En ny skjerm for uttrykksregulatorer av det telomere proteinet TRF2 identifiserte små molekyler som svekker TRF2-avhengig immunsuppresjon og svulstvekst
Oct 10, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Enkel oppsummering:Det telomere proteinet TRF2 (Telomerisk gjentatt bindingsfaktor 2) er oppregulert i humane kreftformer og assosiert med dårlig prognose. TRF2 onkogene egenskaper er avhengige av dens iboende telomerbeskyttende rolle, men også på celleekstrinsiske effekter gjennom immunsuppressive og angiogene aktiviteter. Derfor fremstår målretting mot TRF2 som en lovende terapeutisk anti-kreftstrategi. I denne studien utviklet vi en cellebasert metode for å screene for TRF2-hemmere som lar oss identifisere to forbindelser som gjør TRF2 pro-onkogene egenskaper sløve in vivo.
Sammendrag: Telomerisk gjentatt bindingsfaktor 2 (TRIF2) er en underenhet av shelterinproteinkomplekset, som binder seg til og beskytter telomerer mot uønsket DNA-skaderespons (DDR)-aktivering. TRF2-uttrykk spiller en sentral rolle i aldring og kreft, blir nedregulert under cellulær senescens og overuttrykt under onkogenese. Kreft som overuttrykker TRF2 viser ofte en dårlig prognose. I kreftceller spiller TRF2 flere funksjoner, inkludert telomerbeskyttelse og ikke-celleautonome roller, og fremmer neo-angiogenese og immunsuppresjon.puritaner vitamin cVi presenterer her en original screeningsstrategi, som muliggjør identifikasjon av små molekyler som reduserer eller øker TRF2-ekspresjon. Ved å screene et lite bibliotek av Food and Drug Agency (FDA)-godkjente legemidler, identifiserte vi to molekyler (AR-A014418og alexidin-2HCl) som svekket tumorvekst, neo-angiogenese og immunsuppresjon ved å nedregulere TRF2-ekspresjon i en mus xenograft modell. Disse resultatene støtter den kjemoterapeutiske strategien for å nedregulere TRF2-ekspresjon for å behandle aggressive humane svulster og validere denne cellebaserte analysen som er i stand til å screene for potensielle anti-kreft- og antialdringsmolekyler ved å modulere TRF2-ekspresjonsnivåer.
Nøkkelord:TRF2; kreft; aldring; cellebasert screeningsanalyse; neo-angiogenese; immunundertrykkelse
1. Introduksjon
Telomerer er spesialiserte nukleoproteinstrukturer som finnes i endene av lineære kromosomer som reguleres av telomerassosierte faktorer som telomerase, shelterin-proteinkomplekser og ikke-kodende telomerisk repeterende RNA [1]. Når de er riktig regulert, beskytter telomerer kromosomer mot ustabilitet og senescens. Telomerisk DNA-forkorting skjer som en del av programmert fysiologisk utvikling og aldring [2]. Imidlertid driver overdreven telomer-DNA-forkorting sjeldne progeroidsyndromer, slik som dyseratosis congenita [3]. Dessuten er dysregulerte telomertilstander involvert i en rekke sykdommer som er vanlige i den generelle befolkningen, inkludert nesten alle typer kreft og flere degenerative sykdommer [4]. Derfor er det lovende å utvikle farmakologiske behandlinger for å målrette spesifikke telomerkomponenter for å forebygge og behandle slike sykdommer.
Når det gjelder telomer og kreft, svikter noen ganger sjekkpunkter for vital DNA-skaderespons (DDR); dette kan føre til overdreven telomerisk DNA-forkorting og avvikende kromosomomorganiseringer, som igjen kan bidra til onkogenese. Videre er oppregulering av telomerase en nøkkelhendelse i utviklingen av om lag 90 prosent av alle krefttilfeller, da dette kan gi ubegrenset vekst til kreftceller [5]. Av denne grunn har telomerasehemming vært målet for flere studier som søker å utvikle kreftbehandlinger [6]. Til tross for nylig fremgang, er det noen begrensninger for den kliniske bruken av antitelomerasemedisiner. For å stoppe proliferasjon av kreftceller må for eksempel en kritisk kort telomert DNA-lengde nås, og de anti-onkogene effektene av forkortede telomerer går tapt i fravær av p53-tumorsuppressorgenet [7,8]. Denne etterslepperioden reduserer terapeutisk effekt og øker pro-aldringsbivirkninger ved å begrense cellefornyelsen og favorisere aktiveringen av alternative rekombinasjonsbaserte telomerforlengelsesmekanismer [9,10].sistancheDerfor kan anti-telomerase-strategier være bedre egnet for å målrette mot kreftceller som allerede har kritiske korte telomerer [11].
