ACKR4a induserer autofagi for å blokkere NF-kB-signalering og apoptose for å lette Vibrio Harveyi-infeksjon

SAMMENDRAG

Autofagi og apoptose er to anerkjente mekanismer for motstand mot bakteriell invasjon. Imidlertid har bakterier på samme måte utviklet evnen til å unngå immunitet. I denne studien identifiserer vi ACKR4a, et medlem av en atypisk kjemokinreseptorfamilie, som en suppressor av NF-kB-banen, som samarbeider med Beclin-1 for å indusere autofagi for å hemme NF-kB-signalering og blokkere apoptose, noe som letter Vibrio harveyi-infeksjon. Mekanistisk aktiverer V. harveyi-indusert Ap-1 ACKR4a-transkripsjon og ekspresjon. ACKR4a danner et kompleks med henholdsvis Beclin-1 og MyD88, som induserer autofagi og transporterer MyD88 inn i lysosomet for nedbrytning for å undertrykke inflammatorisk cytokinproduksjon. I mellomtiden blokkerer ACKR4a-indusert autofagi apoptose ved å hemme caspase8. Denne studien beviser for første gang at V. harveyi bruker både autofagi og apoptose for å unngå medfødt immunitet, noe som tyder på at V. harveyi har utviklet evnen mot fiskeimmunitet. 

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

INTRODUKSJON

Immunsystemet er generelt delt inn i medfødt og ervervet immunitet, hvor de fleste organismer hovedsakelig er avhengige av medfødt immunitet for å overleve.1 Den medfødte immuniteten er en forsvarsmekanisme som dannes i organismer. Den gjenkjenner det patogenassosierte molekylære mønsteret (PAMP) gjennom mønstergjenkjenningsreseptorene (PRR), gir en rask respons på patogen infeksjon og beskytter verten mot infeksjon.2,3 Som en viktig PRR, toll-lignende reseptorer (TLR) kan initiere et bredt spekter av responser fra fagocytose til cytokinproduksjon, og derved ytterligere forsterke inflammatoriske og medfødte immunresponser.4 I de fleste tilfeller signaliserer TLR-er primært gjennom en MyD88-avhengig vei, som overfører signaler gjennom kaskadereaksjoner for å aktivere kjernefysisk faktor-kappa B (NF-kB).5 NF-kB er en av nøkkelfaktorene i initieringen av medfødt immunitet og er avgjørende for koordinering av den inflammatoriske responsen, medfødt immunitet, celledifferensiering, spredning og overlevelse, og er anses å være hovedinitiatoren til den inflammatoriske responsen.6 Når bakterier infiserer verten, syntetiseres nedstrøms effektorer av den medfødte immunresponsen som cytokiner og kjemokiner, og fører til slutt til en inflammatorisk respons som blokkerer veksten av bakterier. Imidlertid har bakterier i samevolusjon med vertene deres også utviklet forskjellige reguleringsstrategier for å unngå og undergrave vertens forsvar.

Autofagi og apoptose antas å være de to viktige veiene mot bakteriell invasjon.7 Autofagi er en konservativ prosess som transporterer unormale proteiner til lysosomer for nedbrytning og spiller en viktig rolle i den medfødte immuniteten til eukaryoter mot bakteriell invasjon.8,9 Men noen bakterier unngår immunitet ved å bruke autofagi hos pattedyr. Normalt tar cellene sikte på å fjerne invaderende ekstracellulære bakterier og koloniserende bakterier i cytoplasmaet gjennom autofagi,10 men noen bakterier kan "kapre" autofagi for å fullføre selvvekst og reproduksjon.11–13 For eksempel Unc-51-som kinase 1 (ULK1), Beclin1, mikrotubuli-assosiert protein lett kjede 3 (LC3) og autophagy-relaterte proteiner (ATGs) samarbeider for å danne autofagosomer, som kapsler inn invaderende mikroorganismer og transporterer dem til lysosomer for nedbrytning.14–16 Mycobacterium tuberculosis ned. -regulerer Beclin-1 for å forhindre dannelse av autofagosomer, og til slutt hemmer autofagi og fremmer infeksjon.17 I motsetning til hemming av dannelse av autofagosomer, bruker noen bakterier autofagosomer for å fullføre selvreplikerende nettsteder for å fremme spredning.11,18 I tillegg til autofagi, apoptose er også et middel for vertsforsvar mot invaderende patogener.7 Apoptose er et celledødsmønster som brukes til å fjerne skadede celler for å opprettholde stabiliteten til det systemiske miljøet.19 Ved mottak av et signal om bakteriell invasjon, induserer verten apoptose av infiserte celler for å hemme bakteriell infeksjon.20 Derfor avhenger vellykket bakteriell kolonisering av dens evne til å forhindre apoptose og beskytte bakteriell replikasjon. For eksempel sikrer Edwardsiella tarda dens overlevelse ved å hemme apoptose etter infeksjon av sebrafisk ZF4-celler,21Shigella oppnår vellykket kolonisering ved å hemme apoptose,22 og S-protein produsert av gruppe A-streptokokker (GAS) binder seg til erytrocyttmembranen for å unngå immundeteksjon av verten. system.23 Selv om mange bakterier har vist seg å ha utviklet evnen til å unnslippe immunitet, er det noen få rapporter om marine patogener. Vibrio harveyi tilhører Vibrionaceae-familien, som er anerkjent som et høypatogent agens for marin fisk; det forårsaker gastroenteritt, muskelnekrose og hudsår, og er en av hovedårsakene til marin fisks dødelighet.24

cistanche planteøkende immunsystem

Bortsett fra autofagi og apoptose, kan noen bakterier (f.eks. Staphylococcus aureus) til og med bruke vertens kjemokinreseptorer for å unngå immunitet.25 Kjemokinreseptorer er G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) som hovedsakelig finnes på overflaten av leukocytter. De inneholder syv transmembrane strukturer, som er involvert i ligandbinding og signalering, og spiller en nøkkelrolle i initiering og vedlikehold av immun- og inflammatoriske responser.26 Etter hvert som kjemokinforskningen skred frem, ble atypiske kjemokinreseptorer (ACKR) oppdaget.27 Selv om ACKR-er er strukturelt lik andre kjemokinreseptorer og kan internalisere ligander, de kan ikke aktivere signaltransduksjonsveien på grunn av mangelen på DRYLAIV-domenet, som også kalles ''stille reseptor''.28 Funksjonen til ACKR-er kan reflekteres på følgende måter : 1. De kan konkurrere med typiske reseptorer om å binde kjemokin, og derved regulere signaloverføringen av cellekjemotaksi; 2. Ved å internalisere kjemokin i celler, reduseres konsentrasjonen av kjemokin i miljøet for å påvirke rekrutteringen av cellen og fungere som en kjemokinfjerner. 3. De hjelper kjemokiner med å fullføre krysscelletransport gjennom stromalcellebarrieren.29 ACKR-familien inkluderer hovedsakelig DARC,30 D6 31,32, CXCR7,33 og CCRL1,34 CCRL1 er også kjent som atypisk kjemokinreseptor 4 (ACKR4). For tiden har noen studier vist at ACKR4 ser ut til å realisere signaltransduksjon gjennom den G-proteinuavhengige veien,35–37, og den har ikke-overflødige roller i å kontrollere betennelse og immunrespons.38 Dens rolle i adaptiv immunitet er velkjent, men dens funksjon i medfødt immunitet blir sjelden studert.

