Aktiv overgang av fryktminnefase fra rekonsolidering til utryddelse gjennom ERK-mediert forebygging av rekonsolidering

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Degjenfinning av fryktminneinduserer to motsatte minneprosesser, dvs. rekonsolidering og ekstinksjon. Kort gjenfinning induserer rekonsolidering for å opprettholde ellerforbedre fryktminnet,mens langvarig henting slukker dette minnet. Selv om mekanismene for rekonsolidering og ekstinksjon har blitt undersøkt, er det fortsatt ukjent hvordan fryktminnefaser byttes fra rekonsolidering til utryddelse under minnehenting. Her viser vi at en ekstracellulær signalregulert kinase (ERK)-avhengig minneovergangsprosess etter gjenfinning regulerer bytte av minnefaser fra rekonsolidering til ekstinksjon ved å forhindre induksjon av rekonsolidering i en hemmende unngåelse (IA) oppgave hos hannmus. For det første ble overgangsminnefasen, som kansellerer induksjonen av rekonsolidering, men er utilstrekkelig for anskaffelse av ekstinksjon, identifisert etter rekonsolidering, men før ekstinksjonsfaser. For det andre viste rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinksjonsfasene etter minneinnhenting distinkte molekylære og cellulære signaturer gjennom cAMP-responsivt elementbindende protein (CREB) og ERK-fosforylering i amygdala, hippocampus og medial prefrontal cortex (mPFC). Rekonsolideringsfasen viste økt CREB-fosforylering, mens ekstinksjonsfasen viste flere nevrale populasjoner med forskjellige kombinasjoner av CREB- og/eller ERK-fosforylering, i disse hjerneområdene. Interessant nok viste de tre minnefasene, inkludert overgangsfasen, forbigående ERK-aktivering umiddelbart etter henting. Det viktigste er at blokkeringen av ERK i amygdala, hippocampus eller mPFC i overgangsminnefasen desinhiberte rekonsolidering-indusert forbedring av IA-minne. Disse observasjonene antyder at ERK-signalveien aktivt regulerer overgangen til minnefasen fra rekonsolidering til utryddelse, og denne prosessen fungerer som en bryter som kansellerer rekonsolidering av frykthukommelse.

Stikkord: ERK; utryddelse;fryktminne; rekonsolidering; overgang

1Department of Bioscience, Fakultet for biovitenskap, Tokyo University of Agriculture, Tokyo 156-8502, Japan, og

2Graduate School of Agriculture and Life Sciences, University of Tokyo, Tokyo 113-8657, Japan

Betydningserklæring

Henting av fryktminneinduserer to motsatte minneprosesser; rekonsolidering og utryddelse. Rekonsolidering opprettholder/forbedrer fryktminnet, mens utryddelse svekker fryktminnet. Det er fortsatt ukjent hvordan minnefaser byttes fra rekonsolidering til utryddelse under henting. Her identifiserte vi en aktiv minneovergangsprosess som fungerer som en bryter som hemmer rekonsolidering. Denne minneovergangsfasen viste en forbigående økning av ekstracellulær signalregulert kinase (ERK) fosforylering i amygdala, hippocampus og medial prefrontal cortex (mPFC). Interessant nok desinhiberte hemming av ERK i disse regionene i overgangsfasen den rekonsolideringsmedierte forbedringen av inhibitorisk unngåelse (IA) minne. Disse funnene antyder at overgangsminneprosessen aktivt regulerer bytte av fryktminnefaser av fryktminne ved å forhindre induksjon av rekonsolidering gjennom aktivering av ERK-signalveien.

Introduksjon

Henting av minneer ikke en passiv prosess, men er snarere en dynamisk prosess som tillater vedlikehold, styrking, svekkelse eller endring/oppdatering av et originalminne (Misanin et al., 1968; Schneider og Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus et al. , 1979; Gordon, 1981; Nader et al., 2000; Nader og Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima et al., 2014). Viktigere er at et hentet betinget fryktminne ved kort gjeneksponering for den betingede stimulus (CS) blir labilt og krever genekspresjonsavhengig rekonsolidering for vedlikehold eller forbedring (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki et al., 2004; Tronel et al., 2005; Fukushima et al., 2014). Omvendt induserer kontinuerlig eller gjentatt re-eksponering for CS minneutryddelse, noe som svekker fryktminnet (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers og Davis, 2002). Dermedgjenfinning av fryktminneinduserer to motsatte minneprosesser, dvs. rekonsolidering og ekstinksjon, selv om begge prosessene induseres ved re-eksponering for en identisk CS, men er forskjellige i henhold til varigheten av re-eksponering til CS.