I tillegg til telomerase, er endringer i uttrykket og aktivitetene til shelterinkomplekse underenheter (TRF1,TRF2,RAP1,TIN2,TPP1 og POT1) involvert i tumorgenese, og i noen tilfeller uavhengig av telomerlengden [12-16]. Målretting av shelterin for kreftbehandling kan derfor være et interessant alternativ til anti-telomerase-intervensjoner. Shel-terin underenheten TRF2 representerer en interessant kandidat; TRF2 er overuttrykt i flere humane maligniteter, både i kreft og vaskulære celler, og dette er vanligvis assosiert med en dårlig prognose [17-20]. Spesielt kan TRF2-overekspresjon fremme tumorgenese ikke-celle autonomt, noe som fører til immunsuppresjon og neo-angiogenese[13,18-20]Spesielt skaper TRF2-oppregulering et potent immunsuppressivt mikromiljø. Ved å endre uttrykket av heparansulfatproteoglykaner, rekrutterer og aktiverer TRF2 direkte myeloid-avledede suppressive celler (MDSCs) gjennom TLR2-veien [21]. Mens TRF2-overekspresjon i kreftceller sterkt hemmer rekruttering av NK-celler i tumormikromiljøet ved regulering av HSPG-syntese [13], fører TLR2-aktiveringen av MDSC indusert av overekspresjonen av TRF2 til en kraftig hemming av NK-celle-immunovervåkingen med en sterk reduksjon. av NK-cellers degranulering, IFNgamma-produksjon og -drap [21].hva er cistancheDermed sløver TRF2-overuttrykk sterkt tidlig stadium av antitumor-immunovervåking ved direkte å hemme rekruttering av NK-celler og indirekte funksjonaliteten til NK-celler gjennom utformingen av et MDSC-avhengig immunsuppressivt mikromiljø. Følgelig kan målretting av TRF2 i kreft være en verdifull strategi med flere treff via celleautonome og ikke-celleautonome prosesser ved å fremme senesce samt svekke neo-angiogenese og immunflukt.
cistanche kan anti-aldring
Til dags dato har alle identifiserte små forbindelser som målretter mot TRF2 svekket dens evne til å beskytte kromosomender fra DDR og dermed med potensielle pro-aldringsbivirkninger [22]. Vårt tidligere arbeid viste at en delvis reduksjon av TRF2-ekspresjon kan reversere tumorigenisitet i musemodeller gjennom ikke-celleautonome effekter, uten å indusere DDR [13]. Vi begrunnet derfor at fokus på å redusere overflødig TRF2 i kreft som følge av dets overuttrykk kan være en interessant strategi for å behandle kreft uten pro-aldrende bivirkninger. I denne studien presenterer vi en original screeningsplattform for å identifisere små forbindelser rettet mot TRF2-stabilitet. Vi viser at to topptreff hemmet den tumorigene aktiviteten til TRF2-overuttrykk. Denne studien viste at TRF2-ekspresjon kan moduleres farmakologisk og at vår screeninganalyse er en pålitelig metode for valg av legemidler som er i stand til å modulere TRF2-ekspresjonsnivåer, med potensielle anti-kreft- og antialdringsegenskaper.
2. Materialer og metoder 2.1.Celler
Humane embryonale nyrer (HEK)293-T-celler(ATCC CRL-1573) og BJ-HELTRAs-celler[13] ble dyrket i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, Frankrike) supplert med 10 prosent føtalt kalveserum (FCS), 100 IE/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike).
