Aktivitetsguidet isolering av fenoliske komposisjoner fra Anneslea Fragrans vegg. Og deres cytobeskyttende effekt mot hydrogenperoksidindusert oksidativt stress i HepG2-celler del 1
Mar 25, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Abstrakt: Anneslea fragrans Wall., commonly known as"Pangpo Tea", is traditionally used as folk medicine and healthy tea for the treatment of liver and intestine diseases. The aim of this study was to purify the antioxidative and cytoprotective polyphenols from A.fragrans leaves. After fractionation with polar and nonpolar organic solvents, the fractions of aqueous ethanol extract were evaluated for their total phenolic (TPC) and flavonoid contents(TFC) and antioxidant activities(DPPH, ABTS, and FRAPassays). The n-butanol fraction (BF)showed the highest TPC and TFC with the strongest antioxidant activity. The bio-guided chromatography of BF led to the purification of six flavonoids (1-6) and one benzoquinone lanthanoid (7). The structures of these compounds were determined by NMR and MS techniques. Compound 6 had the strongest antioxidant capacity, which was followed by 5 and 2. The protective effect of the isolated compounds on hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress in HepG2 cells revealed that the compounds 5 and 6exhibited better protective effects by inhibiting ROS productions, having no significant difference with vitamin C(p>0.05), mens 6 viste den beste anti-apoptoseaktiviteten. Resultatene tyder på at A.fragrans kan tjene som en verdifull antioksidant fytokjemisk kilde for utvikling av funksjonell mat og helsenæringsprodukter.
Nøkkelord:Anneslea dufter; antioksidant; guidet isolasjon; oksidativt stress; flavonoidglykosider
1. Introduksjon
Reaktive oksygenarter (ROS) produseres som biprodukter gjennom oksidativ respirasjon i normale fysiologiske og biokjemiske prosesser [1]. Som endogene frie radikaler spiller ROS en viktig rolle i cellesignalering og opprettholdelse av kroppens konstans i et normalt område [2]. Hvis ROS ikke kunne fjernes effektivt, kan overdreven ROS føre til forekomst av oksidativt stress, som kan påvirke celleproliferasjon og apoptose [3]. Oksidativt stress er nært knyttet til en rekke sykdommer, inkludert diabetes, hyperlipemi, fedme, kreft og kardiovaskulære og nevrodegenerative sykdommer [4]. Nylig har mange studier vist at et kosthold beriket med antioksidanter har en rekke gunstige effekter på grunn av deres renseevne på overdreven ROS [5,6].
Naturlige antioksidanter inneholder en rekke molekyler som polyfenoler [], karotenoider [8], vitaminer [9], nitrogenholdige forbindelser [10] og kumariner [9]. Polyfenoler distribueres vidt over hele planteriket og fremmer helsemessige fordeler på grunn av deres antioksidantegenskaper [11]. Mange av dem, som resveratrol og noen derivater [12], antocyanidiner [13, isoflavoner [14l, katekin [15l og quercetin] er velkjent for sin beskyttende effekt ved å rense ROS [1]. De siste årene har polyfenoler tiltrukket seg oppmerksomhet i forebygging av kreft[17], kardiovaskulær dysfunksjon[18], nevrodegenerative sykdommer [19] og aldring [20]. Derfor er det et presserende behov å søke etter effektive antioksidanter for å fremme menneskers helse.
Cistanche kan forbedre immuniteten
Anneslea fragrans Wall. er en eviggrønn plante, som hovedsakelig er utbredt i det sørlige Kina [21]. I tillegg til dens dekorative formål, brukes bladene til A.fragrans også som en folkemedisin for å behandle feber, leverbeskyttelse, oppkvikkende mage og tarm Kina og Kambodsja [22], som var registrert i "Yunnan Simao Chinese Herbal Medicine" .I tillegg har bladene også blitt behandlet som en tedrikk, som er kjent som "Pangpo Tea". I tidligere rapporter [23] har ekstraktet av A.fragrans vist antioksidanter og antimalaria-aktiviteter. Til dags dato er det imidlertid ikke rapportert om dets antioksidant-fenolforbindelser fra A.-dufter.
