Et nytt netrin-1-avledet peptid forbedrer beskyttelsen mot nevronal død og lindrer intracerebral blødning i mus, del 1

Abstrakt:

Det er rapportert at Netrin-1 er involvert i nevrobeskyttelse etter skade på sentralnervesystemet. Det minimale funksjonelle domenet til Netrin-1 som kan bevare nevrobeskyttelsen, men unngå de store bivirkningene av Netrin, forblir imidlertid unnvikende.

Sentralnervesystemet er et av de viktigste nervesystemene i menneskekroppen, som styrer folks tenkning, følelser og handlinger. Når sentralnervesystemet er skadet, vil også folks hukommelse bli påvirket. Men ikke bekymre deg, vi kan ta noen positive måter å hjelpe til med å gjenopprette hukommelsen.

Først må du forstå virkningen av minneskade. Skader på sentralnervesystemet kan påvirke folks kognitive evner, tenkeprosesser og oppmerksomhet, som alle direkte påvirker folks hukommelse. I tillegg kan skade på sentralnervesystemet også forårsake følelsesmessig ustabilitet, noe som gjør folk mer utsatt for panikk, angst og depresjon, og dermed påvirke gjenopprettingen av hukommelsen.

Men selv om skade på sentralnervesystemet kan gi noen negative effekter, kan vi ta noen positive tiltak for å fremme minnegjenoppretting. Først kan vi prøve litt kognitiv trening, som å lese, skrive og løse gåter. Disse aktivitetene kan stimulere hjernen til å produsere nye nevroner og hjelpe hjernen med å bygge nye minner og måter å tenke på.

For det andre kan vi også fremme minnegjenoppretting gjennom litt fysisk trening. Studier har vist at riktig trening kan stimulere hjernen til å produsere nye nevroner og nevronale forbindelser og fremme hjernens prosessering av ny informasjon. Dette er grunnen til at noen plutselig kommer på en god idé eller løser et vanskelig problem mens de løper eller går.

Til slutt må vi ta hensyn til rollen til riktig ernæringsinntak på hukommelsen. Den normale funksjonen til hjernen krever noen nødvendige næringsstoffer, som protein, vitaminer og sporstoffer. Hvis maten vår mangler disse næringsstoffene, vil det påvirke hukommelsen og tenkeevnen vår. Derfor bør vi velge mat som er rik på disse næringsstoffene i kostholdet vårt, som fisk, magert kjøtt, grønnsaker og frukt.

Kort sagt vil skade på sentralnervesystemet ha en viss innvirkning på folks hukommelse, men vi kan fremme hukommelsesgjenoppretting gjennom riktig kognitiv trening, fysisk trening og kostholdskontroll. Jeg håper alle kan møte utfordringene i livet positivt, opprettholde en optimistisk holdning og strebe etter å gjenopprette et sunt sentralnervesystem og god hukommelse. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche kan forbedre hukommelsen betydelig fordi Cistanche er en tradisjonell kinesisk medisin med mange unike effekter, hvorav en er å forbedre hukommelsen. Effekten av Cistanche kommer fra de ulike aktive ingrediensene den inneholder, inkludert garvesyre, polysakkarider, flavonoidglykosider, etc., som kan fremme hjernens helse på mange måter.

Klikk på Know for å forbedre korttidshukommelsen

Her undersøkte vi den nevroprotektive effekten av et peptid E1 avledet fra Netrins EGF3-domene (rester 407–422). Vi fant at det interagerer med slettet kolorektalt karsinom (DCC) for å aktivere fokal adhesjonskinasefosforylering som viser nevrobeskyttelse.

Administreringen av peptidet E1 var i stand til å forbedre funksjonell utvinning gjennom redusert apoptose i en eksperimentell murin modell av intracerebral blødning (ICH).

Oppsummert avslører vi en funksjonell sekvens av Netrin-1 som er involvert i gjenopprettingsprosessen etter ICH og identifiserer et kandidatpeptid for behandling av ICH.

Nøkkelord: intracerebral blødning; hemin; nevrobeskyttelse; Netrin-1; peptid.

1. Introduksjon

Intracerebral blødning (ICH) er en ødeleggende slagsubtype med høy dødelighet og sykelighet [1–3] som involverer unormal ruptur av cerebrale blodårer i hjernen [4,5].