2.2.SDS-PAGE og Western Blotting
Totale cellelysater ble fremstilt, separert ved elektroforese og blottet som tidligere beskrevet [14]. Kort fortalt ble celler høstet og lysert i lyseringsbuffer (8,76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7,2,0,1 prosent SDS,0,1 prosent Triton X -100,10 g/L natriumdeoksycholat, 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA),1{{50}} ug/mL leupeptin, 1 mM AEBSF og 19 ug/mL aprotinin). Prøver ble deretter titrert ved bruk av BCA-proteinanalysesett (Interchim, Monlucon, Frankrike). Prøver (60 ug/bane) ble oppvarmet ved 95 grader i 5 minutter i ladebuffer (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, 2 prosent SDS, 0,1 prosent bromfenolblått, 10 prosent glyserol pH 6,8). Deretter ble prøver lastet på 10 prosent polyakrylamidgeler og kjørt i 45 minutter ved 160 V. Proteiner ble deretter overført til Immobilon-FL-membraner (Millipore, Upstate New York, USA) ved bruk av Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio- Rad, Hercules, CA, USA). Membraner ble blokkert i 1 time i Intercept Blocking-buffer (LI COR, Lincoln, NE, USA) før inkubasjon over natten ved 4 grader med en blanding av primære antistoffer (mouselgGl anti-TRF2 fortynnet ved 1: 250;og kanin-IgGanti-Beta-aktin fortynnet ved 1:10,000) i Intercept Blocking-buffer som inneholder 0,5 prosent Tween20. Etter å ha blitt vasket i PBS 0,1 prosent Tween20, ble membraner inkubert i 1 time ved romtemperatur i Intercept-blokkerende buffer inneholdende 0,25 prosent Tween20 med en blanding av sekundære antistoffer: geit-anti-mus IRDye 680 for anti-TRF2 antistoff og geit anti-kanin IRDye 800CW for anti-Beta-aktin antistoff (1:15,000 fortynning).Anti aldring cistanchePrimære og IRDye sekundære antistoffer som ble brukt er oppført nedenfor i antistofftabellen (tabell 1). Til slutt ble proteinbånd visualisert ved bruk av LiCor Odyssey 9120 bildesystem (LI-COR). TRF2-ekspresjon ble målt ved å normalisere TRF2-båndintensiteten til intensiteten til aktinbåndet og bakgrunnen.
2.3. Kloningsstrategi
Den humane TRF2-cDNA-sekvensen ble klonet mellom BamHI/BclI-restriksjonssetene til et lentiviralt SFFV-GPR-plasmid som er et HIV-SFFV-GFP-WPRE-derivat [23]. SFFV-GPR-plasmidet inneholder en miltfokusdannende virus (SFV) promoter som kontrollerer et GPR polycistronisk gen som omfatter cDNA-sekvenser for grønt fluorescerende protein (GFP), et puromycinresistensprotein og Tag-red fluorescent protein (RFP)-T (S158T mutert Tag) -RFP), hver atskilt av E2- og T2 Picornaviridae-sekvenser. hTRF2 cDNA ble satt inn i den C-terminale regionen til RFP-T, for å muliggjøre ekspresjon av et RFP-TRF2 fusjonsprotein.
2.4.Lentivirus-produksjon
For lentivirusproduksjon ble 5 × 10* HEK 293-T-celler transfektert med 8,6 ug tom SFFV-GPR eller RFP-TRF2-som uttrykker SFFV-GPR-vektor, 8,6 ug Lenti -Delta 8,91 og 2,8 ug VSV-g via kalsiumfosfat-mediert transfeksjon. Transfekterte celler ble dyrket i DMEM supplert med 10 prosent FCS ved 37 grader med 5 prosent CO2 i 10-cm skåler. Supernatanter som inneholdt de nykonstruerte virusene ble samlet opp etter 48 timer, og deretter ført gjennom et 0,45-μm Millipore-filter. Etter virustitrering ble et 1∶1 (virus∶celle)-forhold brukt for å infisere BJ-HELTRAs-cellelinjen, valgt for dens motstand mot TRF2-defekter [13].cistanche benefíciosEn klon som uttrykte GFP og det sammensmeltede RFP-TRF2-proteinet til moderate nivåer ble deretter isolert ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
2.5. Flytcytometriscreening
BJ-HELTRas klonallinjeceller som inneholder SFFV-GPR-vektoren og uttrykker RFP-TRF2-fusjonsproteinet, ble dyrket i 96-brønnplater i DMEM-medium supplert med 10 prosent FCS og 1 prosent penicillin/streptomycin. Etter 24 timers medikamentbehandling ble cellene trypsinisert og vasket i fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,5 mM EDTA og 2 prosent FCS før fiksering med 0,5 prosent formaldehyd (FA). Fikserte celler ble deretter utsatt for til strømningscytometri ved bruk av en FacsCalibur-prøvetaker med høy gjennomstrømning (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).