Det vanlige og kritiske biokjemiske trekk ved rekonsolidering og utryddelse er kravet til cAMP-responsivt elementbindende protein (CREB)-mediert genuttrykk (Mamiya et al., 2009). Interessant nok har vi vist kontrasterende molekylære, anatomiske og atferdsmessige signaturer mellom rekonsoliderings- og utryddelsesfasene av kontekstuelt fryktminne (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009). Blokkering av proteinsyntese under rekonsolideringsfasen forstyrrer det opprinnelige fryktminnet, mens blokkering av proteinsyntese under utryddelsesfasen ikke klarer å gjøre dette, selv om det kontekstuelle fryktminnet ble reaktivert. Kravet til hjerneregioner som viser aktivering av CREB-mediert genuttrykk er forskjellig mellom rekonsolidering og utryddelse; rekonsolidering avhenger av amygdala og hippocampus, mens utryddelse er avhengig av amygdala og medial prefrontal cortex (mPFC). Imidlertid er tidsforløpet for amygdaloid CREB-aktivering forskjellig mellom rekonsoliderings- og ekstinksjonsminnefasene. Disse observasjonene antydet at rekonsoliderings- og utryddelsesfasene ikke er uavhengige, men snarere samhandler med hverandre. Interessant nok har nyere studier identifisert et tidsvindu (overgangsfase) som ikke viser aktivering av ekstracellulær signalregulert kinase (ERK) i amygdala etter rekonsolidering, men før ekstinksjonsfasene etter gjenfinning av auditivt fryktminne (Merlo et al., 2018) ). Til sammen antyder disse funnene de mulige mekanismene som gjør at minnefaser byttes fra rekonsolidering til utryddelse undergjenfinning av fryktminne. Med andre ord er det mulig at minneovergangsprosessen aktivt regulerer denne bryteren.

I en oppgave med hemmende unngåelse (IA) får mus et elektrisk fotstøt etter at de går inn i et mørkt rom fra et lett rom og dannerhukommelsefor å unngå det mørke rommet. Tidligere, ved å bruke denne oppgaven, viste vi at rekonsoliderings- og ekstinksjonsfasene kan skjelnes på tidspunktet når en mus kommer inn i et mørkt rom fra et lyst rom under en gjeneksponeringsøkt (Fukushima et al., 2014). Derfor lar denne oppgaven oss karakterisere de perspektiviske molekylære signaturene til rekonsoliderings- og ekstinksjonsfasene, i motsetning til det klassiske kontekstuelle fryktkondisjoneringsparadigmet der reaktiveringen av betinget fryktminne ved re-eksponering for CS setter i gang både rekonsolidering og ekstinksjon; kort (3 min) re-eksponering for den betingede konteksten induserer rekonsolidering, mens lang (30 min) eller gjentatt re-eksponering for denne konteksten induserer ekstinksjon (Eisenberg et al., 2003; Pedreira og Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee et al., 2008; Mamiya et al., 2009). Videre fant vi at det hentede IA-minnet forbedres gjennom rekonsolidering av minnet i denne oppgaven (Fukushima et al., 2014).

For å forstå mekanismen for overgangen fra rekonsolidering til utryddelse i løpet avgjenfinning av fryktminne, tok vi sikte på å identifisere og karakterisere de molekylære, cellulære og atferdsmessige signaturene til rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinksjonsfasene til IA-minne. Vi analyserte aktiveringen av CREB og ERK i amygdala, hippocampus og mPFC i rekonsoliderings-, overgangs- og utryddelsesfasene og undersøkte rollene til ERK-aktivering i disse minneprosessene.

Materialer og metoder

Mus Alle eksperimenter ble utført i henhold til Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Japan Neuroscience Society og Tokyo University of Agriculture). Alle dyreforsøk utført i denne studien ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Tokyo University of Agriculture (autorisasjon #280037). Alle kirurgiske prosedyrer ble utført under Nembutal anestesi og alt ble gjort for å minimere lidelse. C57BL/6N hannmus ble oppnådd fra Charles River. Musene ble holdt i bur på fem eller seks, holdt på en 12/12 timers lys/mørke-syklus, og ga tilgang til mat og vann ad libitum. Musene var minst åtte uker gamle da de ble testet. Testing ble utført under den lette fasen av syklusen. Alle eksperimenter ble utført blindt for behandlingstilstanden til musene.

IA-test Gjennomgangs IA-apparatet (OHARA Pharmaceutical) besto av en boks med separate lyse og mørke rom (begge 15,5 12,5 11,5 cm). Lysrommet ble opplyst av et fluorescerende lys (2500 lux; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang et al., 2011; Ishikawa et al., 2016). Før starten av IA-trening ble musene håndtert individuelt i 2 minutter hver dag i en uke. Under treningsøktene fikk hver mus venne seg til det lyse rommet i 30 s, og giljotinedøren ble hevet for å gi tilgang til det mørke rommet. Latens for å gå inn i det mørke rommet ble ansett som et mål på oppkjøp. Så snart musa var kommet inn i det mørke rommet, ble giljotinedøren lukket. Etter 5 s ble det levert fotsjokk (0,2 mA) i en total periode på 2 s (trening). 24 timer etter treningsøkten ble musen plassert tilbake i det lyse rommet til den kom inn i det mørke rommet (gjennomsnittlig 459 6 15.49 s). Umiddelbart etter at musen hadde gått inn i det mørke rommet, ble giljotinedøren lukket og musen ble værende i det mørke rommet i varierende tid (0, 1 eller 10 min) uten fotsjokk (reaktivering). Minnet ble vurdert 48 timer senere [postreaktiverings langtidsminne (PR-LTM) test] som overgangslatens for musen til å gå inn i det mørke rommet når det ble erstattet i det lyse rommet, som ved reaktivering.