I medfødt immunitet er signaltransduksjonen av TLR-banen svært bevart fra virvelløse dyr til pattedyr. Som et kjerneprotein i TLR-signalering har MyD88 blitt mye studert hos virveldyr. I tillegg, på grunn av den svært konserverte strukturen til MyD88, kan dets homologer i fisk ha lignende funksjoner som hos pattedyr.39,40 Hos sebrafisk er MyD88 involvert i fjerning av bakterielle infeksjoner.41 Tidligere studier har også bekreftet at V. harveyi unngår immunitet ved å ødelegge signaltransduksjonen til MyD88.42 Imidlertid er mekanismene for hvordan V. harveyi unngår immunitet fortsatt dårlig forstått hos teleostfisk. I denne studien ble ACKR4a raskt oppregulert i V. harveyi-stimulert Miichthys muy. Den oppregulerte ACKR4a undertrykte både medfødt immunitet ved å indusere autofagi for å blokkere MyD88-mediert NF-kB-vei og indusere autofagi for å blokkere apoptose, for å forbedre V. harveyi-infeksjon. Så vidt vi vet, er denne rapporten den første som belyser at V. harveyi har vist seg å bruke både autofagi og apoptose for å unngå medfødt immunitet.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

RESULTATER

V. harveyi-infeksjon induserer ACKR4a-uttrykk for å fremme selvspredning

For å identifisere gener som potensielt er involvert i reguleringen av V. harveyi-infeksjon, behandlet vi miiuy croaker med V. harveyi i 48 timer, og brukte deretter RNA-seq-analyse for å screene de forskjellige ekspresjonsgenene (DEG) mellom V. harveyi behandlet og ubehandlet miltprøver. Fra dypsekvenseringsdataene identifiserte vi 145 oppregulerte gener og 28 0 nedregulerte gener (figur 1A). På dette grunnlaget valgte vi de 10 største og 10 minste DEGene (log2 av foldendring var 1,0) for clustering heatmap, og resultatet viste at de respektive prøvene i både de V. harveyi-behandlede og ubehandlede prøvene var godt replikert (Figur 1B). . ACKR4a-mRNA-ene ble undersøkt og fant at det var sterkt uttrykt i M musikkhjernen etter V. harveyi-infeksjon (figur S1A). Så M. muiiy hjernecellelinje (MBrC) ble brukt for påfølgende eksperimenter. Knockdown-effektiviteten til ACKR4a-si1 er 46,1% og ACKR4a-si2 er 63,7% i MBrC (Figur S1B), så ACKR4a-si2 (kalt ACKR4a-si) ble brukt for påfølgende eksperimenter. Deretter fokuserte vi på genet ACKR4a, som kan ha en immunfunksjon, og analyseresultatene for kolonidannende enheter (CFU) viste at ACKR4a fremmet V. harveyi-spredning (figur 1C, 1D og S1C). For ytterligere å undersøke mekanismen som ACKR4a fremmer V. harveyi-spredning, ble ekspresjonsmønsteret til ACKR4a analysert. ACKR4a i MBrC-celler ble regulert av V. harveyi. Resultatene viste en tidsavhengig måte med V. harveyi-infeksjon på både mRNA- og proteinnivåer (figur 1E og 1F). I tillegg undertrykte ACKR4a-demping effektivt uttrykket av ACKR4a på både mRNA- og proteinnivåer (figur 1E og 1G). Resultatene ovenfor indikerte at oppreguleringen av ACKR4a kan lette V. harveyi-infeksjon.

Figur 1. V. harveyi-indusert ACKR4a letter dens selvspredning

ACKR4a hemmer V. harveyi-utløst NF-kB-signalering 

Vi fant at celleproliferasjonshastigheten ble påvirket når MBrC ble infisert med V. harveyi, og for å bekrefte dette funnet utførte vi celleproliferasjonsanalyser. Resultatene viste at V. harveyi-infeksjon reduserte spredningen av MBrC (figur S1D). Påfølgende eksperimenter har bekreftet at ACKR4a-overekspresjon reduserte celleproliferasjon, mens ACKR4a-demping forbedret celleproliferasjon (figur 2A og S1E). Flere studier har vist at aktivering av NF-kB fremmer celleproliferasjon. Det ble funnet at BAY 11–7082, hemmeren av NF-kB, også kunne redusere spredningen av MBrC (Figur 2A og S1E). I likhet med tidligere rapporter,43 var økningen av NF-kB-luc assosiert med V. harveyi-infeksjonen på en tidsavhengig måte (figur S1F).

Figur 2. ACKR4a hemmer V. harveyi-utløst NF-kB-signalering

For ytterligere å bestemme effekten av ACKR4a på V. harveyi-utløst NF-kB-signalering, ble det utført en luciferase-reporter-analyse. ACKR4a hemmet signifikant V. harveyi- og LPS-utløst NF-kB luciferaseaktivitet; V. harveyi-utløste IL-1b- og TNFa-luciferaseaktivitet ble også hemmet av ACKR4a (figur 2B–2D). Endogen ACKR4a ble stilnet for å validere sin rolle i medfødt immunitet. Deretter ble ekspresjonsmønstrene til p65 og pro-inflammatoriske cytokiner (IL-1b og TNFa) detektert ytterligere, ACKR4a-demping økte drastisk p65-mRNA-er, IL-1b-mRNA-er og TNFa-mRNA-er (figur 2E–2G) ). Resultatene i MLC og MKC indikerte også at ACKR4a kunne hemme NF-kB-signalering (figurene S1G–S1J). ELISA-resultatene var også like; ACKR4a-demping økte TNFa betydelig og ACKR4a-overuttrykk hemmet TNFa (figur 2H). For å evaluere aktiveringen av NF-kB, er det mer nødvendig å analysere den translittererte formen, det vil si fosforylert NF-kB, og det er et mål på NF-kB-aktivitet på målgener. Ved stimulering av NF-kB blir p65 fosforylert og går inn i kjernen for å regulere transkripsjonen av pro-inflammatoriske cytokiner. For å utforske reguleringen av p65-fosforylering ved ACKR4a, målte vi fosforyleringsnivået til p65 etter ACKR4a-demping og ACKR4a-overuttrykk ved immunoblot. V. harveyi-infeksjon økte p65-fosforylering, noe som beviste at V. harveyi effektivt aktiverte NF-kB. På dette grunnlaget forbedret ACKR4a-demping p65-fosforylering, mens ACKR4a-overekspresjon reduserte p65-fosforylering, noe som indikerer at ACKR4a er en hemmer av NF-kB-signalering (figur 2I og 2J). Hos sebrafisk økte knockdown av ACKR4a fosforyleringen av p65. I tillegg viste CFU-analysen at BAY 11–7082 økte spredningen av MBrC betydelig (figur 2K). Totalt sett tyder disse dataene på at ACKR4a fungerer som en negativ regulator av NF-kB-signalering for å hemme medfødt immunitet under V. harveyi-infeksjon.