2.6. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon i sanntid (RT-qPCR)
Totalt RNA ble isolert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Nederland). Revers transkripsjon ble utført ved bruk av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) med 1 ug totalt RNA. Uttrykket av hvert gen ble normalisert til det for GAPDH. Følgende primere ble brukt: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDHATCCCA{{11}'hGAPDHATCCCA{ATA-CGACCACCCCA{ATA-AAGACCA 5' 14}}. 2.7.AlamarBlå
I en 96-brønn flatbunnsplate ble 5 × 103 celler per brønn sådd i 200 uL DMEMsup supplert med 10 prosent FCS. 24 timer etter medikamentbehandling ble 10 uL AlamarBlue (Bio-Rad) tilsatt og absorbansen ble målt ved 570 nm og 600 nm i 36 timer i en Spectrostar Nano plateleser (BMGLabtech, Ortenberg, Tyskland). Oksydasjons-reduksjonsprosenten av AlamarBlue ble bestemt som beskrevet av produsenten.
2.8.Dyr
Eksperimenter ble utført på 8- til 12-uke gamle NMRI nakne hunnmus fra Janvier Labs (Frankrike). Alle museeksperimenter ble utført i henhold til lokale og internasjonale institusjonelle retningslinjer og ble godkjent av enten Animal Care Committee i IRCAN og det regionale (CIEPAL Cote d'Azur #187 og #188) og nasjonalt (det franske forskningsdepartementet #03482.01/02482.2 og #02973.01/02973.2) myndighetene.
2.9. Tumorveksteksperimenter
Hver NMRI nakenmus ble injisert subkutant i ryggen med 1 x 106 BJ-HELTRAs-celler suspendert i 100 μL PBS (n=8 mus per gruppe). Musene ble behandlet på dag 16, 18, 20 og 22 med intraperitoneale injeksjoner av 100 uL DMSO (45 prosent), alexidin-2HCl (1 mg/kg) eller AR-A014418 (5 mg/kg), deretter fulgt opp til dag 26. Tumorens utseende ble vurdert ved palpasjon hver dag. Svulststørrelsen ble målt hver 2-3 dag med en skyvelære. Tumorvolum ble deretter bestemt ved bruk av hemi-ellipsoidformelen:π×(L×1×h)/6, hvor L tilsvarer henholdsvis lengden,I til bredden og h til svulstens høyde.
2.10.Matrigel-plugganalyser
BJ-HELTRAs-celler ble behandlet med DMSO (1 prosent), alexidin-2HCl (1 uM) eller AR-A014418 (10 μM) i 2 dager. Deretter ble 100 μL 1 × 10 graders behandlede celler suspendert i PBS sammen med 400 ul vekstfaktorredusert Matrigel (Corning, New York, USA) inokulert subkutant på baksiden av NMRI nakne mus under isofluranbedøvelse. På dag 5 etter inokulering ble Matrigel-pluggene høstet, og infiltrerende celler ble samlet ved enzymatisk dissosiasjon via dispase (Corning), kollagenase A (Roche, Bale, Sveits) og DNAseI(Roche) fordøyelse i 30 minutter ved 37 grader [13] ]. Celler ble mettet i 15 minutter på is med Fe-Block anti-CD16/CD32 antistoffer (klon 2.4G2) før farging med koblede antistoffer i 30 minutter ved 4 grader. De konjugerte antistoffene som brukes er oppført i antistofftabellen. Celler ble vasket i PBS med 0,5 mM EDTA, 2 prosent FCS og fiksert med 0,5 prosent FA. Fargede celler ble analysert ved bruk av et ARIA III-cytometer med DIVA6-programvare (BD Biosciences) og FlowJo 10(LLC).