For det første eksperimentet undersøkte vi effekten av proteinsyntesehemming etter reaktivering (gjeneksponering for det mørke rommet i 0, 1 eller 10 min; fig. 1). Proteinsyntesehemmeren anisomycin (ANI; Wako) ble oppløst i saltvann (pH justert til 7,0–7,4 med NaOH). Musene ble trent som beskrevet ovenfor, og 24 timer senere mottok de kjøretøy (VEH) eller ANI (150 mg/kg, ip) umiddelbart etter gjeneksponering for det mørke rommet i 0, 1 eller 10 minutter uten fotsjokk (reaktivering). Ved denne dosen hemmer ANI 0,90 prosent av proteinsyntesen i hjernen i løpet av de første 2 timene (Flood et al., 1973). 48 timer etter reaktiveringsøkten ble individuelle mus nok en gang plassert i lysrommet, og overgangslatens ble vurdert.

For det andre eksperimentet [fosforylert CREB (pCREB) og fosforylert ERK (pERK) immunhistokjemi; fig. 2–5], undersøkte vi hjerneregionene som ble aktivert etter gjeneksponering for lyset (til musene kom inn i det mørke rommet, gjeneksponering for det mørke rommet i 0 min) eller mørkt rom (gjen- eksponering for det mørke rommet i 1 eller 10 min). Musene ble delt inn i fire Fukushima et al. · Transition of Fear Memory Phases after Retrieval J. Neurosci., 10. februar 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289grupper. 24 timer etter trening ble individuelle mus eksponert for det lyse rommet og deretter oppholdt seg i det mørke rommet etter at de kom inn fra det mørke rommet [reaktivering: 0 min i det mørke rommet, rekonsolidering (Recon) gruppe; 1 min, overgangs (Tran) gruppe; 10 min, ekstinksjon (Ext) gruppe]. En annen gruppe mus ble ikke returnert til det lyse/mørke rommet [ikke-reaktivert (NR) gruppe]. Musene ble deretter bedøvet med Nembutal (750 mg/kg, ip) 5, 15 eller 30 minutter etter reaktivering.

For det tredje eksperimentet (mikroinfusjon av U{{20}}126; Fig. 6,7), undersøkte vi effekten av ERK-hemming i amygdala, hippocampus eller mPFC på rekonsolidering/forsterkning av hukommelse, overgang, og utryddelse. MEK-hemmeren U0126 (Sigma-Aldrich) ble oppløst i kunstig cerebrospinalvæske inneholdende tre dråper Tween 80 (Sigma) i 2,5 ml 7,5 prosent dimetylsulfoksid (Wako) og justert til pH 7,4 med NaOH. Musene ble trent som beskrevet ovenfor, og 24 timer senere ble de plassert tilbake i lysrommet (reaktivering). Musene ble mikroinfundert med U0126 (1 mg) eller VEH inn i de forskjellige hjerneområdene umiddelbart etter (fig. 6A, C, E-H, 7A-C) eller 30 minutter etter (fig. 6B, D) reaktivering. 48 timer etter reaktivering ble individuelle mus nok en gang plassert i lysrommet, og crossover latens ble vurdert (PR LTM). Mikroinfusjoner i hippocampus og mPFC (0,5 ml) ble gjort med en hastighet på 0,25 ml/min. Mikroinfusjoner i amygdala (0,2 ml) ble gjort med en hastighet på 0,1 ml/min. Injeksjonskanylen ble stående på plass i 2 minutter etter mikroinfusjon, og musene ble deretter returnert til hjemmeburene. MEK-hemmeren SL327 (Santa Cruz Biotechnology) ble oppløst i dimetylsulfoksid og fortynnet med saltvann. Musene ble trent som beskrevet ovenfor, og 24 timer senere ble individuelle mus plassert tilbake i lysrommet (reaktivering). Musene ble systemisk injisert med SL327 (10 eller 20 mg/kg) eller VEH umiddelbart etter reaktivering (fig. 7D–F). 48 timer etter reaktivering ble individuelle mus nok en gang plassert i lysrommet, og crossover latens ble vurdert (PR-LTM).

Immunhistokjemi ble utført som beskrevet tidligere (Mamiya et al., 2009; Suzuki et al., 2011; Zhang et al., 2011; Fukushima et al., 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 2019). Etter bedøvelse ble alle mus perfusert med 4 prosent paraformaldehyd. Hjernene ble fjernet, fiksert over natten, overført til 30 prosent sukrose og lagret ved 4 grader. Koronale seksjoner (30 mm) ble kuttet i en kryostat.

