En ny homozygot KLHL3-mutasjon som årsak til autosomal recessiv pseudohypoaldosteronisme type II diagnostisert sent i livet Ⅱ
Nov 02, 2023
Resultater
Saksrapport
Pasienten, en kvinne av tyrkisk opprinnelse, ble henvist i en alder av 58 år til poliklinikken ved avdelingen for nefrologi, universitetssykehuset Düsseldorf, for vedvarende hyperkalemi (første gang diagnostisert i en alder av 47 år), mistenkt type IV renal tubulær acidose i tilstedeværelse av kronisk nyresykdom (CKD) (G3a A2, KDIGO), skrumplever i venstre nyre, nefrolithiasis med en historie med kirurgisk steinfjerning i en alder av 17 år, tilbakevendende urinveisinfeksjoner og hypertensjon (første gang diagnostisert i en alder av 41 år) år). Hennes tidligere medisinske historie var signifikant for koronar hjertesykdom, med status post-non-ST segment elevation myokardinfarkt i en alder av 47 år, multiple stentimplantasjoner og ST-elevation myokardinfarkt 5 måneder før henvisning. Etter det andre hjerteinfarktet hadde serumkaliumnivået steget opp til 7,3 mmol/L, og sterke muskelsmerter startet. Pasienten rapporterte også paroksysmalt atrieflimmer, hyperkolesterolemi og allergi mot kontrastmidler. Medisiner inkluderte bisoprolol 2,5 mg 2 ganger daglig, kalsiumpolystyrensulfonat 15 g 2 ganger daglig, natriumhydrogenkarbonat 3 g tid, fenprokumon, atorvastatin 40 mg qd, aspirin 100 mg qd, pantoprazol 40 mg qd, L-tyroksin 25 ug clopiqdrel og 7 ug. . Midlertidig seponering av statinbehandling hadde ikke lindret muskelsmerter. Seponering av en AT1-reseptorantagonist som hadde vært på kuren hennes, samt en diett med lavt kaliuminnhold, hadde ikke ført til en forbedring av hyperkalemi.
Familiehistorien var signifikant for foreldrenes slektskap (I grads søskenbarn), hypertensjon hos begge foreldrene, et dødelig hjerneslag hos moren i begynnelsen av 60-årene og koronarsykdom hos faren. Broren hennes hadde dødd av nyresykdom av uklar opprinnelse i Tyrkia i 50-årene (vist i fig. 1 a).
På tidspunktet for evalueringen var blodtrykket 148/87 mm Hg, og pulsen hennes var 60/min. Klinisk undersøkelse var umerkelig, bortsett fra mildt ødem i underekstremitetene, multiple hematomer og striae distensae.
KLIKK HER FOR Å FÅ URTEFORMULERING AV CISTANCHE FOR NYRE
Laboratorieundersøkelse viste hyperkalemi (serumkalium på 5,3 mmol/L [normal 3,6–4,8]), normalt serumnatrium (139 mmol/L, normal 135–145), hyperkloremi (107 mmol/L, normal 95 –105), hypomagnesemi ved 0,55 mmol/L (normal 0,73–1.00), forhøyet serumkreatinin ved 1,18 mg/dL (normalt<0.90) with an estimated glomerular filtration rate of 51 mL/min (CKD-EPI [40], normal 90–140), elevated urea of 47 mg/dL (normal 21– 43), suppressed renin concentration (<1.0 pg/mL [normal 1.7–23.9]), and aldosterone of 157 pg/mL (normal 12–236). Serum calcium and phosphate were normal (2.31 mmol/L [normal 2.10–2.42] and 0.95 mmol/L [normal 0.84–1.45], respectively). Venous blood gas analysis revealed pH 7.33 (normal 7.35–7.43), standard bicarbonate 19.8 mmol/L (normal 24–30), and standard base excess −5.3 mmol/L (normal −2 to +3). Spot urinary potassium was low (6.5 mmol/L [normal 10–200]), whereas spot urinary calcium was normal (0.36 mmol/L); urinary creatinine was 24.2 mg/dL. There was no detectable albuminuria or proteinuria.