Derfor var formålet med denne forskningen å isolere og identifisere antioksidantforbindelsene fra A. fragrans-blader som er ansvarlige for deres tradisjonelle bruk for behandling av leversykdommer. De fire fraksjonene, diklormetanfraksjon (DF), etylacetatfraksjon (EAF), en n-butanolfraksjon (BF) og gjenværende vannfraksjon (RWF) av vandig etanolekstrakt ble vurdert for deres totale fenoliske (TPC) og totale flavonoidinnhold (TFC) og for deres antioksidantkapasitet. N-butanolfraksjonen (BF) hadde høyest TPC og TFC med sterkest antioksidantaktivitet. Den biostyrte fraksjoneringen av BF tillot rensing av forbindelser. Videre ble den cytobeskyttende effekten av de isolerte forbindelsene utført på hydrogenperoksid (H, O,)-indusert oksidativt stress i humane leverkreft HepG2-celler. Den intracellulære ROS-produksjonen og celleapoptose ble bestemt ved bruk av flowcytometri. Derfor ga denne forskningen en verdifull antioksidant fytokjemisk ingrediens for utvikling og bruk av A.fragrans-blader som et funksjonelt supplement (sunn te) i mat- og helseindustrien.
2. Resultater og diskusjon
2.1. Utbytteeffektivitet av brøker og underfraksjoner
Væske-væske fordeling av organiske løsningsmidler og kolonnefraksjonering er viktige teknikker for å berike de bioaktive forbindelsene fra råekstrakt [24]. Ved bruk av væske-væske-fordeling ble etanolekstrakt (CE) fra A. fragrans-blader suksessivt fraksjonert med diklormetan, etylacetat og n-butanol for å gi fire fraksjoner (henholdsvis DF, EAF, BF og RWF). Utbytteprosentene av fraksjoner ble funnet å variere fra 11 til 27 prosent. Den gjenværende vannfraksjonen (RWF, 27 prosent ) hadde høyest utbytte, og utbyttet av andre fraksjoner var i rekkefølgen som følger: n-butanolfraksjon (BF, 24 prosent), etylacetatfraksjon (EAF, 21 prosent), diklormetan brøk (DF, 11 prosent ).
Utbytteprosenten av underfraksjoner (BF-A til E) ble funnet å variere fra 3,82 til 48,4 prosent. BF-E presenterte det høyeste utbyttet på 48,4 prosent etterfulgt av BF-D (24,96 prosent ), som har betydelig høyere utbytte enn de andre fraksjonene.
2.2.HPLC-analyse
Høyytelses væskekromatografi (HPLC) deteksjon har vist seg å være en kraftig teknikk for kvantitativ bestemmelse. HPLC-analyse viste at BF hadde flest forbindelser med den sterkeste antioksidantaktiviteten. Under veiledning av antioksidantanalyser og HPLC-analyse ble den antioksidative fraksjonen ytterligere kromatografert for isolering av underfraksjoner. BF ble utsatt for en hydratisert harpiks D101-kolonne for å gi fem underfraksjoner (BF-A til E). HPLC-analyse viste at BF-Cto E hadde flest antioksidantforbindelser. Bio-veiledet fraksjonering av disse fraksjonene (BF-C til E) tillot rensing av syv rene forbindelser.
Som vist i figur 1 ble BF og syv rene forbindelser profilert ved HPLC-analyse. Basert på sammenligning med retensjonstidene og UV-absorpsjonskurvene, ble disse syv forbindelsene bekreftet gjennom retensjonstider på 7,51 min (etsende, 7), 7,92 min ((epi)-katechin, 6), 9,38 min (confusosid, 1), 9,57 min((S)-naringenin-7-O- -D-glukopyranosid, 4), 10,32 min (vaccinii folin, 2), 12,64 min (2',3,4,4'-tetrahydroksydi-dihydrochalcon, 5), og 13,95 min (1-[4-(-D-glukopyranosyloksy)-2-hydroksyfenyl]-3-(4-hydroksy-3-metoksyfenyl) -1-propanon,3)(Figur 1A). Blant dem tilhører forbindelser 1-6 flavonoider, og forbindelse 7 er benzokinoletanoid.