Figur 3. ACKR4a interagerer med MyD88 og fremmer MyD88-degradering i autofagi

ACKR4a samhandler med MyD88 og fremmer MyD88 for autofagisk nedbrytning

Deretter forsøkte vi å bestemme hvilket mål i NF-kB-signalering som formidler ACKR4a0s undertrykkende funksjon. NF-kB-luciferase-reporteranalysen avslørte at overekspresjon av ACKR4a forårsaket en reduksjon av luciferaseaktivitet, som ble indusert av MyD88 på en doseavhengig måte (figur 3A). Imidlertid viste overekspresjon av ACKR4a ingen effekt på luciferaseaktivitet drevet av TRAF6 eller TAK1 (figur 3B og 3C). Et immunoblot-resultat var likt luciferase-reporter-analysen; overekspresjon av ACKR4a hemmet MyD88 på en doseavhengig måte, men det var ingen effekt på TRAF6 og TAK1 (Figur 3D). Disse resultatene tyder på at ACKR4a fungerer på MyD88-nivå.

Alle pattedyr-TLR-er, bortsett fra TLR3, er i det minste delvis avhengige av MyD88-adapteren for å overføre signaler, noe som gjør direkte regulering av MyD88 mer effektiv.44 Vi undersøkte deretter uttrykket av MyD88 på forskjellige tidspunkter for V. harveyi-infeksjonen og fant ACKR4a-demping forbedret uttrykket av MyD88 (Figur 3E), og ACKR4a-overekspresjon hemmet MyD88-ekspresjon på en tidsavhengig måte (Figur 3F). Et interessant resultat ble funnet at selv om ACKR4a-demping forbedret MyD88-ekspresjonen utløst av V. harveyi, var denne forbedringen ikke tilstede når cellene hvilte (figur 3G og 3H). For å bedre forstå den molekylære mekanismen som ligger til grunn for virkningen av ACKR4a i MyD88-mediert NF-kB-signalering, utførte vi Co-immunoprecipitation (Co-IP) analyser for å avgjøre om ACKR4a interagerer med MyD88. Flag-ACKR4a kunne immunutfelles med Myc-MyD88 (figur 3I og S1K). I samsvar med det fant vi ut at Flag-MyD88 kunne samhandle med endogen ACKR4a (Figur 3J). Påfølgende subcellulære lokaliseringseksperimenter viste at ACKR4a ikke hadde noen signifikant samlokalisering med MyD88 (figur S1L). Dermed støtter disse funnene konseptet om at ACKR4a fysisk interagerer med MyD88, og deres interaksjon forekommer sannsynligvis i cytoplasmaet. Deretter undersøkte vi mekanismen som ACKR4a undertrykte MyD88-uttrykk. Enten NH4Cl eller 3-Methyladenine (3-MA), hemmere av den autofagi-lysosomavhengige nedbrytningsveien, resulterte i en betydelig akkumulering av MyD88 i nærvær av ACKR4a, og MG132 påvirket ikke nedbrytningen av MyD88 (Figur 3K). Dessuten viste lignende resultater at 3-MA og NH4Cl signifikant blokkerte MyD88-nedbrytning på en doseavhengig måte (figur 3L og 3M). Disse funnene ser ut til å antyde at blokkering av autofagi effektivt forhindrer ACKR4a-målrettet MyD88-nedbrytning. Autofagisk fluks betegner den dynamiske prosessen med autofagi, som er en pålitelig indikator på autofagisk aktivitet. Fordi GFP-fluorescens slukkes i lysosomet, kan stadiet av autofagi bestemmes ut fra fluorescensen til GFP og RFP.42 Observasjon av den gule fluorescensen i Merge-panelet viste mer rød fluorescens i nærvær av ACKR4a, noe som indikerer at ACKR4a fremmet fusjonen av autofagosomer og lysosomer; mens autofagi-hemmeren klorokin (CQ) forhindret fusjon av autofagosomer og lysosomer, og viste mer gul fluorescens (figur 3N). For ytterligere å validere at ACKR4a retter seg mot MyD88 for autofagisk nedbrytning, ble det utført en lysosomal lokaliseringsanalyse, MyD88 (grønn) og lysosomer (rød) ble samlokalisert i MBrC-celle (Figur 3O), noe som tyder på at MyD88 ble transportert til lysosomer. Til sammen antyder disse resultatene at ACKR4a interagerer med MyD88 og retter seg mot MyD88 for autofagisk nedbrytning.

Figur 4. ACKR4a deltar i reguleringen av autofagi via Beclin-1

ACKR4a deltar i reguleringen av autofagi via Beclin-1

Noen bakterier bruker autofagi for å fremme vekst og infeksjon, deres replikasjon vil reduseres når autofagi er fraværende.13 For å teste om V. harveyi deltar i reguleringen av autofagi i MBrC-celler, ble celler infisert med V. harveyi og deretter ekspresjonsmønsteret av LC3 ble undersøkt. I MBrC-celler økte V. harveyi-eksponering autofagien som indikert av akkumulering av GFP-LC3 puncta, som ble ledsaget av en tidsavhengig økning av V. harveyi-infeksjon (figur 4A). ACKR4a-overekspresjon forbedret V. harveyi-indusert autofagi som vist ved en bemerkelsesverdig økning i puncta-akkumuleringer av RFP-LC3, i motsetning til ACKR4a-demping som betydelig reduserte V. harveyi-indusert autofagi (figur 4B og 4C). I tillegg resulterte ACKR4a-demping i en reduksjon i V. harveyi-indusert LC3-II-uttrykk (figur 4D).