Kirurgisk fjerning av hematomer er foretrukket for å oppnå hemostase og lindre intrakranielt trykk [6]. Imidlertid kan gjenværende hematiske rester og blodnedbrytningsprodukter fortsatt fremme sekundær hjerneskade etter ICH, indusere nevronal skade og forsinke funksjonell utvinning [7–9].

Utviklingen av effektive strategier rettet mot sekundær hjerneskade-indusert nevronal skade vil derfor være gunstig for slagbehandling. Netrin-1 er et av de mest godt studerte proteinene som regulerer aksonal veiledning og synaptogenese [10–12] via interaksjon med reseptorene. slettet i kolorektal kreft (DCC) og UNC5H (ukoordinert-5 homolog) for å aktivere celleoverlevelse, differensiering og spredning [13–15].

Reseptorene induserer et dødssignal for å mediere apoptose når Netrin-1 er fraværende [16]. Det er kjent at bindingen av Netrin-1 med DCC resulterer i dimerisering av DCC og initierer tyrosin 861-fosforylering av fokal adhesjonkinase (FAK) for å indusere neurittutvekst og aksonal veiledning [17,18].

Bindingen av Netrin-1 med DCC involverer EGF3-domenet til Netrin-1 og FN5-domenet til DCC i aktiveringen av Netrin-1-signalveien [19,20]. Nylig ble Netrin-1 vist å utøve neurobeskyttende effekter i iskemiske områder [21].

Serumets ekspresjonsnivå av Netrin-1, som hemmer celleapoptose og fremmer nevronal regenerering, er positivt korrelert med pasientens restitusjon etter iskemisk hjerneslag [22,23].

Interessant nok initierer transplantasjon av benmargsmesenkymale stamceller som utskiller Netrin-1 inn i den skadede isjiasnerven hos rotter aksonal regenerering [24] og reduserer motorneurondød [25]. Stereotaksisk injeksjon av Netrin-1-proteinet i ventriklene reduserer nervecelledød etter subaraknoidalblødning gjennom aktivering av DCC/APPL1/AKT-signalering [26].

Et polypeptid avledet fra EGF3-domenet til Netrin-1 (aminosyrer 423–433) aktiverer ERK-fosforylering markant og fremmer produksjonen av NO, som har kardiobeskyttende effekter [27,28]. Imidlertid har Netrin-1 blitt identifisert som en potensiell biomarkør for tumorigenese [29–31] fordi regulering av Netrin-1-statusen funnet i flere vevsavledede kreftformer [32].

Når Netrin-1 er bundet til sin reseptor DCC eller Unc5H, transduserer reseptorene et positivt signal som fører til overlevelse, betennelse, angiogenese og anti-apoptose, som igjen regulerer tumorgenese [31].

Derfor er det svært viktig å identifisere det minimale funksjonelle domenet til Netrin-1 som kan bevare nevrobeskyttelsen og unngå de store bivirkningene av Netrin-1. Her fant vi at peptid E1 (rester 407–422), som er avledet fra EGF3-domenet til Netrin-1, interagerer med DCC for å beskytte nevroner mot heminindusert toksisitet.

I en eksperimentell modell av ICH-mus forbedret anvendelsen av peptid E1 funksjonell utvinning, bestemt ved atferdsanalyser. Videre kan peptid E1 forhindre at nevroner degenererer etter ICH.

Basert på disse resultatene identifiserte vi en funksjonssekvens av Netrin-1 som er involvert i utvinning etter ICH, og bestemte at dette peptidet kan brukes til behandling av ICH.

2. Resultater

2.1. EGF3-domene er kritisk for Netrin-DCC-interaksjonen

Netrin-1 består av et VI-domene, tre EGF-repetisjoner og et C-terminalt domene [33]. Krystallstrukturen til det menneskelige Netrin-1/DCC-komplekset avslører at Netrin-1 EGF3-domenet er avgjørende for Netrin-1/DCC-interaksjonen, men ikke EGF1- og EGF2-domenene [34].