2.11.Statistikk
Alle grafer og statistiske analyser ble produsert ved bruk av GraphPad Prism-programvare (San Diego, CA, USA). Alle resultater er representert som gjennomsnitt ± standardavvik (sd) eller gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Signifikante forskjeller mellom gjennomsnittene ble bestemt ved å bruke Mann-Whitneys tosidede test. Log-rank (Mantel-Cox)-testen ble brukt for å bestemme tumortaking. For hver test, s<0.05 was="" considered="" statistically="">
3. Resultater
3.1. Identifikasjon av TRF2-hemmende molekyler
For å screene for medisiner som er i stand til å modulere TRF2-proteinnivåer, brukte vi et lentiviralt system for å co-transkribere GFP-genet og RFP smeltet til N-terminalen av TRF2. Etter en generell strategi beskrevet andre steder [23], konstruerte vi et GRT lentivirus, der SFFV-promotoren kontrollerte uttrykket av et poly-cistronisk gen som koder for GFP, et puromycinresistensprotein og enten RFP-TRF2 eller RFP bare som en kontroll (figur 1A). Følgelig uttrykte alle transduserte celler både GFP og RFP-TRF2. Dette systemet ble designet for å identifisere medikamenter som modulerer TRF2-ekspresjon, ved å måle RFP-intensitet ved bruk av flowcytometri, mens GFP-intensitet fungerer som en intern kontroll for transkripsjon av reporterkonstruksjonen.
Vi transduserte GRT lentivirusene til humane BJ-HELTRas fibroblaster som ble udødeliggjort av SV40 og hTERT og gjort onkogene av Ras v12 [13]. For å lette målinger av både opp- og nedregulering av TRF2, ble en puromycin-resistent klon som moderat uttrykte både GFP- og RFP-TRF2-proteiner isolert ved bruk av FACS-sortering og kalt GRI-BJ-HELTRas (Figur 1A). Som en positiv kontroll behandlet vi GRT-BJ-HELTRAs-celler med 10 uM gemcitabin, en tidligere beskrevet modulator av TRF2-stabilitet [24], i 24 timer. Selv om ingen RFP-modulasjon ble påvist i celler transdusert med tom vektor, ble en signifikant reduksjon i RFP/GFP-middelfluorescensintensitet (MFI)-forholdet observert i gemcitabin-behandlede GRT-BJ-HELTRas-celler sammenlignet med DMSO-behandlet kontroll (82 prosent) av kontrollen; s<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">
Ved å bruke flowcytometri screenet vi deretter 396 Food and Drug Administration (FDA)-godkjente farmakologiske forbindelser som er i stand til å målrette mot seks hovedkategorier av biologiske prosesser: ionekanaler, fosfataser, kinaser, epigenetiske faktorer, nukleære reseptorligander og Wnt-banen (figur S1C) ).GRT-BJ-HELTRAs-celler ble først behandlet med 10 uM av hver av de 396 forbindelsene eller DMSO i 24 timer før flowcytometrianalyse (figur S1D). I dette tilfellet ble 84 forbindelser funnet å modulere TRF2-proteinnivåer (Figur S1D, høyre panel; Tabell S1), og ble brukt til en sekundær skjerm (Figur S1E; Tabell S1). I denne sekundære screeningen, i tillegg til å behandle GRT-BJ-HELTRas-celler med 10 uM av de utvalgte forbindelsene, ble ikke-transduserte BJ-HELTRas-celler eller BJ-HELTRAs-celler transdusert med en tom vektor behandlet på samme måte for å kaste falske positiver som avgir rødt eller grønn autofluorescens eller påvirker RFP- eller GFP-proteiner. De 18 beste forbindelsene ble deretter valgt for å bestemme deres evne til å modulere uttrykket av endogen TRF2 i ikke-transduserte BJ-HELTRas-celler, basert på Western blotting (Figur S2A, B Tabell S1). Vi definerte treff som forbindelser som modulerer med minst 20 prosent av TRF2-dosering (enten opp eller ned). Ved å bruke disse kriteriene, fra de 18 legemidlene evaluert ved Western blotting, reduserte 9 av dem og ett økte endogene TRF2-proteinnivåer (Figur S2A, Tabell S1) Vi bestemte oss deretter for å velge to forbindelser blant disse legemidlene for in vivo-eksperimenter for å bestemme om de kunne motvirke de pro-onkogene effektene av TRF2-overuttrykk. For å unngå DDR-aktivering og bivirkninger i ikke-tumorogene celler, valgte vi forbindelser som verken reduserte til høyeste eller laveste TRF2-dosering. Blant dem tilsvarte AR og AD disse kriteriene. Begge forbindelsene nedregulerte RFP-TRF2 i GRT-BJ-HELTRAs-celler som analysert ved flowcytometri (Figur 1C), endogene TRF2-proteinnivåer som vist ved Western blotting-analyse (Figur 1D; Figur S2A,B) og TERF2 mRNA-nivåer som bestemt via RT -qPCR (Figur 1E). Videre reduserte behandling med de respektive LD50-konsentrasjonene av AR og AD TERF2 mRNA-ekspresjon i både BJ-HELTRAs-celler og i TRF2-overuttrykkende BJ-HELTRas-celler (figur S3A-C).