ULK1, Beclin-1 og ATG5 var de viktigste regulatoriske proteinene for autofagi. qPCR-resultater viste at ACKR4a betydelig forbedret uttrykket av Beclin -1, men ikke ULK1 og ATG5 (Figur 4E). Luciferase-reporteranalysen av ULK1, ATG5 og Beclin-1 viste at overekspresjon av ACKR4a bare forårsaket en økning av Beclin-1luciferaseaktivitet (figur 4F). Deretter oppdaget vi at overekspresjon av ACKR4a forbedret uttrykket av Beclin-1, men ikke ULK1 og ATG5 (Figur 4G). ACKR4a-indusert autofagi ble også hemmet av Beclin-1-si, mens ATG5-si bare hadde delvis inhibering (figur 4H). Resultatene ovenfor indikerte at ACKR4a var målrettet mot Beclin-1. Derfor ble funksjonen og mekanismen til Beclin-1 i ACKR4a-mediert autofagisk degradering av MyD88 undersøkt. Hos sebrafisk infisert med V. harveyi, resulterte ikke knockdown av ACKR4a i signifikante endringer i ULK1 mens de reduserte Beclin-1 og ATG5 signifikant (figurene S2B–S2D). Beclin-1 forbedret ACKR4a-indusert autofagisk fluks ytterligere med Baf1A og CQ behandlet (Figur 4I), og Beclin-1 forbedret nedbrytningen av MyD88 av ACKR4a (Figur 4J). Vi utførte deretter Co-IP-analysene for å bestemme om ACKR4a interagerer med Beclin-1, og fant at ACKR4a interagerer med Beclin-1, og V. harveyi-infeksjon forbedret interaksjonen mellom ACKR4a og Beclin{{51 }} (Figur 4K). En lysosomal lokaliseringsanalyse indikerte at ACKR4a forsterket autofagosomet-fusjonen med lysosomet (Figur 4L). Deretter øker ACKR4a endogent Beclin-1-uttrykk (figur 4M) og ACKR4a-demping demper V. harveyi-indusert Beclin-1-uttrykk (figur 4N). I tillegg forbedret Beclin-1-demping fosforyleringen av p65 utløst av V. harveyi, noe som ytterligere antyder at V. harveyi induserer autofagi for å negativt regulere NF-kB-signalering (Figur 4O). Vi forsøkte deretter å bestemme den biologiske betydningen av Beclin-1 i V. harveyi-infeksjon, spesielt ved kontroll av V. harveyi-spredning. CFU-analysen ble utført og fant at både Beclin-1-demping og CQ-blokkert autofagi reduserte spredningen av V. harveyi, noe som beviser at V. harveyi bruker autofagi for å fremme spredningen (figur 4P). Resultatene ovenfor viser sammen at ACKR4a induserer og danner komplekser med Beclin-1 for å fremme autofagi, og deretter lette V. harveyi-infeksjon.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ACKR4a induserte autofagi til blokkert apoptose

Autofagisk celledød anses som et rimelig alternativ til apoptose, og apoptose er også en anerkjent antibakteriell mekanisme; vellykkede bakterielle infeksjoner fullfører selvreplikasjon ved å hemme apoptose.22 For å bestemme forholdet mellom V. harveyi-indusert autofagi og apoptose, ble apoptosen til MBrC-celler med forskjellige behandlinger før og etter V. harveyi-infeksjon bestemt, og ACKR4a-demping økte V. harveyi-indusert apoptose (figur 5A og 5B, venstre panel). Fordi caspase3 og caspase7 er viktige i initieringen av apoptose, er de allment akseptert som pålitelige indikatorer på apoptose. En caspase Glo 3/7-analyse viste at ACKR4a-overekspresjon hemmet V. harveyi-indusert caspase3/7-aktivitet, mens ACKR4a-demping forbedret V. harveyi-indusert caspase3/7-aktivitet (Figur 5B, høyre panel). V. harveyi og eksogent tilsatt rekombinant aktiv caspase8-indusert caspase3/7-aktivitet ble hemmet av ACKR4a (figur 5C), noe som tyder på at ACKR4a er i stand til effektivt å blokkere apoptosesignalering. Selv om ACKR4a-indusert autofagi har blitt demonstrert, er ytterligere studier nødvendig for å undersøke rollen til autofagi i blokkering av apoptose. Som vist i figur 5D ACKR4a-demping økte effektorkaspasene (caspase7) og initiatorkaspasene (caspase8) betydelig. I tillegg hemmet ACKR4a overekspresjon caspase7 og caspase8 mRNA (figur 5E) og ACKR4a knockdown økte caspase7 og caspase8 betydelig hos sebrafisk (figur S2E og S2F). Tidligere studier har vist at Beclin-1 er en molekylær bryter som medierer apoptose- og autofagiprosesser,45 så involveringen av Beclin-1 i reguleringen av apoptose ble undersøkt. I vår studie nedregulerte Beclin-1-overuttrykk V. harveyi-indusert caspase8, mens Beclin-1-dempende oppregulerte V. harveyi-indusert caspase8 (figur 5F). Et interessant resultat ble funnet at caspase8 ble betydelig oppregulert etter 3 timer med V. harveyi-infeksjon; den ble igjen hemmet med økende infeksjonsvarighet, og LC3-II var negativt korrelert med caspase8 (figur 5G). I følge resultatene ovenfor induserte ACKR4a autofagi for å blokkere apoptotisk signalering og lette V. harveyi-infeksjon, og Beclin-1 kan være et potensielt mål i kaskaden av autofagi og apoptose.