Mutagenese av nøkkelaminosyrerester (His407, Gln442 eller Gln443) ved EGF3-domenet forstyrret Netrin-1/DCC-bindingen fullstendig [19]. EGF1/2-domener kreves for å bytte attraktiv signalering til frastøtende signalering når Unc5 eksisterer sammen med DCC [20].

Derfor genererte vi først full-lengde og EGF3-slettede (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1-konstruksjoner (Figur 1A) og uttrykte disse konstruksjonene forbigående i dyrkede HEK293T-celler for GSTpulldown .

Binding ble observert for konstruksjonene som uttrykte Netrin-1 men ikke Netrin-1(∆407–443) (Figur 1C). Disse resultatene tyder på at domenet til EGF3-inneholdende aminosyrer 407–443 er ansvarlig for interaksjonen av Netrin-1 med DCC. For å undersøke rollen til EGF3-domenet i Netrin-DCC, renset vi først myc-taggedNetrin{{12 }} eller avkortet Netrin-1 (∆407–443) (Figur 1B).

Deretter ble HEK293T-celler transfektert med et plasmid som bærer DCC cDNA og inkubert med Netrin-1-protein, og deretter ble Netrin-1-binding vurdert ved immunfarging.

Vi fant at Netrin-1 i full lengde, men ikke avkortet Netrin-1, var i stand til å binde seg til DCC ved plasmamembranen (figur 1D). For å bestemme om EGF3-domenet kan samhandle med DCC, genererte vi en GST-EGF3-konstruksjon for å trekke ned lyserte celler som overuttrykker DCC. Vi observerte spesifikk binding av DCC med GST-EGF3 (figur 1E).

Videre syntetiserte vi det FITC-merkede peptidetEGF3 og bekreftet at det, i likhet med full-lengde Netrin -1, var i stand til å binde seg til DCC ved plasmamembranen (figur 1F). Samlet indikerer dataene våre at EGF3-domenet er ansvarlig for samspillet mellom Netrin-1 og DCC.

2.2. EGF3-domenet induserer fosforylering av nedstrøms veier til Netrin-1

Samspillet mellom Netrin-1 og DCC aktiverer flere signalveier, inkludertFAK, SFK og ERK [16,35]. Focal adhesion kinase (FAK) er en av de viktigste tyrosinfosforyleringsaktivitetene knyttet til Netrin-1/DCC-signalering.

Netrin-1 aktiverer fosforylering av FAK-fosforylering og Src-familieproteintyrosinkinaser (SFK-er) [17]. BådeFAK og SFK signalveier spiller en sentral rolle i utviklingsstadiet av nervesystemet og skadereparasjon [36,37]. Dessuten kan Netrin-1 aktivere den ekstracellulære signalregulerte kinasen-1/2 (ERK1/2), som medierer virkningen av den Mitogen-aktiverte proteinkinase (MAPK)-banen [38–40].

For å undersøke om EGF3-domenet er kritisk for aktiveringen av nedstrøms signalveier via bindingen av Netrin-1 til DCC, undersøkte vi først effekten av EGF3-domenet på tyrosin 861-fosforyleringen av FAK (Figur 2A) . Vi fant at sletting av EGF3 hemmet FAK-fosforylering i dyrkede kortikale nevroner (figur 2B, C), og bekrefter dermed en viktig rolle for EGF3 i Netrin-1-signalveien.

Deretter ble dyrkede kortikale nevroner stimulert med GST-EGF3-fusjonsproteinet i 20 minutter, og western blotting bekreftet ytterligere at behandling med GST-EGF3-fusjonsproteinet induserte FAK-, ERK- og SFK-fosforylering (figur 2D-G).

Disse resultatene tyder på at EGF3-domenet til Netrin-1 fungerer som en potentstimulator for å aktivere nedstrøms signalveier.