For pCREB- og pERK-farging ble frittflytende seksjoner behandlet med 1 prosent H2O2 og inkubert over natten med et kanin polyklonalt anti-fosfo-CREB (serin 133; S133) antistoff (1:1000; #{{10 }}, Millipore) og/eller kanin monoklonalt anti-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) antistoff (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) i blokkeringsløsning (fosfatbufret saltvann pluss 1 prosent geiteserumalbumin, 1 mg/ml bovint serumalbumin og 0,05 prosent Triton X-100). Seksjonene ble vasket med fosfatbufret saltvann og inkubert med pepperrotperoksidase-konjugert esel-anti-kanin IgG (1:500; Jackson ImmunoResearch) for pCREB eller pepperrotperoksidase-konjugert geit-anti-kanin IgG for pERK i 1 time ved romtemperatur. pCREB-signaler ble forsterket av biotin-tyramid og visualisert ved bruk av Alexa Fluor-konjugert streptavidin (Invitrogen). pERK-signaler ble forsterket med TSA-FCM (Invitrogen). Seksjonene ble montert på objektglass og dekkglass ved bruk av et monteringsmedium (Millipore).

Kvantifisering ble utført som beskrevet tidligere (Frankland et al., 2006; Fukushima et al., 2014; Mamiya et al., 2009; Zhang et al., 2011; Suzuki et al., 2008). Strukturer ble definert anatomisk i henhold til atlaset til Franklin og Paxinos (1997). Alle immunreaktive nevroner ble telt av en eksperimentator som var blind for behandlingstilstanden

Resultater

Karakterisering av minnefaser etter henting i IA-oppgaven

IA-oppgaven lar oss skille mellom rekonsoliderings- og utryddelsesfasene på tidspunktet når en mus kommer inn i et mørkt rom fra et lysrom (Fukushima et al., 2014). For å forstå mekanismen som ligger til grunn for bytte av minnefaser fra rekonsolidering til utryddelse, karakteriserte vi IA-minnefasene etter minneinnhenting ved å undersøke effektene av å hemme proteinsyntesen som kreves for rekonsolidering og utryddelse av IA-minne (Fukushima et al., 2014). Musene ble først plassert i lysrommet. 5 s etter at de kom inn i den mørke kupeen, ble det levert et kort elektrisk fotstøt (trening). Musene ble eksponert på nytt for det lyse rommet 24 timer etter treningen (reaktiveringsøkt; Fig. 1A) og deres crossover-latens for å gå inn i det mørke rommet ble vurdert (Fig. 1B). Musene ble returnert til hjemmeburene sine umiddelbart etter at de kom inn i det mørke rommet fra det lyse rommet (0-min re-eksponering til det mørke rommet; rekonsolideringsfase) eller ble værende i det mørke rommet i 1, 3 eller 10 min uten å få fotsjokk (utryddelsesfase; Fig. 1C–E). Umiddelbart etter reaktiveringsøkten fikk musene en systemisk injeksjon av VEH eller proteinsyntesehemmeren ANI. 48 timer senere ble crossover latens vurdert PR-LTM.

I samsvar med vår tidligere studie (Fukushima et al., 2014), induserte gjeneksponering for lysrommet (0 min gruppe) rekonsolidering og forbedring av IA-minne. En toveis ANOVA avslørte signifikante effekter av tid (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), medikament (F(1) ,24)=23.197, s , 0,0001) og tid medikamentinteraksjon (F(1,24)=25.022, s , 0,0001; Fig. 1B). Post hoc Bonferronis test og parede t-test avslørte at VEH- og ANI-gruppene viste signifikant økt henholdsvis redusert crossover-latens ved PR-LTM sammenlignet med reaktiveringsøkten (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; Fig. 1B). Disse observasjonene indikerer at IA-minnehenting i lysrommet forbedret hukommelsen, mens proteinsyntesehemming forstyrret det hentede minnet, og bekrefter den forrige observasjonen at IA-minnehenting forbedrer minnet gjennom rekonsolidering på en proteinsynteseavhengig måte.

I motsetning til dette induserte gjeneksponeringen for det mørke rommet langsiktig ekstinksjon [toveis ANOVA, tid (Fig. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; Fig. 1D, F(1,36)=11.699, s=0.0016), medikament (Fig. 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039; Fig. 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), tid medikamentinteraksjon (Fig. 1C, F(1,28)=7.916, s=0.009; Fig. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, s=0.0079)], som observert tidligere (Fukushima et al., 2014). VEH-gruppene som oppholdt seg i det mørke rommet i 3 eller 10 minutter, viste signifikant redusert cross-over-latens ved PR-LTM sammenlignet med reaktiveringsøkten, mens ANI-gruppene viste sammenlignbar crossover-latens ved PR-LTM sammenlignet med reaktiveringsøkten og til VEH-grupper (post hoc Bonferronis test, ps , 0,05; paret t-test, Fig. 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, s. 0.05; Fig. 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0,0001, ANI, t(9)=1.02, s. 0,05 ). Disse observasjonene indikerer at gjeneksponeringen for det mørke rommet i 3 eller 10 minutter slokket IA-minnet og at hemming av proteinsyntese blokkerte langsiktig ekstinksjon. Dermed slukker IA-minnehenting i det mørke rommet IA-minne på en genuttrykksavhengig måte.