Figur 5. ACKR4a induserer autofagi for å blokkere apoptose

Ap-1 forsterker ACKR4a-indusert autofagi ved V. harveyi-infeksjon

Deretter ble mekanismen til V. harveyi-infeksjon-indusert ACKR4a-ekspresjon undersøkt. Fire forskjellige ACKR4a-promotorplasmider ble først konstruert i henhold til promotorprediksjonssekvensene (figur 6A). Luciferaseanalysen viste at ACKR4a-p-3-aktiviteten var den høyeste (figur 6B). For å identifisere oppstrømsaktivatoren til ACKR4a-ekspresjon under V. harveyi-infeksjon, ble promoterregionen til ACKR4a analysert, og fant at ACKR4a har potensielle bindingssteder for Sp-1 og Ap-1 (Figur 6C). ACKR4a-luc-analysen viste at Sp-1 ikke kunne øke luciferaseaktiviteten og Ap-1 økte luciferaseaktiviteten (figur 6D og 6E), noe som økte muligheten for at ACKR4a kunne være et direkte mål for Ap -1. For å undersøke dette ble to luciferasevektorer bestående av mutant ACKR4a konstruert (figur 6F). Luciferaseanalysen viste at mutanter som mangler Ap-1-bindingsseter hemmet luciferaseaktiviteten i motsetning til villtype (Figur 6G). For å bekrefte at Ap-1 fremmer ACKR4a-uttrykk, dempet eller forbedret vi uttrykket av Ap-1 via overuttrykk eller knockdown, og ACKR4a-uttrykk ble vurdert i transfekterte MBrC-celler. Ap-1-demping reduserte V. harveyi-indusert ACKR4a-uttrykk signifikant (figur 6H), mens Ap-1-overuttrykk betydelig forbedret ACKR4a-uttrykk (figur 6I). Immunoblot-resultatene var i samsvar med qPCR-resultatene, Ap-1-overuttrykk økte uttrykket av ACKR4a, mens Ap-1-demping reduserte uttrykket av ACKR4a (figur 6J). ChIP-analyse viste at Ap-1 binder seg til ACKR4a-promotoren i MBrC-celler under normale fysiologiske forhold, og V. harveyi-stimulering forbedret bindingen av Ap-1 til ACKR4a-promotoren (Figur 6K). Resultatene ovenfor bekreftet at ACKR4a er et potensielt transkripsjonsmål for Ap-1. Funksjonen til Ap-1 i autofagi ble deretter utforsket; Ap-1-demping reduserte effektivt den V. harveyi-infeksjonsinduserte akkumuleringen av GFP-LC3 (Figur 6L), og den svekket også V. harveyi-infeksjonsindusert oppregulering av LC3-II (Figur 6M) ). CFU-analysen ble utført for å utforske rollen til Ap-1 i V. harveyi-infeksjon og fant at AP-1 letter V. harveyi-spredning (figur 6N). Til sammen indikerte resultatene ovenfor at Ap-1 aktiverer ACKR4a-transkripsjon og ekspresjon og bidrar til V. harveyi-infeksjonen.

Figur 6. Ap-1-forsterket ACKR4a-indusert autofagi ved V. harveyi-infeksjon

Figur 7. En arbeidsmodell for hvordan ACKR4a letter V. harveyi-infeksjon

DISKUSJON

ACKR-er har vist seg å være involvert i flere biologiske prosesser som regulering av kjemokinsystem, internalisering av kjemokinligand, intracellulær nedbrytning og inflammatorisk respons,4,26 som er viktig ikke bare for adaptiv immunitet, men også som en viktig komponent i det medfødte immunsystemet. .33,34 Rollen til ACKRer i den inflammatoriske responsen på bakteriell infeksjon hos fisk har imidlertid ikke blitt undersøkt. Denne studien viser for første gang at ACKR4a, et medlem av ACKR-familien, fremmer infeksjonen av V. harveyi til teleostfisk gjennom autofagi og apoptose. Mekanistisk ble transkripsjonen av ACKR4a oppregulert av transkripsjonsfaktoren AP-1. Deretter ble den oppregulerte ACKR4a synergisert med Beclin-1 for å indusere autofagi og transportert MyD88 til lysosomer for nedbrytning. I mellomtiden induserer ACKR4a autofagi for å blokkere apoptose og letter deretter V. harveyi-infeksjon (figur 7). Medfødt immunitet spiller en avgjørende rolle i å beskytte eukaryoter fra endogen og eksogen patogen invasjon.46 Som et resultat av langvarig eksponering for mikroorganismer, har fisk utviklet mer optimalisert medfødt immunitet for å beskytte dem mot infeksjon.47 TLRs gjenkjente PAMP når bakterieinfeksjon oppstår, og initierte en medfødt immunrespons via MyD88-avhengige og uavhengige veier, som induserte produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner for å eliminere bakteriell infeksjon. MyD88 er en essensiell adapter i TLR-signalering, med unntak av TLR3, alle pattedyr-TLR-er bruker MyD88 for å aktivere NF-kB-signalering.48 Derfor kan det være det mest effektive å direkte regulere MyD88. For eksempel hemmer S-1-acetylcystein IL-6-produksjonen ved å indusere nedbrytningen av MyD88. Tilsvarende har IRF3 og eIF3k hos fisk blitt rapportert å hemme NF-kB-signalering ved å målrette mot MyD88.42,49 Akkumulert bevis har også antydet at MyD88 var viktig for eliminering av bakterielle infeksjoner. For eksempel kunne ikke mus med MyD88-mangel gjenkjenne bakteriekomponentene og var svært mottakelige for S. aureus. 50 I tillegg har MyD88 også vist seg å være involvert i eliminering av bakterielle infeksjoner hos sebrafisk.41 Aktiveringen av det medfødte immunsystemet fremmer bakteriell clearance, som utgjør et stort selektivt press, og fremmer dem til å utvikle evnen til å undertrykke medfødt immunitet .51,52 Det er påvist at salmonella kan regulere immunresponser og manipulere inflammatoriske responser etter infeksjon av vertsceller. Salmonellavirulensen SpvC defosforylerer irreversibelt ERK, p38 og MAPK, og hemmer derved transkripsjonen av pro-inflammatoriske cytokiner.53 I denne studien ble den oppregulerte ACKR4a i V. harveyi-infiserte M. miiuy kombinert med MyhorD88 til inhibisjon av phosptyl. og blokkere NF-kB-signalering. Dette antyder at bakterier også kan undertrykke den medfødte immuniteten til fisk ved å forstyrre stabiliteten til adaptere i TLR-signaleringen med det formål å unnvike immunforsvaret.