Figur 1. EGF3-domenet til Netrin-1 er den kritiske regionen for Netrin-1/DCC-interaksjon. (A) Illustrasjoner av Netrin-1konstruksjoner. Netrin-1-konstruksjonene er Netrin-1 i full lengde, Netrin-1-(∆407–443) og GST-EGF3. (B) Renset Netrin-1-(∆407–443)-Myc/His ble kvantifisert gjennom en sammenligning med BSA-standardkurven. (C) Immunblotting av pull-down-fraksjonen av GST-DCC FN5 domenefusjonsproteinet og GST alene. (D) Immunfluorescensbilder av Flag-DCC som uttrykker 293T-celler inkubert med kontrollmedium, Netrin-1-myc/his og Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his i henholdsvis 30 minutter og den kvantitative analyse. Målestokk, 10 µm. (E) Immunoblotting av nedtrekksfraksjonen av GST-EGF3-fusjonsproteinet og GST sammen. (F) Immunofluorescensbilder av Flag-DCC som uttrykker 293T-celler inkubert med kontrollmedium og FITC-merket Pep EGF3 i henholdsvis 30 minutter, og den kvantitative analysen. Målestokk, 10 µm.

Figur 2. EGF3-domene aktiverer nedstrømsveier til Netrin-1. (A) Eksperimentell prosedyre. (B) Kortikale nevroner (E17 og DIV3) ble stimulert med Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) eller kontrollmedium i 20 min. Cellelysater ble inkubert med et anti-p-FAK-861-antistoff for å bekrefte Netrin-1-aktivitet. (C) Kvantitativ analyse av Western blot-resultatene er vist i (B). n=3. (D) Kortikale nevroner (DIV3) ble behandlet med 1,5 µM GST (+), 1,5 µM GST-EGF3 fusjonsprotein (+), eller 1,5 µMNetrin-1 (+) medium i 20 min. Cellelysater ble inkubert med anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 og anti-p-ERK-202/204.(E–G) Kvantitativ analyse av western blot-resultater vist i (D). n=3. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Enveis ANOVA ble brukt for alle statistiske analyser vist i denne figuren (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, ikke signifikant). Detaljer om dataanalyse er sett i tilleggstabell S1.

2.3-peptid E1 og E2 samhandler med DCC for å aktivere nedstrøms signalveien til Netrin-1

Som tidligere beskrevet, induserte et lite peptid avledet fra EGF3-domenet til Netrin-1(aminosyrene 423–433) ERK-fosforylering [27]. Vi syntetiserte peptider E1 (restene 407–422) og E2 (restene 423–433) som ble avledet fra EGF3-domenet til Netrin -1 (Figur 3A).

Vi fant at inkubering av peptid E1 økte nivåene av fosforylert FAK og SFK (Figur 3B, D, E) i kulturcellene på en doseavhengig måte, men endret ikke nivåene av fosforylert ERK (Figur 3B, F).

I motsetning til peptidE1, induserte peptid E2 ikke bare tyrosinfosforyleringen av FAK (Figur 3C, G) og tyrosinfosforyleringen av SFK (Figur 3C, H), men induserte også tyrosinfosforyleringen av ERK (Figur 3C, I).

Kontrollpeptidet (Pep Ctrl) hadde ingen påvisbar effekt på tyrosinfosforyleringen av FAK, SFK og ERK (Figur S1). Videre observerte vi at fosforyleringen av komponenter i FAK-signalveien indusert av peptid E1 var tidsavhengig (Figur). S2). Disse resultatene indikerer at E1 og E2 er de minimale funksjonelle peptidene til Netrin-1.

Figur 3. De minimale sekvensene til EGF3-domenet aktiverer nedstrømsveier til Netrin-1. (A) Illustrasjoner av peptidene. (B) Kortikale nevroner (DIV3) ble stimulert med gradientkonsentrasjoner av peptid E1. Cellelysater ble inkubert med anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 og anti-p-ERK-202/204. (C) Dyrkede kortikale nevroner ble behandlet med gradientkonsentrasjoner av peptid E2.

Lysater ble samlet og inkubert med de angitte antistoffene for å måle fosforyleringen av FAK, SFK og ERK. (D–F) Kvantifisering av omfanget av FAK-, SFK- og ERK-fosforylering indusert av peptid E1 i nevroner er vist i (B). n=3. (G–I) Kvantifisering av omfanget av FAK-, SFK- og ERK-fosforylering indusert av peptid E2 er vist i (C). n=3. (J) Kortikale nevroner avledet fra DCC villtype og homozygote mutantembryoer ble stimulert med Netrin-1 eller Netrin-1--avledede peptider og ble lysert.