Det er viktig at VEH-gruppen viste sammenlignbar kryss-overlatens ved PR-LTM sammenlignet med reaktiveringsøkten og med ANI-gruppen da de oppholdt seg i det mørke rommet i 1 min [toveis ANOVA, tid (F(1,36) {{ 5}}.03, s. 0.05), narkotika (F(1,36)=0.019, s. 0.05), tid medikamentinteraksjon (F(1,36)=0.011, s. 0.05); post hoc Bonferronis test, ps. 0,05; paret t-test, VEH, t(9)=0.091, s . 0,05, ANI, t(9)=0.328, s . 0,05; Fig. 1E]. Disse observasjonene indikerer at VEH-gruppen verken viste forbedring eller utryddelse av IA-minne og at ANI-gruppen ikke viste noen forstyrrelse av IA-minne. Derfor blokkerte re-eksponering for det mørke rommet i 1 min både forbedringen og ANI-indusert forstyrrelse av det reaktiverte IA-minnet, men ikke slukket IA-minnet, noe som tyder på at denne 1-min re-eksponeringen kansellerer induksjonen av rekonsolidering , men er utilstrekkelig til å slukke IA-minne.

Oppsummert indikerte disse resultatene at gjeneksponering for lysrommet induserer rekonsolideringsfasen, mens lengre gjeneksponering for det mørke rommet (3 eller 10 min) induserer ekstinksjonsfasen. Enda viktigere, å oppholde seg i 1 min i det mørke rommet induserer overgangsfasen fra rekonsolidering til ekstinksjon, som hemmer fryktminne-rekonsolidering uten å indusere ekstinksjon.

Molekylære signaturer av rekonsolidering, overgang og ekstinksjonsfaser i amygdala, hippocampus og mPFC etter gjenfinning av IA-minne

Rekonsolidering og utryddelse av kontekstuelt fryktminne viser økninger i CREB-fosforylering ved S133, en markør for genekspresjonsaktivering som kreves for rekonsolidering og langsiktig utryddelse, men viser distinkt dynamikk av CREB-fosforylering (Mamiya et al., 2009 ). Interessant nok har nyere studier vist at det ikke er noen økning i fosforyleringen av ERK, en oppstrømsregulator av CREB (Impey et al., 1998; Wu et al., 2001), i den basolaterale regionen av amygdala ved overgangen fra rekonsolidering til utryddelsen av et cued-fryktminne, selv om denne fosforyleringen økes i den basolaterale regionen når et cued-fryktminne blir rekonsolidert og slukket (Merlo et al., 2014, 2018). En annen studie indikerte at hippocampus ERK aktiveres bare når kontekstuelt fryktminne er slukket, men ikke rekonsolidert (Tronson et al., 2009). Disse funnene tyder på at rekonsolidering, overgang og ekstinksjonsfaser viser distinkte molekylære og cellulære signaturer. Derfor målte og sammenlignet vi nivåene av pCREB og pERK i rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinksjonsfasene ved bruk av immunhistokjemi. Vi utførte lignende eksperimentelle tidsplaner som i figur 1B, D, E ved å bruke fire eksperimentelle grupper. Musene ble eksponert på nytt for det lyse rommet 24 timer etter treningen og ble deretter værende i det mørke rommet [reaktivering: 0 min i det mørke rommet, rekonsolidering (Recon) gruppe; 1 min, overgangs (Tran) gruppe; 10 min, ekstinksjon (Ext) gruppe]. En annen gruppe mus ble ikke returnert til det lyse/mørke rommet (ikke-reaktivert, NR-gruppe). Vi telte pCREB-positive (pCREB1) nevroner, pERK-positive (pERK1) nevroner og dobbeltpositive (pCREB1/pERK1) nevroner i amygdala, hippocampus og mPFC 30 minutter etter reaktiveringsøkten.

Amygdala (lateral region) CREB ble aktivert i ekstinksjons- og rekonsolideringsfasen, mens ERK ble aktivert kun i ekstinksjonsfasen (fig. 2A–C). En enveis ANOVA avslørte en signifikant effekt av gruppen (fig. 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). I likhet med tidligere funn (Mamiya et al., 2009), avslørte post hoc Newman-Keuls-testen at Recon- og Ext-gruppene viste betydelig flere pCREB1-neuroner enn de andre gruppene (s, 0,05). Disse observasjonene indikerte at i likhet med observasjonene på atferdsnivåene (fig. 1), kansellerer eksponering for det mørke rommet i 1 min (overgangsfase) "slå-på" av CREB-fosforylering som ville bli økt i rekonsolideringsfasen. Derimot ble det observert signifikant flere pERK1-nevroner i Ext-gruppen enn i de andre gruppene, selv om det var mye færre pERK1-nevroner enn pCREB1-neuroner i Ext-gruppen (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; Fig. 2C).