Renal ultralyd viste en liten høyre nyre (8,5 cm lang) med tynt, inhomogent parenkym, mistenkt arrdannelse og en 12-mm veldefinert rund cyste. Den venstre nyren var normal i størrelse (10 cm lang), med normal parenkymal tykkelse, en 22-mm veldefinert rund cyste og en komplisert 12-mm veldefinert rund cyste med en mistenkt septum . Det var ingen tegn på hydronefrose.
Tilstedeværelsen av hyperkalemisk metabolsk acidose med utilstrekkelig lav kaliumutskillelse i urinen, som ikke ble forklart av CKD alene, lav-reninhypertensjon med aldosteron som var utilstrekkelig lav i for hyperkalemi, og foreldrenes slektskap førte til at vi vurderte PHA II. Oppstart av behandling med hydroklortiazid 25 mg daglig førte til en reduksjon av serumkalium til 4,2 mmol/L innen 1 uke, og blodtrykket normaliserte seg. Kalsiumpolystyrensulfonat og natriumhydrogenkarbonat ble raskt avviklet. En midlertidig reduksjon av hydroklortiazid til 12,5 mg qd førte til at hyperkalemisk acidose dukket opp igjen. Hyponatremi oppstod etter hydroklortiazidbehandling og gikk over etter en diett rik på salt. To måneder etter det første besøket på klinikken vår, var de opprinnelig rapporterte muskelsmertene forsvunnet. Mindre smerte som ble beskrevet som forskjellig i karakter ble tilskrevet statinbehandling i nærvær av mild CK (153 U/L, normal<145) and LDH (250 U/L, normal <147) elevation. A review of prior therapy for hypertension revealed a regimen of valsartan plus hydrochlorothiazide (12.5 mg) prior to myocardial infarction, after which hydrochlorothiazide had been discontinued, apparently unmasking electrolyte abnormalities and causing muscle pain.
Genetisk analyse
På grunn av den kliniske mistanken om PHA II, utførte vi PCR og Sanger-sekvensering av KLHL3-, CUL3-, WNK1- og WNK4-genene (se Metoder). Ingen varianter i genene WNK1, WNK4 og CUL3 ble identifisert. Imidlertid ble en homozygot chr5:g.136973013 G > A (GRCh37)-variant identifisert i KLHL3-genet, noe som resulterte i en p.Arg431Trp-missense-mutasjon (NP_059111.2) spådd som sannsynligvis skadelig av PolyPhen [41] , skadelig av SIFT [42] og sykdomsfremkallende av MutationTaster [43] (vist i fig. 1b). Denne varianten er tilstede en gang i en heterozygot tilstand blant 251 436 alleler i gnomAD (allelfrekvens 4 × 10−6) [44] og en gang i en heterozygot tilstand blant 21 366 alleler i ALFA-prosjektet (www.ncbi.nlm. nih.gov/ snp/docs/gsr/alfa/; allelfrekvens 5 × 10−5). Den er oppført i dbSNP som rs769995865 og har ikke blitt rapportert i ClinVar. Arginin i menneskelig posisjon 431 er fullstendig bevart blant 100 virveldyr (http://genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=hg19&g=multiz100way, med unntak av hest, som ingen sekvens er tilgjengelig), hos C. intestinalis (vasekappe), D. melanogaster (fruktflue) og C. elegans (nematodeorm) (vist i fig. 1c). Av 41 paraloge proteiner er arginin bevart i 17, og ingen av paralogene viser tryptofan i denne posisjonen (netttillegg Fig. 1). Funnet av en homozygot variant i sammenheng med slektskap, i kombinasjon med dens sjeldenhet i den generelle befolkningen og den evolusjonære bevaringen av den berørte resten, førte til at vi vurderte KLHL3 p.Arg431Trp-mutasjonen som en kandidat for sykdomsårsak. Varianten er lokalisert i den Kelch-lignende repetisjonen 3 (vist i fig. Id). En homozygot p.Arg431Gln-variant ved den identiske resten er tidligere beskrevet i et enkelt individ [12] (tabell 1).