De resulterende lysatene ble utsatt for immunblotting. (K) Kvantifisering av FAK PY{{0}}- og DCC-nivåer i DCC-mutante nevroner er vist i (J). n=3. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Enveis ANOVA ble brukt for alle statistiske analyser vist i denne figuren (* p < 0,05;ns, ikke signifikant). Detaljer om dataanalyse er sett i tilleggstabell S1.

For å bestemme om aktiveringen av FAK-signalveien er DCC-avhengig, målte vi omfanget av tyrosinfosforylering av FAK indusert av disse peptidene i DCC+/+ og DCC−/− nevroner. Vi fant at begge peptidene E1 og E2 ikke klarte å indusere fosforyleringen av FAK i DCC-/- nevroner (figur 3J, K).

Vi fant også at syntetiserte N-terminalt flaggmerkede peptider E1 og E2 (Flag-E1 og Flag-E2) binder direkte til DCCFN5-domenet (figur S3).

2.4. Peptid E1 beskytter nevroner fra hemin-indusert celledød in vitro

For å vise beskyttelsen mot nevronal skade av peptid E1, brukte vi aHemin-induserbar toksisitetsreaksjon for å etterligne sekundær hjerneskade etter intracerebral blødning [41,42].

Dyrkede GnRH-uttrykkende nevronceller (NLT) [43–45] ble inkubert med hemin i forskjellige konsentrasjoner og varigheter. Inkubering av NLT-celler med hemin ved den mediale dødelige dosen (60 µM) resulterte i en tidsavhengig reduksjon i cellens overlevelsesrate, noe som tyder på at hemin ble tatt opp av nevroner og metabolisert (Figur S4).

For å undersøke om ekspresjonen av Netrin-1 og DCC reagerte på heminindusert nevronal celledød, ble dyrkede NLT-celler inkubert med hemin i forskjellige varigheter. Western blot-resultatene viste at ekspresjonsnivåene til Netrin -1 og DCC ble økt betydelig 6 timer etter hemininkubasjon og deretter avtok gradvis (Figur 4A, B).

For å undersøke om peptidene E1 og E2 var i stand til å dempe hemin-indusert nevronal død, utførte vi en CCK-8-analyse med Netrin-1, PepCtrl, peptid E1 og peptid E2.

Vi fant at disse peptidene ikke hadde noen påvisbar effekt på cellelevedyktighet (figur 4C og figur S5). Sammenlignet med inkubering med Pep Ctrl og peptidE2, forbedret peptid E1 og Netrin-1 nevronal død indusert av hemin (Figur 4D). Vi farget også med calcein-AM og PI for å skille levende og døde celler.

Resultatene viste at både Netrin-1 og peptid E1 beskyttet mot hemin-indusert død in vitro (figur 4E–G). Videre lindret 1,5 µM peptid E1 hemin-indusert død i primærdyrkede nevroner (figur 4H, I). Til sammen viste disse resultatene at peptid E1 beskytter nevroner mot hemin-indusert celledød.

2.5. Netrin-1-Avledet peptid E1 fremmer funksjonell gjenoppretting etter ICH

For å undersøke om peptid E1 avledet fra Netrin-1 spiller en viktig rolle i funksjonell utvinning etter blødningsslag, etablerte vi en eksperimentell ICH-modellinmus ved å injisere kollagenase blandet med blekk inn i striatum (Figur S6A).

Etter tre dager ble bilder av hjerneskiven vist for å spore injeksjonsposisjonen og kollagenasevolumet med blekk (Figur S6B, C). Mus med striatal blødning viste svakhet på den ipsilaterale siden på grunn av hjerneskade (Figur S7A–C).

Hematom i striatum etter ICH var synlig sammenlignet med injeksjon av saltvann (figur S7D). De relative proteinnivåene av Netrin-1 og DCC i den perihematomale cortex ble økt i ICH-mus sammenlignet med kontrollmus på dag 2, og Netrin-1 var fortsatt signifikant høyere på dag 3, noe som indikerer at Netrin-1 er viktig for utvinning av hjerneskade (Figur S7E, F).

Deretter ble FITC-merket TAT-peptid E1 (FITC-Pep TE1), som la til en TAT-sekvens av N-terminalen til peptid E1, injisert i ICH-musene og FITC-Pep TE1 ble vist å krysse blod-hjerne-barrieren ( Figur S8).