Konsekvent ble signifikant flere doble positive nevroner (pCREB1/pERK1) observert i Ext-gruppen (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; Fig. 2D), mens det ble observert betydelig flere pCREB1/pERK– (pCREB enkelt positive) nevroner i Recon- og Ext-gruppene (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; Fig. 2E). Dermed viste rekonsolideringsfasen bare en enkelt populasjon av pCREB1/pERK– nevroner. I kontrast viste ekstinksjonsfasen to populasjoner av pCREB1/pERK- og pCREB1/pERK1-neuroner, noe som indikerer at ERK bare aktiveres i en undergruppe av pCREB1-neuroner. Det er viktig at lignende resultater ble observert i den basolaterale regionen av amygdala (fig. 2G, F(3,29)=13.042, p , 0,0001; fig. 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; Fig. 2I, F(3,29)=12.633, p , 0,0001; Fig. 2J, F(3,29)=12 .505, s, 0,0001).

Bifasisk aktivering av ERK i ekstinksjonsfasen ERK er en oppstrøms aktivator av CREB, og dermed kreves ERK-aktivering for konsolidering og rekonsolidering av fryktminne (Schafe et al., 200{{31 }}; Duvarci et al., 2005). Imidlertid, inkonsekvent, ble ingen ERK-aktivering observert i amygdala, hippocampus eller mPFC i rekonsolideringsfasen når pERK ble målt 30 minutter etter reaktiveringsøkten (fig. 2-4). Derfor undersøkte vi tidsforløpene til ERK- og CREB-fosforylering. Vi utførte et lignende eksperiment som i figurene 2-4, bortsett fra at pCREB- og pERK-nivåene ble målt ved 5, 15 og 30 minutter etter reaktiveringsøkten (gjeneksponering for det mørke rommet i {{ 66}}, 1 eller 10 min; fig. 5A). I samsvar med dataene vist i figurene 2-4 ble signifikant økning i pCREB1-nevroner observert etter 30 minutter, men ikke etter 5 minutter, etter reaktiveringsøkten i Recon (amygdala, mPFC og hippocampus) og Ext (amygdala og mPFC) ) grupper, men ikke Tran-gruppen (Fig. 5E, enveis ANOVA, amygdala, 5 min, F(3,23)=0.346, s. 0.05, 30 min, F(3,23)=15.272, s , 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1.169, s. 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, s , 0,0001; hippocampus, 5 min, F(3,23)=0.154, s. 0.05, 30 min, F(3,23)=16.197, s , 0,0001; uparet t-test, amygdala, rekonsolidering, 5 vs 30 min, t(12)=7.807, p , 0,0001, ekstinksjon, 5 vs 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, rekonsolidering, 5 vs 30 min, t(12)=5.727, p , 0,0001, ekstinksjon, 5 vs 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013; hippocampus CA1-region, rekonsolidering, 5 vs 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

Interessant nok ble det observert signifikante økninger i pERK1-nevroner i amygdala, mPFC og hippocampus i Recon-, Tran- og Ext-gruppene 5 minutter etter reaktiveringsøkten sammenlignet med NR-gruppen (Fig. 5F, amygdala, F(3,23)=10.961, s=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, s { {13}}.0011; hippocampus, F(3,23)=6.924, s=0.0017). Disse observasjonene indikerte at ERK aktiveres umiddelbart etter reaktiveringsøkten i alle minnefaser. Imidlertid returnerte disse økningene i antall pERK1-nevroner til basale nivåer (sammenlignbar med NR-gruppen) 15 minutter etter reaktiveringsøkten (fig. 5F, amygdala, F(3,20)=2.676, s. . 0,05; mPFC, F(3,23)=0.683, s. 0.05; hippocampus, F(3,20)=0.74, s. 0.05). Videre, i samsvar med funnene vist i figurer 2-4, ble signifikant flere pERK1-neuroner observert i amygdala, mPFC og hippocampus 30 minutter etter reaktiveringsøkten bare i Ext-gruppen (fig. 5F, amygdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hippocampus, F( 3,23)=6.206, s=0.003). Dermed viser rekonsoliderings- og overgangsfasene forbigående aktivering av ERK bare på det tidlige tidspunktet (5 min), mens ekstinksjonsfasen viser bifasisk aktivering av ERK på de tidlige (5 min) og sene (30 min) tidspunktene etter reaktiveringen økt. Disse observasjonene indikerte at mekanismene for regulering av ERK-aktivering er forskjellige i rekonsoliderings-/overgangs- og ekstinksjonsfasene. Samlet viste våre observasjoner at rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinksjonsfasene viser distinkte molekylære signaturer.

Roller av ERK-aktivering i rekonsolidering og utryddelsesfaser av IA-minne

Rekonsoliderings-/overgangs- og ekstinksjonsfasene viste henholdsvis monofasisk og bifasisk ERK-aktivering. Vi undersøkte og sammenlignet deretter rollene til tidlig (5 min) og sen (30 min) ERK-aktivering i mPFC i rekonsoliderings- og ekstinksjonsfasene ved å undersøke effekten av å hemme ERK (fig. 6).