Struktur analyse
Kelch-domenet (vist i fig. 2a) er sammensatt av seks "propellblader" stabilisert av hydrogenbindinger mellom bladene [45]. Tidligere simuleringsstudier av Kelch-domene-overflatemutasjoner viste redusert interaksjon med WNK4-peptidet, men fant liten forstyrrelse av Kelch-WNK4-binding ved mutasjoner i kjernen av proteinet [46]. Her brukte vi likevekts molekylær dynamikksimuleringer for å bestemme de strukturelle og dynamiske konsekvensene av R431W-kjernemutasjonen. R431W er plassert ved grensesnittet mellom det tredje (K3) og det fjerde (K4) propellbladet, plassert rett under WNK4-bindingsstedet (vist i fig. 2a). Beregning av forskjellen i gjennomsnittlige kvadratiske fluktuasjoner (et mål på varians i proteinstrukturen) mellom R431W og WT simuleringer demonstrerte reproduserbart at forstyrrelsen i proteindynamikken forårsaket av mutasjonen forplanter seg gjennom hele proteinet, med sterkt økt strukturell dynamikk ved K3– K4-grensesnittet og den omkringliggende K3–K5-regionen, men også redusert dynamikk på fjernere steder (vist i fig. 2b). Globale RMSD-beregninger indikerte en liten økning i strukturell ustabilitet for mutanten i forhold til 1.1-µs simuleringene – fokuserte RMSD-beregninger av K3–K4-grensesnittet (restene 425–465) og WNK4-bindingsstedet (restene 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 og 577), noe som tyder på en forstyrrelse av tertiær struktur i R431W-mutanten (se 2c, fig.; under).
For ytterligere kvantifisering av interaksjonen mellom K3 (restene 425–441) og K4 (restene 442–465) bladene ble antall hydrogenbindinger (h-bindinger) og COM-avstanden mellom de to gruppene beregnet. WT-grensesnittet opprettholder i gjennomsnitt syv flere hbonds enn i R431W-mutanten. R431 i seg selv deltar bare i 4–5 h-bindinger – som står for ~27 % av K3–K4 h-bindingene – noe som indikerer at R431W-mutasjonen forstyrrer hele grensesnittet (vist i fig. 2d, e). Videre viser R431W-mutanten en økt COM-avstand mellom de to underdomenene (vist i fig. 2d), som bekrefter h-bindingsanalysen.
For å vurdere effekten av mutasjonen til WNK4-binding, beregnet vi elektrostatikken til bindingslommen gjennom 1.1-µs-simuleringen. R431W-mutasjonen induserer en moderat endring i bindingslommens elektrostatikk mot negative spenninger (vist i fig. 2d). Selv om det er beskjedent, ville det reduserte positive potensialet i bindingslommen disfavorisere assosiasjonen til det negativt ladede WNK4-syremotivet.