3.2.AR-A014418 og Alexidine-2HCl reverserte svulstdannelsen gitt av høye TRF2-ekspresjonsnivåer
Vi evaluerte deretter virkningen av AR og AD på tumorvekst. For å kontrollere deres evne til å målrette mot TRF2-overuttrykkende kreftformer, analyserte vi de potensielle antitumorogene effektene av AR og AD på både standard BJ-HELTRas-celler og TRF2-overuttrykkende BJ-HELTRas-celler. BJ-HELTRAs-celler ble transdusert med TRF2lentiviral vektor eller tom vektor, deretter injisert subkutant i nakne mus. Musene ble deretter behandlet med DMSO, 1 mg/kg AD eller 5 mg/kg AR på dagene 16, 18, 20 og 22 etter injeksjon [26, 27] (Figur 2A). Som tidligere rapportert [13,21], fremmet TRF2-overekspresjon tumorini. tiasjon og vekst in vivo (figur 2B-D; s<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>
3.3.AR-A014418 og Alexidin-2HCI motvirket TRF2-avhengig immunsuppresjon og neo-angiogenese
For å bestemme om antitumoreffektene av AR og AD kunne målrette mot de ikke-celleautonome onkogene egenskapene til TRF2, undersøkte vi immuncelleinfiltrasjon og aktivering samt angiogenese i behandlede svulster. Vi behandlet standard- og TRF2--overuttrykkende BJ-HELTRAs-celler (figur S3A) med 1 uM AD, 10 uM AR eller DMSO i 48 timer før deres subkutane injeksjon med Matrigel i nakne mus. Matrigelplugger ble deretter samlet 5 dager etter injeksjon for å analysere tumormikromiljøet ved flowcytometri (figur 3A). Som forventet [13,21], endret ikke TRF2-overuttrykk global immuncelle (CD45 pluss celle) infiltrasjon (figur 3B; figur S4A), men hemmet rekruttering av naturlig dreper (NK) celler (figur 3C; figur S4B) og NK-funksjon -ality (Figur 3C-E; Figur S4C), og øke MDSC-infiltrasjon (Figur 3F). I TRF2- som spesifikt overuttrykker BJ-HELTRas-celler, økte behandling med begge medikamentene global immuninfiltrasjon (figur 3B; figur S4A), samt mengden og funksjonaliteten til intratumorale NK-celler (figur 3C-E; figur S4B,C). Spesielt reddet begge legemidlene hemmingen av NK-cellemediert immunovervåking (CD107a pluss og CD69 pluss NK-celle) indusert av TRF2-overuttrykk (Figur 3C). Dette var assosiert med en dramatisk nedgang i MDSC-rekruttering (Figur 3F; Figur S4D) og med økt rekruttering av monocytter og makrofager (Figur 3G).