Diskusjon

I denne studien undersøkte vi mekanismene for minneovergang fra rekonsolidering til ekstinksjonsfaser etter henting av IA-minne. Vi karakteriserte først atferdssignaturene til IA-minnefaser etter henting. I samsvar med vår tidligere studie (Fukushima et al., 2014), induserte IA-minneinnhenting rekonsolidering og ekstinksjon ved gjeneksponering for lys (0 min i det mørke rommet) og mørke ( 3 eller 10 min) rom, henholdsvis. Interessant nok ble IA-minnet verken forbedret eller slukket og viste motstand mot hemming av proteinsyntese når musene ble eksponert på nytt for det mørke rommet i bare 1 min. Derfor antyder disse observasjonene at en 1-min re-eksponering for det mørke rommet kansellerer induksjonen av rekonsolidering, men er utilstrekkelig til å slukke IA-minne. Videre fant vi at ERK ble aktivert i amygdala, hippocampus og mPFC på et tidlig tidspunkt (5 min) etter re-eksponering for det mørke rommet i 0, 1 eller 10 min. Konsekvent blokkerte hemmingen av ERK i disse hjerneområdene rekonsolidering/forsterkning og utryddelse av IA-minne. Det viktigste er at ERK-hemming i amygdala, hippocampus og mPFC etter 1-min re-eksponering til det mørke rommet desinhiberte den rekonsolideringsmedierte forbedringen av IA-minnet, noe som tyder på at ERK-aktivering etter korte (1 min) re-eksponeringer til det mørke rommet er nødvendig for hemming av rekonsolidering av IA-minne. Omvendt var en 1-min re-eksponering for det mørke rommet utilstrekkelig til å slukke IA-minnet, selv om utvidet re-eksponering til det mørke rommet (3 eller 10 min) slokket dette minnet. Derfor antyder resultatene våre at en 1-min re-eksponering for det mørke rommet induserer en minneovergangsprosess som kansellerer rekonsolidering/forsterkning, men som ikke starter ekstinksjonslæring. Samlet foreslår vi at minneovergangsprosessen bidrar til å bytte minnefaser fra rekonsolidering til utryddelse gjennom ERK-mediert forebygging av rekonsolidering.

I likhet med våre nåværende observasjoner, viste en fersk studie med auditiv fryktkondisjonering at enkelt (1) eller langvarig (10) CS-presentasjoner induserer henholdsvis rekonsolidering og utryddelse av minnet gjennom en økning av pERK-nivåer i den basolaterale regionen av amygdala. I kontrast endrer ikke mellomliggende (4–7) CS-presentasjoner pERK-nivåer i den basolaterale regionen av amygdala. Viktigere, ERK-hemming ved de mellomliggende CS-presentasjonene påvirket ikke fryktminnet. Denne studien antydet at det er en overgang i minnefasen fra rekonsolidering til utryddelse etter gjenfinning av fryktminne (Merlo et al., 2018). I denne studien utvidet vi dette funnet og foreslo at overgangsfasen aktivt skifter minnefaser fra rekonsolidering til utryddelse gjennom aktivering av ERK-signaltransduksjonsveien. I motsetning til tidligere funn (Merlo et al., 2018), fant vi at overgangsfasen involverer ERK-fosforylering i amygdala, hippocampus og mPFC. Disse avvikene kan være på grunn av forskjellen mellom tidspunkter for å undersøke ERK-fosforylering; den forrige studien målte pERK-nivåer ved;12 minutter etter CS-presentasjon (Merlo et al., 2018), mens vår studie viste at økte pERK-nivåer returnerte til basalnivået rundt dette tidspunktet (15 minutter etter re-eksponeringen). I tillegg er det viktig å merke seg at IA-oppgaven muliggjør observasjon av forbedring av IA-minne gjennom rekonsolidering, og dermed fører til at vi finner at hemming av ERK i overgangsfasen desinhiberer forbedringen av IA-minne.

Tidligere studier har vist at ERK-fosforylering øker i den basolaterale regionen av amygdala ved 20–60 minutter etter ekstinksjonslæring av cued fear memory (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018), mens hippocampus viser denne aktiveringen 1 time etter utryddelseslæringen av kontekstuelt fryktminne (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009). I denne studien oppnådde vi lignende observasjoner om at pERK økes 30 minutter etter reaktiveringsøkten i utryddelsesfasen. Disse funnene tyder på at ERK-fosforylering er en vanlig molekylær signatur for den sene ekstinksjonsfasen (20–60 min).

Videre observerte vi at ERK-aktivering skjer bifasisk på tidlige og sene tidspunkter (5 og 30 min) etter reaktiveringsøkten i ekstinksjonsfasen, mens denne aktiveringen skjer monofasisk på det tidlige tidspunktet i rekonsolideringsfasen (fig. 5). . Konsekvent blokkerte inhibering av ERK i hjerneregioner på disse tidspunktene av rekonsoliderings- og ekstinksjonsfasene henholdsvis rekonsolidering/forsterkning og langsiktig ekstinksjon (fig. 6A, C-H). Disse observasjonene antyder at monofasisk og bifasisk ERK-aktivering er nødvendig for henholdsvis rekonsolidering-mediert forbedring og utryddelse av IA-minne. Det er viktig å merke seg at ERK fungerer som en oppstrøms regulator av CREB-fosforylering. Derfor kan den forbigående aktiveringen av ERK i den tidlige minnefasen, i det minste delvis, bidra til denne fosforyleringen av CREB, som aktiverer uttrykket av gener som kreves for rekonsolidering og langsiktig utryddelse.