ICH og kontrollmusene ble injisert intraperitonealt med peptidet (12 mg/kg) daglig eller et likt volum saltvann (figur 5A). Vi fant at administrering med peptid TE1 forbedret overlevelsesraten og reddet defekter i kroppsvekt etter ICH (Figur 5B, C).

Vi fant også kollagenasevolum sporet med et likt forhold mellom blekk i hver gruppe var likt, noe som bekrefter at denne standardICH-modellen av kollagenase resulterte i reproduserbare intrastriatale hematomer (Figur 5D). Peptid TE1 forbedret atferdsskårene til ICH-musene i teipfjerningstesten (Figur 5E). ) og sylindertest (Figur 5F).

Som forventet reduserte peptid TE1 infarktvolumet etter ICH (Figur 5G, H). Til sammen antyder disse resultatene at peptid E1 var i stand til å redusere hematomvolumet og forbedre funksjonell utvinning i en musemodell av ICH.

Figur 4. Peptid E1 forbedrer hemin-indusert celledød in vitro. (A) Western blot av Netrin-1 og DCC i dyrkede NLT-celler eksponert for Hemin (60 µM). (B) Kvantitativ analyse av Western blot-resultatene er vist i (A). n=3. (C) CCK-8-analyser viste at seriepeptider ikke endret celleviabilitet. n=4. (D) 1,5 µM Pep E1 bevarte NLT-cellelevedyktighet når det ble tilsatt godt etter eksponering for hemin (60 µM). n=4. (E) Levende (grønn)/død (rød) analyse av NLT-celler eksponert for hemin (60 µM,6 timer). Målestokk, 50 µm. (F, G) Kvantitativ analyse av levende/død-analysen i (E). n=9. (H) CCK-8analyser viste at Pep E1 kunne redusere heminindusert celledød i primærkulturneuroner. n=8.(I) Levende/død analyseavbildning av primærkulturneuroner (50 µM, 6 timer). Målestokk, 50 µm. Data presenteres som middel ± SEM. Enveis ANOVA eller Toveis ANOVA ble brukt for alle statistiske analyser vist i denne figuren (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, ikke signifikant). Detaljer om dataanalyse er sett i tilleggstabell S1.

Figur 5. Netrin-1--avledet peptid E1 fremmer utvinningsprosessen etter ICH. (A) Skjematisk av det eksperimentelle paradigmoet for intraperitoneal (IP) injeksjon av peptid TE1 i ICH-modellering av mus. (B) Overlevelsesforholdet etter ICH for hver gruppe ble registrert, og Kaplan-Meier-metoden ble brukt. n=10. (C) Kroppsvekten endres 5 dager etter ICH. n=6.(D) Collage/saltvannblanding med et likt forhold mellom blekk (totalt 0,6 µL) injisert i striatumet til C57-mus, representative bilder som viser blekkområdet var likt hos mus behandlet med/ uten peptid TE1 5 dager etter ICH. (E, F) IP-injeksjon av peptid TE1 (12 mg/kg) men ikke TAT (12 mg/kg) kontroll, forbedret oppførsel som overvåkes av en tapefjerningsoppgave (E) eller en hjørneoppgave (F).

saltvann,n=10 individuelle dyr; ICH, n=6 individuelle dyr; ICH + TAT, n=6 individuelle dyr; ICH + TE1, n=8 individuelle dyr. (G) Representative hematoxylin og eosin-fargede seksjoner i mus behandlet med/uten peptid TE 1 5 dager etterICH. Målestokk, 1 mm. (H) Kvantifisering av blødningsvolum i hjerneseksjoner vist i (G).

saltvann, n {{0}} individuelle dyr; ICH, n=6 individuelle dyr; ICH + TAT, n=6 individuelle dyr; ICH + TE1, n=8 individuelle dyr. Data presenteres som middel ± SEM. Enveis ANOVA eller Toveis ANOVA ble brukt for alle statistiske analyser vist i denne figuren (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, ikke vesentlig). Detaljer om dataanalyse er sett i tilleggstabell S1.

2.6. Netrin-1-avledet peptid E1 reduserer nevronal apoptose etter ICH

Å utforske de underliggende mekanismene til peptid E1 i prosessen med funksjonell utvinning av ICH. Vi oppdaget nevronal degenerasjon i den perihematomale regionen ved fluoro-jade C (FJC) farging.