Funksjonsanalyse
For ytterligere å studere patofysiologien assosiert med KLHL3 p.Arg431Trp, fikk vi plasmider som koder for 3x FLAG-merket humant WNK4 i pTRE2hyg-vektoren og Halo-merket humant KLHL3 i pFN21A-vektoren [47]. Vi introduserte p.Arg431Trp-mutasjonen til WT KLHL3-plasmidet ved bruk av stedsrettet mutagenese og uttrykte heterologt de tilsvarende plasmidene i COS7-celler. Ved samuttrykk av WT og mutant KLHL3 med WT WNK4, avslørte Western blots med anti-Halotag primære antistoffer WT KLHL3-bånd. Gjentatte transfeksjoner av to uavhengige KLHL3 p.Arg431Trp-kloner resulterte imidlertid i utgangspunktet ikke i detekterbare bånd (relativ intensitet normalisert av -aktinekspresjon, 0.761 ± 0.144 i WT vs. {{25 }}.0{{3{{40}}}}9 ± 0.002 i s.Arg431Trp, p < { {60}}.0001, t=12.81). Ekspresjonsnivåer av WNK4, bestemt ved anti-FLAG Western blot, var signifikant høyere i celler som samuttrykker KLHL3 p.Arg431Trp enn i celler som samtidig uttrykker WT KLHL3 (relativ intensitet normalisert av -aktinekspresjon, 0,721 ± 0,137 med WT vs. 5 ± Arg4171 med Arg4171. , s=0.005, t=3.546). Alle verdier er gitt som gjennomsnitt ± SEM, og sammenligning ble utført ved en to-halet forholdsparet t-test, df=11 (vist i fig. 3a, b). For å vurdere om KLHL3 p.Arg431Trp ble uttrykt i lavere mengder, transfekterte vi økende mengder (0, 0,5, 1, 2, 4 og 8 µg) av WT og mutante plasmider. Med 8 µg observerte vi økt dødelighet (data ikke vist), men med uttrykk av 4 µg mutant plasmid kunne vi oppdage et svakt bånd ved forventet størrelse (merk den lengre eksponeringstiden sammenlignet med WT, vist i fig. 3c). For å vurdere om redusert proteinstabilitet kan forårsake reduserte ekspresjonsnivåer av mutantproteinet, utførte vi cykloheksimid-jaktanalyser. KLHL3 p.Arg431Trp ble degradert raskere enn WT (vist i fig. 3d).
Fig. 3. A Representative Western blots av cellelysater transfektert med WNK4 og tom vektor, WT eller p.Arg431Trp (R431W) KLHL3. b Boks- og whiskerplott (Tukey) med kvantifisering av resultatene fra 12 eksperimenter, ved bruk av to uavhengige kloner av hvert plasmid. **, s=0.0046; ****, p < 0,0001 (to-tailed ratio-parede t-tester). c Representative Western blots av cellelysater transfektert med økende mengder WT eller R431W KLHL3. Legg merke til de forskjellige eksponeringstidene for WT og R431W. De nedre og øvre HaloTag-positive båndene kan reflektere henholdsvis KLHL3-monomeren og -dimeren. d Representative Western blots av celler transfektert med 2 µg WT eller 4 µg R431W KLHL3-plasmid, behandlet med cykloheksimid og lysert ved de angitte tidspunktene. Legg merke til de forskjellige eksponeringstidene. Analyse av 2 biologiske replikater med 2 tekniske replikater hver viser redusert stabilitet av mutant protein, normalisert til beta-aktin og tidspunkt 0 timer (gjennomsnitt ± SD). Etter 12 timer er betydelig mindre R431W enn WT-protein tilstede (Mann-Whitney test, *, p=0.029).