Autofagi og apoptose er to anerkjente mekanismer for motstand mot bakteriell invasjon, med antimikrobiell autofagi som en barriere mot invaderende mikroorganismer. PRR-er kan indusere autofagi på forskjellige stadier av vert-bakteriekontakt, og hemme den intracellulære veksten av bakterier.54 Omvendt har bakterier også utviklet effektive mekanismer for å forhindre, bekjempe eller styre autofagi. Disse mekanismene involverer ofte målretting mot Beclin-1 for å blokkere autofagi,55 forhindre modning av autofagosomer56 og til og med aktivere autofagi i noen tilfeller for å gi næring for bakterievekst.57 På en annen måte fant vi at V. harveyi induserte Beclin{{6} }aktivert autofagi via ACKR4a, som retter seg mot MyD88 for autofagisk degradering, og blokkerer derved NF-kB-signalering og fremmer selvreplikasjon. En annen forsvarsstrategi er programmert celledød (apoptose), som aktiveres når patogener bruker vertsceller for overlevelse og replikasjon. Mycobacterium-infeksjon av makrofager forårsaker for eksempel apoptose, som bidrar til eliminering av bakterier fra cellene.58 I tillegg ødelegger TNF-a-mediert makrofagapoptose det intracellulære miljøet for mycobacterium-replikasjoner og reduserer veksthastigheten til infisert mycobacterium.59 For å bekjempe overlevelsespresset ved apoptose, koder mange vellykkede patogener for gener hvis produkter hemmer apoptose i vertsceller, og opprettholder dermed levedyktigheten for patogenreplikasjon.60 Selv om disse mekanismene er godt studert hos pattedyr, er lite kjent om bakteriell hemming av apoptose hos fisk. I vår studie spiller V. harveyi-indusert autofagi en rolle i apoptotiske stadier og blokkerer apoptotisk signalering. Apoptose og autofagi både fremmer og motvirker hverandre. I pre-apoptotiske stadier blokkerer celler den apoptotiske banen og reduserer nivået av apoptose gjennom autofagi, og opprettholder dermed fordelen. Autofagi utløser ikke celledød i de tidlige stadiene av apoptose, men fremmer også celleoverlevelse.61 Autofagi under det sene stadiet av apoptose kan fremme apoptose, og deretter hemmer den økte apoptosen forekomsten av autofagi gjennom migrering av p53- og BH3-veier.62 Den biologiske prosessen er tett regulert, inkludert samspillet mellom autofagi og apoptose. Tallrike regulatoriske gener er involvert i den interaktive responsmekanismen for apoptose og autofagi, Beclin-1 er en av dem.63 I tillegg til reguleringen av autofagi-initiering, er Beclin-1 også involvert i å regulere apoptose.45 ,64 Studier har vist at Beclin-1 mister sin evne til å motstå apoptose etter å ha blitt spaltet av aktiverte caspaser.65 Dette antyder at Beclin-1 spiller en viktig rolle som en ''molekylær bryter'' i reguleringen av autofagi og apoptose.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

V. harveyi er en marin gramnegativ bakterie som utgjør en alvorlig trussel mot helsen til marine akvakulturfiskerier. V. harveyi-infeksjon forårsaker hjernehinnebetennelse og hjernebetennelse hos fisk,66 og V. harveyi-infeksjon forårsaker cerebral overbelastning i grouper.67 Som respons på bakteriell infeksjon er de medfødte immun- og inflammatoriske responsene de viktigste forsvarssystemene til fisk. Imidlertid har bakterier også utviklet evnen til å unngå immunitet i symbiose med vertene deres. Oppsummert viser resultatene våre en mekanisme for V. harveyi-immununndragelse hos fisk. ACKR4a induserer autofagi for å hemme NF-kB-signalering og blokkere apoptose, som igjen letter V. harveyi-infeksjon hos teleostfisk. Dette er også første gang gram-negative bakterier har blitt funnet å unngå immunitet ved samtidig å regulere medfødt immunitet og apoptose via autofagi. Denne studien gir innsikt i å forstå effekten av autofagi på vertsbakterieinteraksjon i teleostfisk og gir et perspektiv på pattedyrresistens mot bakteriell infeksjon.

REFERANSER

1. Dinarello, CA (2018). Oversikt over IL-1-familien i medfødt betennelse og ervervet immunitet. Immunol. Åp 281, 8–27.

2. Gaidt, MM, Ebert, TS, Chauhan, D., Ramshorn, K., Pinci, F., Zuber, S., O'Duill, F., Schmid-Burgk, JL, Hoss, F., Buhmann, R., et al. (2017). DNA-inflammasomet i humane myeloidceller initieres av et STING-celledødsprogram oppstrøms for NLRP3. Celle 171, 1110–1124.e18.

3. Xiao, TS (2017). Medfødt immunitet og betennelse. Celle. Mol. Immunol. 14, 1–3.

4. Koropatnick, TA, Engle, JT, Apicella, MA, Stabb, EV, Goldman, WE og McFallNgai, MJ (2004). Mikrobiell faktor-mediert utvikling i en vertsbakteriell mutualisme. Science 306, 1186–1188.

5. Janeway, CA (1989). Nærmer du deg asymptoten? Evolusjon og revolusjon innen immunologi. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54, 1–13.

6. Vallabhapurapu, S. og Karin, M. (2009). Regulering og funksjon av NF-kB transkripsjonsfaktorer i immunsystemet. Annu. Rev. Immunol. 27, 693–733.

7. Krakauer, T. (2019). Inflammasomer, autofagi og celledød: treenigheten av medfødt vertsforsvar mot intracellulære bakterier. Mediatorer Inflamm. 2019, 2471215.

8. Hurley, JH og Young, LN (2017). Mekanismer for initiering av autofagi. Annu. Rev. Biochem. 86, 225–244.

9. He, X., Zhu, Y., Zhang, Y., Geng, Y., Gong, J., Geng, J., Zhang, P., Zhang, X., Liu, N., Peng, Y. ., et al. (2019). RNF34 fungerer i immunitet og selektiv mitofagi ved å målrette MAVS for autofagisk nedbrytning. EMBO J. 38, 1009788–e101018.

10. Yin, L., Lv, M., Qiu, X., Wang, X., Zhang, A., Yang, K. og Zhou, H. (2021). IFN-G manipulerer NOD1-mediert interaksjon mellom autofagi og Edwardsiella piscicida for å øke intracellulær clearance hos fisk. J. Immunol. 207, 1087-1098.

11. Mansilla-Pareja, ME, Bongiovanni, A., Lafont, F., og Colombo, MI (2017). Endringer av Coxiella burnetii replikative vakuolemembranintegritet og samspill med autofagibanen. Front. Celle. Infisere. Microbiol. 7, 112.

12. Bravo-Santano, N., Ellis, JK, Mateos, LM, Calle, Y., Keun, HC, Behrends, V., og Letek, M. (2018). Intracellulær Staphylococcus aureus modulerer vertens sentrale karbonmetabolisme for å aktivere autofagi. mSphere 3, 003744– 003818.

13. Winchell, CG, Dragan, AL, Brann, KR, Onyilagha, FI, Kurten, RC og Voth, DE (2018). Coxiella burnetii undergraver p62/sekvestosom 1 og aktiverer Nrf2-signalering i humane makrofager. Infisere. Immun. 86, e00608–e00617.

14. Lee, HK, Lund, JM, Ramanathan, B., Mizushima, N. og Iwasaki, A. (2007). Autofagi-avhengig viral gjenkjenning av plasmacytoide dendrittiske celler. Science 315, 1398–1401.

15. Jounai, N., Takeshita, F., Kobiyama, K., Sawano, A., Miyawaki, A., Xin, KQ, Ishii, KJ, Kawai, T., Akira, S., Suzuki, K., og Okuda, K. (2007). Atg5 Atg12-konjugatet er assosiert med medfødte antivirale immunresponser. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 14050–14055.