Vi fant at administrering av peptid TE1 betydelig reduserte antallet FJC-positive celler i perihematom-regioner, noe som indikerer at pep TE1 hemmet nevronal degenerasjon etter ICH (Figur 6A, B). Vi utførte TUNEL-farging og fant at peptid TE1 signifikant reduserte antallet TUNEL-positive nevroner (Figur 6C, D).

Antall TUNEL-positive astrocytter var ikke påvisbar endring etter peptid TE1-behandling (figur 6E, F). I tillegg, ved å bruke FITC-merket 4 kDa dekstran som atracer for å indikere permeabiliteten til blod-hjerne-barrieren (BBB), fant vi at peptid TE1 ikke påvirket gjenvinningen av BBB-permeabilitet (Figur S9A, B).

Nivåene av råfluorescensenheter (RFU) i serum var like, noe som bekrefter tilstedeværelsen av injisert sporstoff i alle dyrene som ble analysert (figur S9C). Vi brukte også fluorescein-merket lektin for å merke mikrokar, men klarte ikke å observere noen forbedring etter TE1-behandling (Figur S9D, E). Fremfor alt tyder disse funnene på at peptidet E1 fremmer nevronal utvinning etter ICH ved å hemme nevronal apoptose.

Figur 6. Netrin-1--avledet peptid E1 kan beskytte mot nevronal død og degenerasjon, men ikke astrocytter etter ICH.(A) Representative Fluoro-jade C-fargede seksjoner hos mus behandlet med/uten TE1 5 dager etter ICH. Målestokk, henholdsvis 50 µm og 10 µm. (B) Kvantifisering av Fluoro-jade C-positive celler i den perihematomale regionen (n=4). (C) TUNEL-farging som viser effekter av TE1 på sekundær hjerneskade (SBI) 5 dager etter ICH-debut. Representative bilder fra grupper med saltvann, ICH, ICH + TAT og ICH + TE1.

Hver gruppe ble utsatt for ICH bortsett fra saltvannsgruppen. Målestokk, henholdsvis 50 µm og 10 µm. (D) Kvantitative analyser for prosentandelen av TUNEL-positive nevroner er vist i (C). n=4. (E)Kolokalisering av TUNEL med GFAP 5 dager etter ICH. Representative bilder fra gruppene Saline, ICH, ICH + TAT og ICH + TE1. Målestokk, henholdsvis 50 µm og 10 µm. (F) Kvantitative analyser for prosentandelen av TUNEL-positive astrocytter er vist i (E). n=4. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM.

Enveis ANOVA ble brukt for alle statistiske analyser vist i denne figuren (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001; Detaljer om dataanalyse er vist i tilleggstabell S1.

3. Diskusjon

Studien vår identifiserte en kjernepeptidsekvens av Netrin-1 som er avgjørende for funksjonell utvinning etter ICH. Ved å samhandle med DCC, beskytter dette Netrin--1--avledede peptidet mot nevronal død på grunn av sekundær skade etter ICH og er dermed en lovende behandling for ICH.

Den terapeutiske anvendelsen av Netrin-1, et protein med høy molekylvekt, krever identifisering av den minimale funksjonelle sekvensen til Netrin-1 som fremmer nedstrømssignalering. I vår studie ble peptidene E1 (restene 407–422) og E2 (restene 423–433), som er avledet fra henholdsvis EGF3-domenet til Netrin-1, generert. Vi fant at peptid E1 (rester 407–422) beskyttet mot nevronal død etter ICH.

Vi fant at Netrin-1- og DCC-ekspresjonsnivåene ble økt i NLT-celler etterheminbehandling. Hemin frigjøres fra hemoglobin etter ICH og induserer sekundær skade på både glia- og nevronceller [46–48].

I tillegg observerte vi økte proteinnivåer av Netrin-1 og DCC etter eksperimentell ICH. I tillegg observerte vi også økte proteinnivåer av netrin-1 og DCC etter eksperimentell ICH.

Disse resultatene stemmer overens med tidligere resultater som viser at netrin-1 spiller en viktig rolle i gjenoppretting etter ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com