I likhet med våre tidligere funn ved bruk av kontekstuell fryktkondisjonering (Mamiya et al., 2009), ble CREB aktivert i rekonsolidering (amygdala/hippocampus/mPFC) og ekstinksjon (amygdala/mPFC) minnefase, mens ERK ble aktivert kun i utryddelsesfasen 30 minutter etter reaktiveringsøkten. Konsekvent ble bare en enkelt populasjon av pCREB1/pERK– nevroner observert i rekonsolideringsfasen, mens distinkte nevronpopulasjoner ble observert i ekstinksjonsfasen: pCREB1/pERK– og pCREB1/pERK1 nevroner i amygdala (fig. 2); pCREB– /pERK1 nevroner i hippocampus (fig. 3); og pCREB1/pERK–, pCREB–/pERK1 og pCREB1/pERK1 nevroner i mPFC (fig. 4). Disse observasjonene, spesielt den kontrasterende observasjonen av pCREB–/pERK1 og pCREB1/pERK– nevroner, antyder at aktiveringen av CREB og ERK reguleres forskjellig i hvert hjerneområde når hukommelsen er slukket, og at senfaseaktiveringen av ERK spiller spesifikk og distinkt. roller for utryddelse av fryktminne sammenlignet med andre minneprosesser som konsolidering og rekonsolidering som diskutert nedenfor. Interessant nok observerte vi at pERK1-nevroner var mer rikelig i mPFC sammenlignet med hippocampus og amygdala, siden mPFC viste et høyere forhold mellom pERK1-nevroner (utryddelsesfase) og pCREB1-nevroner (rekonsolideringsfase) sammenlignet med hippocampus og amygdala, noe som tyder på at aktiveringen av ERK i mPFC spiller en mer spesifikk rolle i minneutryddelse.

Det er fortsatt uklart om samme eller forskjellige populasjoner av nevroner aktiveres i rekonsolidering, overgang og ekstinksjonsminnefaser. En tidligere studie identifiserte aktivering av "fryktneuroner" og "utryddelsesnevroner" i amygdala når henholdsvis cued fear memory reaktiveres eller slukkes (Herry et al., 2008). Derfor er det mulig at ERK og CREB aktiveres i de forskjellige populasjonene av nevroner med forskjellige tidsprofiler (dvs. "rekonsolideringsnevroner" og ekstinksjonsnevroner). Som diskutert ovenfor, kan pCREB1-neuroner, inkludert pCREB1/pERK1-neuroner, regulere rekonsolidering og langsiktig utryddelse av IA-minne gjennom aktivering av genuttrykk som henholdsvis rekonsolidering og ekstinksjonsneuroner. Motsatt kan ERK-aktivering i pCREB- /pERK1-neuroner bidra til kanselleringen av CREB-mediert transkripsjonsaktivering som ville være nødvendig for rekonsolidering siden denne ERK-aktiveringen er spesifikt observert i den sene ekstinksjonsfasen; ERK har aktivert i rekonsolideringsnevronene for å avbryte aktiveringen av genuttrykk i ekstinksjonsfasen. Interessant nok viste en tidligere studie at hippocampal ERK-aktivering blokkerer induksjonen av c-fos når kontekstuelt fryktminne er slukket (Guedea et al., 2011), noe som øker muligheten for at denne ERK-aktiveringen antagoniserer CREB-signalveien. Det er viktig å identifisere nevronpopulasjonene som regulerer rekonsolidering, overgang og utryddelse og å undersøke de molekylære signaturene og funksjonelle betydningen til disse nevronene. I tillegg forblir interaksjoner mellom nevrale populasjoner identifisert i denne studien ukjent. Det er mulig at "utryddelse (overgang) nevroner" modulerer funksjonen til rekonsolidering nevroner for å kansellere forhindre rekonsolidering gjennom interaksjoner mellom dem (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014). Derfor er det også viktig å undersøke disse interaksjonene i og mellom amygdala, mPFC og hippocampus.

Tidligere viste vi at hippocampus ikke viser noen endring av CREB-fosforylering og Arc-uttrykk etter utryddelseslæring av kontekstuell frykt, og konsekvent klarer ikke hemmingen av proteinsyntese i hippocampus i utryddelsesfasen å blokkere langsiktig utryddelse (Mamiya et al. , 2009). Disse observasjonene har reist muligheten for at hippocampus ikke er nødvendig for langsiktig utryddelse. Imidlertid viste vi at ERK aktiveres i hippocampus etter ekstinksjonslæring av IA-minne, og konsekvent, blokkering av ERK-aktivering i hippocampus svekker langsiktig ekstinksjon. Derfor indikerer våre nåværende observasjoner viktige roller for hippocampus i minneutryddelse. Sammen med våre tidligere funn foreslår vi at hippocampus er nødvendig for minneutryddelse, men ikke for en konsolideringslignende prosess for å stabilisere et "utryddelsesminne" gjennom aktivering av genuttrykk.