Diskusjon/Konklusjon
I en alder av 58 år ble pasienten som ble rapportert her diagnostisert senere i livet enn noen av de tidligere rapporterte tilfellene med recessiv KLHL3-mutasjon. Den eldste pasienten rapportert i litteraturen ble diagnostisert i en alder av 56 år [15]. Men retrospektivt hadde hypertensjon og hyperkalemi vært tilstede hos vår pasient i flere år. Den karakteristiske hyperkalemiske metabolske acidosen assosiert med PHA II hadde sannsynligvis blitt maskert ved administrering av et tiaziddiuretikum. Seponering av hydroklortiazid etter hjerteinfarkt var den sannsynlige årsaken til massiv hyperkalemisk acidose assosiert med muskelsmerter og hypertensjon som til slutt førte til diagnosen PHA II. Vi foreslår derfor at tilstedeværelsen av hyperkalemisk metabolsk acidose som er utilstrekkelig for nyrefunksjonen i kombinasjon med undertrykt renin bør øke mistanken om PHA II selv hos pasienter over 50 år. Diagnosen PHA II kan kompliseres av effektene av allerede eksisterende behandling med antihypertensive medisiner som påvirker renin-angiotensin-aldosteron-systemet og kan føre til falskt forhøyede eller lave renin- og/eller aldosteronverdier [48, 49]. Hyperkalemi til tross for normal glomerulær filtrasjonshastighet beskrives ofte som et karakteristisk trekk ved PHA II [6]. Selv om dette kan være karakteristisk hos barn, kan hos voksne, som hos pasienten rapportert her, langvarig hypertensjon, nefrolithiasis og tilbakevendende urinveisinfeksjoner føre til nedsatt nyrefunksjon, som tidligere rapportert hos en pasient med en heterozygot mutasjon [14]. Nephrolithiasis som hos vår pasient er beskrevet i PHA II [50], men er ikke et vanlig funn. Interessant nok var ikke kalsium: kreatinin-ratio i urinen forhøyet hos vår pasient (0,17 og<0.06 mmol/mmol creatinine, respectively), contrary to observations in large kindred with the WNK4 mutation and average urinary calcium of 0.85 ± 0.27 mmol/mmol creatinine [51]. Severe target-organ damage in our patient, including myocardial infarctions and CKD, emphasizes the need for early diagnosis and adequate therapy of PHA II, although hypertension and target-organ damage in our patient's parents may also point to a genetic risk independent of the homozygous PHA II mutation. To prevent delayed diagnosis, after more common causes, such as primary aldosteronism, have been excluded, genetic testing for Mendelian forms of hypertension should be considered by practitioners when patients present with low-renin hypertension in the presence of hormonal and/or electrolyte abnormalities.
Prøver fra pasientens familie var ikke tilgjengelige for analyse; i sammenheng med slektskap er det imidlertid høyst sannsynlig at begge foreldrene var heterozygote bærere av p.Arg431Trp-mutasjonen. Detaljert informasjon om pasientens avdøde bror var ikke tilgjengelig. Det kan tenkes at han også led av PHA II, noe som resulterte i CKD som til slutt var dødelig.
Det er mulig at p.Arg431Trp-mutasjonen observert hos vår pasient forhindrer Kelch-domenet i å folde seg, i samsvar med den reduserte strukturelle stabiliteten til det muterte domenet observert i simuleringene våre, der sidekjedesubstitusjonen ble satt inn i det allerede foldede proteinet. Følgelig indikerte Western blot-analyse signifikant reduserte ekspresjonsnivåer av p.Arg431Trp KLHL3 (vist i fig. 3a-c). Cykloheksimid (en inhibitor av proteinbiosyntese) chase-analysen demonstrerte ytterligere redusert proteinstabilitet av p.Arg431Trp KLHL3 (vist i fig. 3d), lik tidligere observasjoner i p.Ser410Leu-varianten [52]. Disse dataene indikerer at den primære konsekvensen av p.Arg431Trp-mutasjonen er å destabilisere den foldede tilstanden til proteinet, mens reduserte interaksjoner av foldet KLHL3 med WNK4 på det meste er en sekundær effekt. I alle fall reduserer lavere nivåer av KLHL3 WNK ubiquitinylering, noe som resulterer i høyere WNK4-overflod (vist i fig. 3) og antas å forårsake høyere NCCT-fosforylering, samt lavere kaliumsekresjon via ROMK, noe som forklarer den underliggende patofysiologien.
Anerkjennelser
Vi takker Dr. Shinichi Uchida (Tokyo Medical and Dental University) for vennlig å gi pTRE2hyg WNK4 og pFN21A KLHL3 plasmidene, Iana Lukianova for støtte med Western blot-eksperimenter, og Gabriel Stölting for nyttige diskusjoner.
Etikkerklæring
Forskningsprotokollen ble godkjent av den etiske komité ved det medisinske fakultet, Heinrich Heine University Düsseldorf (studienummer 4330), og skriftlig informert samtykke i samsvar med Helsingfors-erklæringen ble innhentet fra forskningsdeltakeren for forskningsstudien og publisering av denne case-rapporten .