Som tidligere rapportert [14,20], var tumorangiogenese høyere i TRF2-overuttrykkende svulster sammenlignet med kontrollsvulster. Mens TRF2-overekspresjon økte mengden CD31 pluss CD45-endotelceller i tumorbedet (figur 3H; figur S4E), ble det ikke påvist noen forskjell mellom tom vektor eller TRF2-overuttrykkende svulster etter behandling med begge medikamentene. ing TRF2 (TRF2 vektor) eller tom vektor ble behandlet med 1 uM alexidin-2 HCl eller 10 μM AR-A014418 eller DMSO 2 dager før subkutan injeksjon med Matrigel (1 × 10 graders celler) i NMRI nakenmus ( n=8). Immun- og endotelcelleinfiltrasjon ble deretter evaluert 5 dager etter injeksjon ved flowcytometri. (BH). Flowcytometrianalyse av immuninfiltrasjonen av Matrigel-pluggen. Antallet immunceller som infiltrerer Matrigel-pluggene blant levende celler, vises. Total immuncelleinfiltrasjon (CD45 pluss-celler) er vist i (B); infiltrasjon av naturlig morder(NK)-celle(NKp46 pluss-celler) er vist i (C); aktivert NK celle (CD107a pluss og CD69 pluss NK celler) inffiltrasjon er vist i (D,E); myeloid-avledet suppressorcelle (MDSC;CD11b pluss GR1 pluss ))infiltrasjon er vist i (F);monocytt-makrofaginfiltrasjon er vist i (G) og endotelcelleinfiltrasjon er vist i (H).p Verdier ble bestemt ved bruk av Mann- Whitney-test(*s<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">
4. Diskusjon
Her rapporterer vi utviklingen av en cellebasert analyse for å screene for forbindelser som modulerer ekspresjonen av det telomere proteinet TRF2. Ved å screene et lite bibliotek av FDA-godkjente molekyler, identifiserte vi forbindelser som enten kunne øke eller redusere TRF2-ekspresjonsnivåer. Vi oppdaget at AD og AR nedregulerte TRF2 og viste anti-tumorigen aktivitet spesifikk for tumorceller som overuttrykker TRF2. For ytterligere å demonstrere deres TRF2-spesifikke aktivitet reddet AR- og AD-behandling immunsuppresjon og neo-angiogenese forårsaket av TRF2-overekspresjon. Påfallende nok tyder det faktum at den globale immuninfiltrasjonen øker for TRF2-overuttrykkende svulster etter AR- eller AD-behandling at disse medikamentene er mer potente for å forbedre immunresponsen når TRF2 er overuttrykt. Disse stoffene hemmer den immunsuppressive effekten av TRF2-overuttrykk ved å gjenopprette NK-cellefunksjonalitet (CD107a og CD69 pluss NK-celler) og reduserer MDSC-infiltrasjon sterkt. Dette antyder at disse medikamentene gjør det TRF2-avhengige spesifikke programmet som utløser immunflukt og immunsuppresjon og kan øke frigjøringen av Danger Associated Molecules (DAMP) som forsterker immunresponsen spesifikt når TRF2 er overuttrykt. Bemerkelsesverdig observerer vi at AR og AD reddet de immunsuppressive og pro-angiogene funksjonene til TRF2-overuttrykk, to kjennetegn ved TRF2-overuttrykk som vi tidligere viste som DDR-uavhengige. Dermed antok vi at AR- og AD-effektene på tumorvekst er DDR-uavhengige, en mekanisme som gjenstår å bli fullstendig beskrevet i videre studier. Den nåværende proof-of-concept-studien gir bevis på at farmakologisk reduksjon av TRF2-ekspresjon kan være en verdifull anti-kreftstrategi
Selv om screeningsmetoden vurderte TRF2-proteinnivåer uavhengig av transkripsjonsnivåer, reduserte begge stoffene endogene TERF2-mRNA-nivåer, noe som antyder at AR og AD målretter mot flere nivåer av TRF2-regulering. Som støtte for dette er AR en hemmer av Wnt-signalering [28], som er en aktivator av TERF2-transkripsjon [29]. Mer generelt ble stoffene rettet mot Wnt-signalveien beriket under screeningstrinnene (figur S1B-D). Hvordan AD, et mitokondrie-målrettende middel, påvirker TRF2-ekspresjon gjenstår å bestemme. Siden kreftformer som viser høye TRF2-nivåer har en dårlig prognose og viser økt motstand mot kjemoterapi [21], er AR og AD terapeutiske midler av interesse for slike svulster. Potensialet for å koble fra de telomere og pro-onkogene aktivitetene til TRF2[13] øker muligheten for farmakologisk nedregulering av TRF2 og dermed gi multi-hit anti-kreft-fordeler uten skadelige pro-aldringsbivirkninger. Derfor er fremtidige studier berettiget for å bestemme de synergistiske effektene av disse stoffene på TRF2-ekspresjonsnivåer i kliniske studier.
Selv om TRF2 er oppregulert i forskjellige humane kreftformer [13,21], nedreguleres dets uttrykk under både normal og patologisk aldring av mange vev [30,31] Dessuten understreker flere rapporter som involverer musemodeller av TRF2-dysregulering viktigheten av TRF2 ved veiskillet mellom aldring og kreft [31-35]. Derfor er molekylene identifisert ved screeningsprosedyren beskrevet her interessante medikamentkandidater, både som anti-kreftmidler for TRF2-nedregulering som bekreftet i denne studien, og potensielt som antialdringsmidler ved å oppregulere TRF2.
Denne artikkelen er hentet fra Cancers 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers
