroskop tilgjengelig i nesten alle biovitenskapelige og patologiske institusjoner.Tidligere protokollforenklinger har vist at introduksjonen av akrylamidpolymerer i paraformaldehydfikserte prøver kan utelates fullstendig samtidig som vevsintegriteten bevares ved natriumdodecylsulfat (SDS) clearance. En annen studie har vist at vevsprøver kan utvides med mer enn en faktor 2 ved å bruke en enkel polymerfri protokoll basert på nedsenking i forskjellige vandige løsninger.2 Dermed fjernet vi akrylamidinfusjon fra våre mer kjedelige og komplekse publiserte protokoller² og endret prøveinnleiringsmedium for å tillate en mild (1.3-fold lineær) hevelse avnyrevevsprøver. Ved også å optimalisere bildeparametere, oppnådde vi en tilstrekkelig høy effektiv oppløsning for 3D-visualisering av podocytt-FP-er og den glomerulære basalmembranen (GBM) ved bruk av konvensjonell konfokalmikroskopi.
Nøkkelord:fokal segmentell glomerulosklerose; IgA nefropati; podocytt; nyrebiopsi; nyrepatologi; nyre
RESULTATER
Optisk clearing og mild hevelse av nyrevevDen enkle dearing/svelling-protokollen er avbildet skjematisk i figur la. Legg merke til at SDS-delipideringstrinnet ikke først og fremst ble lagt til for optisk transparens, men snarere for å sikre tilstrekkelig svelling av prøvene.7 Videre, når delipidering utelates, er fargekvaliteten dårlig (tilleggsfigur SlA). Vi viser at rask delipidering ved 70 grader i 1 time ga gode resultater uten at prøvenedbrytningen skjedde ved høyere temperaturer (tilleggsfigur S1B). Som rapportert av Murakami et al., kan urea og urea-lignende molekyler effektivt svelle vevsprøver, noe som resulterer i økt effektiv romlig oppløsning. Vi tilsatte dermed 4 M urea i en blanding med 80 prosent (vekt/vekt) fruktose (kalt FRUKT), noe som resulterte i en lineær svellingsfaktor på -1.3(Figur lb).
For å forkorte merkingstiden brukte vi fargestoffkonjugerte primære antistoffer. Ved bruk av fargestoffkonjugerte nefrinantistoffer i en standard fargebuffer (fosfatbufret saltvann med Tween 20), var ikke signal- og merkingseffektiviteten høy nok til å skissere individuelle FP-er. Ved å bruke en alternativ fargebuffer, HEPES-TSC, ble imidlertid fargekvaliteten økt til en tilfredsstillende grad (tilleggsfigur S1C). Sammenlignet med tidligere publiserte protokoller ved bruk av konvensjonell mikroskopi, overgikk vår raske og enkle 5-timeprotokoll dem på flere viktige parametere (figur lc-f). Protokollen presentert av Pullman et al.' er litt raskere totalt sett, men har ulempene ved å kreve strukturert belysningsmikroskopi med superoppløsning og bruk av tynne kryoseksjoner, som utelukker tilgang til store bildedybder. Merk at protokollen vår er mindre kompleks enn standard parafininnstøping eller kryosnitt når alle evaluerte parametere vurderes.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFEILT
Optimalisering og validering av vår protokoll for å løse fotprosesserFordi protokollen vår bare gir en moderat svellingsfaktor på 1,3, måtte konfokale bildeparametere optimaliseres for å oppnå tilstrekkelig oppløsningskraft for bildebehandlings-FP-er. Musnyreprøver ble behandlet i henhold til protokollen og farget for nefrin ved bruk av forskjellige fluoroforer. Oppløsningen til et konfokalt mikroskop avhenger av både pinhole-størrelsen og bølgelengden til eksitasjons-/emisjonslyset.15 Derfor brukte vi en mindre pinhole-diameter på 0.3 Luftige enheter (AU) sammen med en grønn-emitterende fargestoff, Alexa Fluor 488, og oppnådde på denne måten tilstrekkelig oppløsning til å løse FP-er i villtype (WT) musnyrer(Figur 2a). Derfor, når