Erklæring om interessekonflikt
AE, NH, BGH, JPM og TM har ingen interessekonflikter å erklære. LCR mottok personlige honorarer for konsulentvirksomhet og taleoppdrag fra Astellas, Baxter, Bayer-Vital, Boehringer, Fresenius, Medtronic, Novartis og Recor, uten relevans for papiret. UIS er oppført som en oppfinner på patentene US 10 696 739 og 16/614 401, uten relevans for papiret.
Finansieringskilder
Denne studien ble finansiert av Ministerium für Kultur und Wissenschaft der Landes Nordrhein-Westfalen (Rückkehrprogramm), Stiftung Charité (BIH_PRO_406) og den tyske forskningsstiftelsen (DFG, SCHO 1386/{ {4}}; prosjekt-ID 431984000, CRC 1453), alt til UIS Det ble finansiert av Deutsche Forschungsge meinschaft (German Research Foundation) til JPM (MA 7525/2- 1, som en del av forskningsenheten FOR 5046 , prosjekt P2) og ved et stipend fra det tverrfaglige senteret for klinisk forskning ved det medisinske fakultetet ved RWTH Aachen University (IZKF TN1- 3/IA532003). Forfatterne er takknemlig for datatiden som ble gitt gjennom JARA på superdatamaskinen JURECA ved Forschungszentrum Jülich. Finansieringsbyråer hadde ingen rolle i utarbeidelsen av manuskriptet.
Referanser
1 Samarbeid NCDRF. Verdensomspennende trender i blodtrykk fra 1975 til 2015: en samlet analyse av 1479 befolkningsbaserte målestudier med 19,1 millioner deltakere. Lancet. 7. januar 2017;389(10064):37– 55.
2 Oparil S, Acelajado MC, Bakris GL, Berlowitz DR, Cifkova R, Dominiczak AF, et al. Hypertensjon. Nat Rev Dis Primere. 22. mars 2018; 4: 18014.
3 Rimoldi SF, Scherrer U, Messerli FH. Sekundær arteriell hypertensjon: når, hvem og hvordan screenes? Eur Heart J. 2014 May;35(19): 1245–54.
4 Athimulam S, Lazik N, Bancos I. Lav-renin hypertensjon. Endocrinol Metab Clin North Am. 2019 Des;48(4):701–15.
5 Bao M, Li P, Li Q, Chen H, Zhong Y, Li S, et al. Genetisk screening for monogen hypertensjon hos hypertensive individer i en klinisk setting. J Med Genet. 2020 aug;57(8):571–80.
6 Healy JK. Pseudohypoaldosteronisme type II: historie, argumenter, svar og fortsatt noen spørsmål. Hypertensjon. 2014 apr;63(4): 648–54.
7 Paver WK, Pauline GJ. Hypertensjon og hyperpotassemi uten nyresykdom hos en ung mann. Med J Aust. 22. august 1964; 2:305– 6.
8 Stokes GS, Gentle JL, Edwards KD, Stewart JH. Syndrom av idiopatisk hyperkalemi og hypertensjon med redusert plasmareninaktivitet: effekter på plasmarenin og aldosteron ved å redusere serumkaliumnivået. Med J Aust. 1968 7. desember;2(23):1050–4.
9 Arnold JE, Healy JK. Hyperkalemi, hypertensjon og systemisk acidose uten nyresvikt er assosiert med en tubulær defekt i kaliumutskillelsen. Am J Med. 1969 sep;47(3): 461–72.
10 Gordon RD, Geddes RA, Pawsey CG, O'Halloran MW. Hypertensjon og alvorlig hyperkalemi er assosiert med undertrykkelse av renin og aldosteron og reverseres fullstendig av natriumrestriksjoner i kosten. Australas Ann Med. 1970 Nov;19(4):287–94.
Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tlf:+86 15292862950
Handle for flere spesifikasjoner:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