16. Schaaf, MBE, Keulers, TG, Vooijs, MA og Rouschop, KMA (2016). LC3/GABARAP-familieproteiner: autofagi-(u)relaterte funksjoner. FASEB J 30, 3961–3978.

17. Chen, Z., Wang, T., Liu, Z., Zhang, G., Wang, J., Feng, S., og Liang, J. (2015). Inhibering av autofagi av MiR-30A indusert av Mycobacteria tuberculosis som en mulig mekanisme for immunflukt i humane makrofager. Jpn. J. Infect. Dis. 68, 420–424.

18. Kubori, T., Bui, XT, Hubber, A. og Nagai, H. (2017). Legionella RavZ spiller en rolle i å forhindre ubiquitin-rekruttering til bakterieholdige vakuoler. Front. Celle. Infisere. Microbiol. 7, 384.

19. Danial, NN, og Korsmeyer, SJ (2004). Celledød: kritiske kontrollpunkter. Celle 116, 205–219.

20. Salvesen, GS og Ashkenazi, A. (2011). Øyeblikksbilde: caspases. Celle 147, 476–476.e1.

21. Zhou, ZJ og Sun, L. (2016). Edwardsiella tarda-indusert hemming av apoptose: en strategi for intracellulær overlevelse. Front. Celle. Infisere. Microbiol. 6, 76.

22. Gu¨ nther, SD, Fritsch, M., Seeger, JM, Schiffmann, LM, Snipas, SJ, Coutelle, M., Kufer, TA, Higgins, PG, Hornung, V., Bernardini, ML, et al. (2020). Cytosoliske gramnegative bakterier forhindrer apoptose ved å hemme effektorkaspaser gjennom lipopolysakkarid. Nat. Microbiol. 5, 354–367.

23. Wierzbicki, IH, Campeau, A., Dehaini, D., Holay, M., Wei, X., Greene, T., Ying, M., Sands, JS, Lamsa, A., Zuniga, E., et al. (2019). Gruppe A streptokokk S-protein bruker røde blodceller som immun kamuflasje og er en kritisk determinant for immununnvikelse. Cell Rep. 29, 2979–2989.e15.

24. Chen, J., Lu, Y., Ye, X., Emam, M., Zhang, H. og Wang, H. (2000). Nåværende fremskritt innen Vibrio harveyi quorum sensing som mål for oppdagelse av medisiner. Eur. J. Med. Chem. 207, 112741.

25. Kimura, T., Jain, A., Choi, SW, Mandell, MA, Schroder, K., Johansen, T., og Deretic, V. (2015). TRIM-mediert presisjonsautofagi retter seg mot cytoplasmatiske regulatorer av medfødt immunitet. J. Cell Biol. 210, 973-989.

26. Zlotnik, A. og Yoshie, O. (2012). Kjemokin-superfamilien besøkte igjen. Immunity 36, 705–716.

27. Ulvmar, MH, Hub, E. og Rot, A. (2011). Atypiske kjemokinreseptorer. Exp. Cell Res. 317, 556–568.

28. Bonecchi, R., Savino, B., Borroni, EM, Mantovani, A., og Locati, M. (2010). Kjemokin lokkereseptorer: strukturfunksjon og biologiske egenskaper. Curr. Topp. Microbiol. Immunol. 341, 15–36.

29. Comerford, I., Litchfield, W., Harata-Lee, Y., Nibbs, RJB og McColl, SR (2007). Regulering av kjemotaktiske nettverk av 'atypiske' reseptorer. Bioessays 29, 237–247.

30. Horuk, R., Chitnis, CE, Darbonne, WC, Colby, TJ, Rybicki, A., Hadley, TJ og Miller, LH (1993). En reseptor for malariaparasitten Plasmodium vivax: erytrocyttkjemokinreseptoren. Science 261, 1182–1184.

31. Bonini, JA, Martin, SK, Dralyuk, F., Roe, MW, Philipson, LH, og Steiner, DF (1997). Kloning, ekspresjon og kromosomal kartlegging av en ny human CC-kjemokinreseptor (CCR10) som viser høyaffinitetsbinding for MCP-1 og MCP-3. DNA Cell Biol. 16, 1249–1256.

32. Nibbs, RJ, Wylie, SM, Yang, J., Landau, NR, og Graham, GJ (1997). Kloning og karakterisering av en ny promiskuøs human beta-kjemokinreseptor D6. J. Biol. Chem. 272, 32078–32083.

33. Burns, JM, Summers, BC, Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, MET, Sunshine, MJ, Littman, DR, Kuo, CJ, et al. (2006). En ny kjemokinreseptor for SDF-1 og I-TAC er involvert i celleoverlevelse, celleadhesjon og tumorutvikling. J. Exp. Med. 203, 2201–2213.

34. Gosling, J., Dairaghi, DJ, Wang, Y., Hanley, M., Talbot, D., Miao, Z., og Schall, TJ (2000). Nyskapende: identifikasjon av en ny kjemokinreseptor som binder dendritiske celler og T-celleaktive kjemokiner inkludert ELC, SLC og TECK. J. Immunol. 164, 2851–2856.

35. Hall, RA, Premont, RT og Lefkowitz, RJ (1999). Heptahelisk reseptorsignalering: utover G-proteinparadigmet. J. Cell Biol. 145, 927–932.

36. Brzostowski, JA, og Kimmel, AR (2001). Signalering ved null G: G-proteinuavhengige funksjoner for 7-TM-reseptorer. Trender Biochem. Sci. 26, 291-297.

37. Sun, Y., Huang, J., Xiang, Y., Bastepe, M., Ju¨ppner, H., Kobilka, BK, Zhang, JJ, og Huang, XY (2007). Doseavhengig bytte fra G-proteinkoblet til G-proteinuavhengig signalering ved en GPCR. EMBO J. 26, 53–64.

38. Nibbs, RJB og Graham, GJ (2013). Immunregulering av atypiske kjemokinreseptorer. Nat. Rev. Immunol. 13, 815–829.

39. Lewis, BP, Burge, CB og Bartel, DP (2005). Bevart frøparing, ofte flankert av adenosiner, indikerer at tusenvis av menneskelige gener er mikroRNA-mål. Celle 120, 15–20.

40. Friedman, RC, Farh, KKH, Burge, CB og Bartel, DP (2009). De fleste mRNA fra pattedyr er bevarte mål for mikroRNA. Genome Res. 19, 92–105.

41. Denli, AM, Tops, BBJ, Plasterk, RHA, Ketting, RF og Hannon, GJ (2004). Behandling av primære mikroRNAer av mikroprosessorkomplekset. Nature 432, 231–235.

42. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. og Xu, T. (2022). eIF3k hemmer NF-kB-signalering ved å målrette MyD88 for ATG5-mediert autofagisk degradering i teleostfisk. J. Biol. Chem. 298, 101730.

43. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J. og Xu, T. (2017). Induserbart mikroRNA-214 bidrar til undertrykkelse av NF-kB-mediert inflammatorisk respons via målretting mot myd88-genet i fisk. J. Biol. Chem. 292, 5282–5290.

44. Gay, NJ, Symmons, MF, Gangloff, M. og Bryant, CE (2014). Montering og lokalisering av Toll-lignende reseptorsignalkomplekser. Nat. Rev. Immunol. 14, 546–558.

45. McKnight, NC, og Zhenyu, Y. (2013). Beclin 1, er en essensiell komponent og masterregulator av PI3K-III innen helse og sykdom. Curr. Pathobiol. Rep. 1, 231–238.

46. ​​Mutwiri, G., Gerdts, V., Lopez, M. og Babiuk, LA (2007). Medfødt immunitet og nye hjelpestoffer. Rev. Sci. Tech. 26, 147–156.

47. Buchmann, K. (2014). Evolusjon av medfødt immunitet: ledetråder fra virvelløse dyr via fisk til pattedyr. Front. Immunol. 5, 459.

48. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J. og Xu, T. (2017b). MicroRNA-3570 modulerer NF-kB-banen i teleostfisk ved å målrette mot MyD88. J. Immunol. 198, 3274–3282.

49. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. og Xu, T. (2020). IRF3 og IRF8 regulerer NF-kB-signalering ved å målrette MyD88 i teleostfisk. Front. Immunol. 11, 606.

50. Takeuchi, O., Hoshino, K. og Akira, S. (2000). Nyskapende: Mus med TLR2-mangel og MyD88-mangel er svært utsatt for Staphylococcus aureus-infeksjon. J. Immunol. 165, 5392–5396.

51. Keszei, AFA, Tang, X., McCormick, C., Zeqiraj, E., Rohde, JR, Tyers, M., og Sicheri, F. (2014). Strukturen til et SspH1-PKN1-kompleks avslører grunnlaget for vertssubstratgjenkjenning og aktiveringsmekanismen for en bakteriell E3 ubiquitinligase. Mol. Cell Biol. 34, 362–373.

52. Gu¨ nster, RA, Matthews, SA, Holden, DW og Thurston, TLM (2017). SseK1 og SseK3 type III sekresjonssystem effektorer hemmer NFkB signalering og nekroptotisk celledød i salmonella-infiserte makrofager. Infisere. Immun. 85, e00010–e00017.

53. Mazurkiewicz, P., Thomas, J., Thompson, JA, Liu, M., Arbibe, L., Sansonetti, P., og Holden, DW (2008). SpvC er en Salmonella-effektor med fosfotreoninlyaseaktivitet på vertsmitogenaktiverte proteinkinaser. Mol. Microbiol. 67, 1371–1383.

54. Saitoh, T. og Akira, S. (2010). Regulering av medfødte immunresponser av autofagi-relaterte proteiner. J. Cell Biol. 189, 925–935.

55. Orvedahl, A., Alexander, D., Tallo´czy, Z., Sun, Q., Wei, Y., Zhang, W., Burns, D., Leib, DA, og Levine, B. (2007) ). HSV-1 ICP34.5 gir nevrovirulens ved å målrette mot Beclin 1 autophagy-proteinet. Cell Host Microbe 1, 23–35.

56. Kyei, GB, Dinkins, C., Davis, AS, Roberts, E., Singh, SB, Dong, C., Wu, L., Kominami, E., Ueno, T., Yamamoto, A., et al. (2009). Autofagi-veien krysser HIV-1-biosyntesen og regulerer virale utbytter i makrofager. J. Cell Biol. 186, 255–268.

57. Niu, H., Xiong, Q., Yamamoto, A., Hayashi Nishino, M., og Rikihisa, Y. (2012). Autofagosomer indusert av et bakterielt Beclin 1-bindende protein letter obligatorisk intracellulær infeksjon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 20800–20807.

58. Hussain, MA, Datta, D., Singh, R., Kumar, M., Kumar, J., og Mazumder, S. (2019). TLR-2-mediert cytosolisk-Ca2+-bølge aktiverer ER-stress-superoksid-NO-signalosom som øker TNF-a-produksjonen som fører til apoptose av Mycobacterium smegmatis-infiserte fiskemakrofager. Sci. Rep. 9, 12330.

59. Lee, J., Hartman, M. og Kornfeld, H. (2009). Makrofageapoptose ved tuberkulose. Yonsei Med. J. 50, 1–11.

60. McCormick, AL (2008). Kontroll av apoptose av humant cytomegalovirus. Curr. Topp. Microbiol. Immunol. 325, 281-295.

61. Kuma, A., Hatano, M., Matsui, M., Yamamoto, A., Nakaya, H., Yoshimori, T., Ohsumi, Y., Tokuhisa, T., og Mizushima, N. (2004) . Rollen til autofagi under den tidlige neonatale sulteperioden. Nature 432, 1032–1036.

62. Marin˜ o, G., Niso-Santano, M., Baehrecke, EH, og Kroemer, G. (2014). Selvforbruk: samspillet mellom autofagi og apoptose. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 81–94.

63. Furuya, D., Tsuji, N., Yagihashi, A. og Watanabe, N. (2005). Beclin-1 forsterket cis-diamindiklorplatinum-indusert apoptose via forsterket caspase 9-aktivitet. Exp. Cell Res. 307, 26–40.

64. Pattingre, S., Tassa, A., Qu, X., Garuti, R., Liang, XH, Mizushima, N., Packer, M., Schneider, MD, og ​​Levine, B. (2005). Bcl-2 antiapoptotiske proteiner hemmer Beclin 1-avhengig autofagi. Celle 122, 927–939.

65. Djavaheri-Mergny, M., Maiuri, MC og Kroemer, G. (2010). Krysstale mellom apoptose og autofagi ved caspase-mediert spalting av Beclin 1. Onkogen 29, 1717–1719.

66. Grimes, DJ, Gruber, SH og May, EB (1985). Eksperimentell infeksjon av sitronhaier, Negaprion brevirostris (Poey), med Vibrio-arter. J. Fish. Dis. 8, 173–180.

67. Mohamad, N., Mohd Roseli, FA, Azmai, MNA, Saad, MZ, Md Yasin, IS, Zulkiply, NA og Nasruddin, NS (2019). Naturlig samtidig infeksjon av Vibrio harveyi og V. alginolyticus i dyrkede hybride groupers i Malaysia. J. Aquat. Anim. Helse 31, 88–96.