muse-FP-er skal visualiseres, brukes fluoroforer med en maksimal eksitasjonsbølgelengde på 488 nm. Under disse optimaliserte avbildningsforholdene var vi i stand til å visualisere hele museglomeruli i 3D med en effektiv oppløsning på -115 nm, god nok til å løse individuelle FP-er (Figur 2b-e). Dessuten viser vi at en antistoffpenetrasjonsdybde på minst 70 μm oppnås med rask merking (tilleggsfigur S2A-C). Bruk av et glyserolobjektiv med korreksjonskrage gir tilgang til større Z-dybder enn noen av de tidligere utviklede protokollene, med unntak avclearing/stimulated emission depletion protokoll. Fordi den aksiale oppløsningen til et konfokalt mikroskop er omtrent 3 ganger dårligere enn den laterale oppløsningen, bør kapillærer orienteres i xy-planet for optimal oppløsning av FP-er. Vi viser at med protokollen vår kan vi finne mange (opptil 25) områder for avbildning i hver glomerulus (tilleggsfigur S2D), slik at vi kan samle store mengder data for også å oppdage subtile variasjoner i infiltrasjonsbarrierestrukturer. Dette demonstrerer viktigheten av å ha tilgang til dybdedimensjonen når man utfører kvantitative analyser med høy gjennomstrømning av glomerulær helse. Viktigere, vi validerte også protokollen for å løse FP-er i humant pasientmateriale (figur 2f og g), som er mindre utfordrende sammenlignet med mus, på grunn av de større dimensjonene til humane FP-er. Dessuten, ved å bruke hvetekimagglutinin (WGA) lektin med en affinitet mot glykokalyxen til FP-er, var vi også i stand til å løse FP-er på en tverrsnittsmåte i både muse- og menneskeprøver (Figur 2h og i). I tillegg testet vi for nefrin, med forventet lokalisering i spaltemembranen, som viser at vi kan få data om proteinlokalisering i tillegg til morfologisk informasjon.
Filtrasjonsbarrierepatologi i museprøverSom rapportert tidligere kan '-,5,6,9,10 en face FP-avbildning av spaltemembranen lett brukes til å visualisere og kvantifisere FP-utsletting. Vi validerer at denne tilnærmingen også kan brukes med vår nye protokoll ved å bruke en nylig publisert musemodell for fokal segmentell glomerulosklerose (FSGS) (figur 3). Ved å farge for nefrin, kunne spaltemembranmønsteret visualiseres i 3 dimensjoner i hele glomeruli av WT og muterte mus (figur 3a og b). Som rapportert tidligere5, kan spaltemembranlengden per område kvantifiseres semiautomatisk, og denne analysen gir et resultat som er konsistent med det som tidligere er publisert for denne muselinjen (Figur 3c). Videre ble glomerulære kapillærer avbildet i tverrsnitt som viser både utsletting av FP-er så vel som endringer i GBM (figur 3d-f); se Supplerende metoder og figur S3 for detaljer om GBM-målinger.
Filtrasjonsbarrierepatologi i prøver fra menneskerFor ytterligere å validere vår protokoll for mulig klinisk bruk, brukte vi den på menneskelig vev fra pasienter diagnostisert med forskjellige typernyresykdom. To pasienter med medfødt nefrotisk syndrom, enten med en homozygot mutasjon i NPHS1-genet (koder for nefrin), eller transassosierte mutasjoner i TRPC6- og NPHS2-genene (koder for TRPC6-kanalen og podocin). Vi analyserte også 2 pasienter diagnostisert med FSGS og minimal change disease. Vi kunne visualisere og kvantifisere typiske kjennetegn vednyresykdom, slik som FP-utsletting, samt GBM-endringer (Figur 4). Bilder kan hentes både på ansiktet (Figur 4a-e) og fra siden (Figur 4g-k). Dessuten observerte vi forventet fravær av nefrin i spaltemembraner til pasienten med en NPHS1-mutasjon (figur 4b og h). Som for museprøver
(Figur 3), bildedata kan evalueres kvantitativt (Figur 4f og l og tilleggsfigur S4A og B).
Merk at uventet mild GBM-fortykkelse ble observert hos de diagnostiserte pasientene sammenlignet med kontroller. Den nefrektomiserte kontrollennyrei figur 4 ble tatt fra en eldre pasient, mens alle de andre prøvene var fra spedbarn eller barn. Fordi GBM-tykkelsen øker med alderen (tilleggsfigur S5A-E), vil en mer signifikant fortykkelse sannsynligvis bli observert sammenlignet med alderstilpassede kontrollpasienter. Vi validerte også at ingen aldersavhengig hevelsesartefakt ble introdusert av protokollen vår (tilleggsfigur S5F-H), og også at en annen GBM-målestrategi ga lignende resultater (tilleggsfigur S5I og D).
Storskala patologi i prøver fra mus og menneskerFordi ikke bare filtrering barriere skala, men også histologiske endringer tilnyremorfologi, er av stor interesse for både forskere og klinikere, undersøkte vi muligheten for å bruke protokollen vår for å vurdere storskala morfologi gjennom fluorescensbasert histologisk analyse. Vi viser at ved å bruke lavere forstørrelsesmål, kunne vi oppdage storskala patologier og forskjeller i proteinuttrykk i både menneskelige prøver (tilleggsfigur S6) og museprøver (tilleggsfigur S7).
Visualisering av patologiske endringer hos pasienter diagnostisert med FSGS og IgA nefropatiFor ytterligere å eksemplifisere mulig bruk av protokollen i pasientprøver, undersøkte vi om vi kunne oppdage patologiske trekk ved FSGS av den cellulære typen. Vi var i stand til å visualisere de fleste patologiske trekk nevnt i uttalelsen fra patologen, inkludert fokal total/segmental stenose, tubulær atrofi og endotelial hypercellularitet i glomerulære kapillærer sammenlignet med nåværende gullstandardmetoder (Figur 5a-j). En kvalitativ og kvantitativ side-ved-side-sammenligning med elektronmikroskopi (EM) viste lignende resultater ved bruk av begge metodene (Figur 5k og l og Supplerende Figur S4; se Supplerende metoder for en diskusjon av FP-breddemålinger).
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESMERTER
Vi brukte også protokollen på en biopsiprøve fra en pasient diagnostisert med IgA nefropati (IgAN) (Figur 6) og var i stand til å bekrefte visualiseringen av mange diagnostiske funksjoner. Ingen alvorlige patologier var tydelige i filtreringsbarrieren (Figur 6a og b), og en sammenlignende analyse resulterte i ingen åpenbare forskjeller mellom EM og vår protokoll (Figur 6c og d). Deretter ble histologien til lånenyren evaluert med både standard histologi (Figur 6e) og "fluorescenshistologi" (Figur 6f). Vi kunne visualisere endringene (eller mangelen på endringer) nevnt i uttalelsen fra patologen, som interstitiell infiltrasjon av celler (Figur 6g og h), normale glomerulære kapillærer (Figur 6i), og mesangial ekspansjon/hypercellularitet (Figur 6j). Immunfarging ved bruk av et IgA-antistoff avslørte tydelig avleiringer både i stor skala (Figur 6k og l) og i detalj (Figur 6m) med et mønster tilsvarende det som sees på standard immunfluorescens (Figur 6n og o). Til slutt viste FP-avbildning delvis mild utsletting (figur 6p og q). De patologiske egenskapene som vi kunne oppdage med protokollen vår er oppsummert i tilleggstabell S1.
DISKUSJON
Her presenterer vi en protokoll for high-throughput visualisering avnyrestrukturer på alle lengdeskalaer som er både raskere og enklere enn tidligere publiserte protokoller for FP-analyse og glomerulær filtrasjonsbarriereavbildning inyre, Vi viser at oppløsningen vi oppnår er høy nok til å trekke konklusjoner om patologier i filtrasjonsbarrieren ved hjelp av enkel konfokalmikroskopi, et standardverktøy som allerede er tilgjengelig i de fleste forskningsanlegg og patologilaboratorier. 3D-evnen til protokollen er viktig når du utfører bildebehandling av FP-er fordi et stort bildevolum er tilgjengelig, noe som muliggjør identifikasjon og screening av passende områder av prøven for kvantitativ analyse.
Et viktig funn av studien vår er at protokollen vår ikke bare fungerer komplementært og fordelaktig sammenlignet med standardprotokollene som for tiden brukes for standardanalyse avnyrevev. Det kan også slå sammen disse arbeidsflytene til én protokoll, med tilsynelatende besparelser i form av arbeidstimer og nødvendig materiale/reagenser/utstyr. Men siden analysen i stor grad er basert på antistoffer, er kostnaden for merking av reagenser rimelig høy (rundt 20e per prøve), noe som også gjelder for de andre fluorescensbaserte protokollene som presenteres i denne artikkelen (inkludert vanlig immunfluorescens).
I den raskeste versjonen av protokollen bruker vi fargestoffkonjugerte primære antistoffer som gir tilstrekkelig fargekvalitet for å løse FP-er. Det resulterende signalet er imidlertid alltid lavere sammenlignet med det fra en 2-trinns primær/sekundær tilnærming. Dessuten er de primære konjugerte antistoffene brukt i studien ikke kommersielt tilgjengelige og må konjugeres internt. Derfor, for noen applikasjoner, kan en 2-trinns primær/sekundær fargingsprotokoll fortsatt være å foretrekke, som legger til 2 timer til protokollen. Nyere studier har brukt Airyscan mikroskopi pånyrevev, som bruker variable pinhole-innstillinger på en liten kameraarraydetektor i kombinasjon med dekonvolusjon og signalomtilordning bildebehandling.7,18 I denne studien viser vi at med mild hevelse og påfølgende suverene farging- og avbildningsforhold, konvensjonell konfokal avbildning med en
Et nedstengt nålhull gir tilstrekkelig oppløsning uten behov for matematisk etterbehandling av bilder. I dette arbeidet presenterer vi komparative data for vår protokoll og standardmetoder for evaluering av patologi i pasientprøver. Analysen ble imidlertid utført på et lite antall pasienter, og videre studier er avgjørende for å undersøke om protokollen kan brukes til å oppdage mengde patologiske parametere som finnes i andre typernyresykdommerogså. For å oppnå dette må det settes i gang et målrettet samarbeid med både patologer, prøveforberedende eksperter og bildeeksperter. Denne grundige valideringen var ikke innenfor rammen av denne proof-of-principle-studien, der målet var å utvikle en rask, optisk protokoll for høyoppløselig bildebehandling avnyre.Det bør også understrekes at oppløsningen av protokollen vår er langt fra den for EM og ikke kan løse fibrillære avleiringer, for eksempel, og så i noen tilfeller vil EM fortsatt være nødvendig for nøyaktig diagnose.
I denne studien brukte vi rålengdemålinger uten å korrigere for seksjoneringsartefakter som oppstår fra ikke-ortogonal optisk eller fysisk seksjonering av den målte strukturen (GBM eller FP). Det er 2 hovedgrunner for å representere dataene i dette skjemaet. For det første er det ikke enkelt å korrigere for seksjoneringsartefakter mens man beholder informasjon angående endringer i nanoskala (som en uregelmessig "humpete" GBM). For det andre, i våre gjennomsiktige prøver, valgte vi alltid et bildeplan
der strukturen som studeres er justert så ortogonalt som mulig til avbildningsplanet. Dermed er seksjoneringen ikke tilfeldig, noe som ytterligere kompliserer seksjoneringsartefaktanalyse. Følgelig er gjennomsnittsverdiene presentert i denne studien sannsynligvis litt overvurdert, og seksjoneringsartefakter bidrar til spredning av data i spredningsplott. For fremtidige seksjoneringskorrigerte målinger av strukturer uten tap av reell variasjon av data, kan modifiserte versjoner av eksisterende seksjoneringsartefaktkorreksjonsmetoder, slik som den ortogonale avskjæringsmetoden, potensielt brukes.!920
Evnen til å trekke ut patologiske parametere fra ryddetnyrevev som bruker både ikke-merkede (autofluorescens) og fluorescensmerkede prøver har blitt demonstrert nylig.-I tillegg har en nylig studie vist at "virtuell histologi" kan utføres ved bruk av dyp læring al-for elementer på autofluorescensbilder, og nevrale nettverksbasert segmentering og klassifisering av nyrepatologier er også vist. Sammenslåing av nye prøveforberedelsesmetoder (som rapportert her) med nye bildeanalyseverktøy gir mange interessante digitale muligheter i fremtiden, og vi vil sannsynligvis se endringer i hvordan vi forestiller oss og analyserer nyreprøver både i forskning og i klinikken.
MATERIALER OG METODER Mus- og nyrevev fra menneskerAlle museeksperimenter ble godkjent av det tyske statskontoret i Nordrhein-Westfalen, departementet for natur, miljø og forbrukerbeskyttelse, og ble utført i samsvar med europeiske, nasjonale og institusjonelle retningslinjer. Mus med 100 prosent C57BL/6N bakgrunn ble brukt. Etter induksjon av anestesi med ketamin og xylazin, ble musene avlivet ved hjerteperfusjon med Hanks balanserte saltløsning og fiksert som beskrevet nedenfor.
Pasientmateriale ble innhentet fra 2 barn som led av steroid-resistente nefrotisk syndrom på grunn av enten punktmutasjoner i NPHSI eller sammensatte-heterozygote punktmutasjoner i TRPC6 og NPHS2, samt 3 pasienter diagnostisert med fokal segmentell glomerulosklerose, minimal endringssykdom og IgA nefropati , henholdsvis. Kontroll humant vev ble samlet inn fra pasienter som ble nefrektomisert pganyresvulster. Vevsprøver dissekert fra den ikke-tumorøse polen tilnyreviste et normalt histologisk bilde ved rutinemessig histologisk undersøkelse. Alle prosedyrer ble godkjent av den etiske kommisjonen i Köln og den regionale etiske komiteen i Stockholm og utført i samsvar med Helsinki-erklæringen. Der det var aktuelt, ga pasienten eller pasientens foresatte informert samtykke.
Musemodell for FSGSMus med 2 sammensatte-heterozygote punktmutasjoner, Pod8asicyAzv ble generert som beskrevet tidligere." Mus ble avlivet etter 20 uker som angitt ovenfor.FikseringMenneske og musnyrerble fiksert i 4 prosent paraformaldehyd i 1× fosfatbufret saltvann ved romtemperatur i 1-3 timer. Det nefrektomiserte mennesketnyreble fikset i Dubosaq-Brasil-løsning i 3 timer.SeksjoneringPrøver ble innebygd i 3 prosent agarose og seksjonert til 300 μm tykkelse ved bruk av en vibratom.DelipideringPrøver ble inkubert i en klaringsløsning (200 mM borsyre og 4 prosent SDS, pH 8,5) ved 70 grader C i 1 time med risting ved 500 pm.MerkingMerkingsprotokollen og en liste over antistoffer/prober er gitt i tilleggsmaterialet.MonteringPrøver ble inkubert i 80 prosent fruktose (1 ml dH,0 tilsatt 4 g fruktose) som inneholdt 4 M urea ved 37 grader med risting ved 500 rpm i 15 minutter, og deretter plassert i en MatTek-skål (MatTek) , Ashland, MA) med et dekkglass på toppen (for å forhindre fordampning) før avbildning,BildebehandlingBilder ble hentet ved hjelp av et Leica SP8-konfokalsystem (mål oppgitt i figurlegendene) (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL). Bildebehandling med 100×-objektivet innebærer alltid en pinhole-innstilling på 03 AU (som beregnet for 594-nm lys) hvis ikke annet er oppgitt. Standard histologisk avbildning ble utført ved bruk av et Leica DM3000-system (Figur 5) eller et Olympus BX45-system (Olympus, Tokyo, Japan) (Figur 6). Standard immunfluorescens ble utført ved bruk av et Nikon Microphot-FXA (Nikon, Tokyo, Japan), og EM ble utført med et Zeiss 912 (Figur 5) eller Hitachi 7700 (Hitachi, Tokyo, Japan) (Figur 6) transmisjonselektronmikroskop.Bildebehandling og analyseMed mindre annet er oppgitt, ble bildene jevnet ut ved å erstatte hver pikselverdi med gjennomsnittet av 3×3-området ved bruk av Fiji/ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). De morfometriske analysene er beskrevet i Supplerende metoder og vist i tilleggsfigur S4.