2.3. Totalt fenolinnhold (TPC) og totalt flavonoidinnhold (TFC)
A.fragrans-bladene brukes tradisjonelt som behandlet helsete og har vist seg å være en god ressurs for fenoler og flavonoider [25]. I henhold til spektrofotometriske analyser ble TPC og TFC testet i forskjellige fraksjoner og underfraksjoner fra A. fragrans-blader. Som vist i tabell 1 hadde BF den høyeste TPC-verdien med 238,12±12.05 mg GAE/g ekstrakt etterfulgt av EAF. DF viste den laveste TPC-verdien som 66,52±0,57 mg GAE/g ekstrakt. Tilsvarende ble de høyeste TFC-konsentrasjonene også funnet i BF med TFC-verdi på 165,19±5,21 mg RE/ekstrakt. Når det gjelder RWF og EAF (henholdsvis 66,92±1,38 og 116,12±2,89mg GAE/ekstrakt), hadde de også lavere TFC-konsentrasjoner enn BF(165,19±5,21 mg RE/g ekstrakt), mens DF hadde den laveste TFC-konsentrasjonen som 47,94±2,84 mg RE/g ekstrakt. Innholdet av TPC og TFCin BF var omtrent fire ganger høyere enn i DF.
Dataene viste tilstedeværelsen av høyeste TPC og TFC i BF-E med verdier som 262,03±1,72mg GAE/g ekstrakt; 180,52± 6,30 mg RE/g ekstrakt, henholdsvis, etterfulgt av BF-D (henholdsvis 219,84±4,01 og 157,01±2,50 mg RE/g ekstrakt), BF-C (210,69±6,31 og 151,01±4,33 mg RE/g ekstrakt) henholdsvis), mens BF-B og BF-A hadde de laveste TPC- og TFC-verdiene (tabell 1).
2.4.Antioksidantvirkning
De fleste av polyfenolene, spesielt flavonoider og fenolsyrer, utnyttes til populære antioksidantmat (næringsmidler) og presenterer en rekke menneskelige fordeler [17]. I vår forrige studie har A.fragrans-bladene vist seg å være en god ressurs for polyfenoler[26]. Antioksidantaktiviteten til ekstraktet fra A. fragrans-blader og dets fytokjemikalier er imidlertid ikke undersøkt ennå. På grunn av forskjellige antioksidative reaksjonsmekanismer ble tre analyser av ABTS, DPPH og FRAP kombinert for å evaluere antioksidantaktiviteten til fraksjonene og underfraksjonene fra A. fragrans-bladene.
Among the fractions, BF showed the most potent antioxidant activity in ABTS, DPPH, and FRAP radical-scavenging activities with 1808.46±96.52,951.42±87.75, and 1822.96± 29.24 μmol TE/g extract （Table 1）.PDF showed the lowest antioxidative activity in ABTS and FRAP assays（139.23±8.62 μmol TE/g extract and 180.05± 9.46 μmol TE/g extract, respectively)(Table 1). Whereas the radical scavenging activities of four fractions (DF, EAE, BF, and RWF) in the DPPH radical-scavenging assay were found to vary from 613.38± 45.35 to 951.42±87.75 μmol TE/g extract, respectively, having no significant difference (p>0.05). These results suggested that the phytochemicals from A. fragrans leaves might be insensitive to DPPH. To further obtain the active metabolites, BF was selected for further fractionation. The BF was subjected to D101 macroporous adsorbing resin column chromatography eluting by a gradient of the methanol-aqueous system to yield five subfractions(BF-A to E). Hence, the ABTS radical-scavenging activity of these subfractions can be ranked as BF-E> BF-C>BF-D. Den reduserende aktiviteten i FRAP-analysen avslørte at BF-D hadde den sterkeste antioksidative aktiviteten, som ble fulgt av BF-C og BF-E. Det er bemerkelsesverdig at tre underfraksjoner (BF-C til E) viste høyere antioksidativ aktivitet enn moderfraksjonen (BF). Samlet ble BF-C til E underkastet kolonnekromatografi for å isolere og identifisere de antioksidative fytokjemikaliene.
2.5. Antioksidantvirkningen til de isolerte forbindelsene
Alle de isolerte forbindelsene (forbindelsene 1-7) ble evaluert for antioksidantkapasitet ved ABTS, DPPH-radikalfjernende aktivitet og FRAP-antioksidantaktivitet. Alle dataene er beskrevet i tabell 2. Forbindelser 6 og 2 viste den høyeste antioksidantaktiviteten, etterfulgt av 5. Forbindelse 4 viste moderat antioksidantaktivitet og forbindelsene 1, 3 og 7 ble ansett som inaktive med ABTS og DPPH radikalfjernende aktiviteter mindre enn 200 μmol TE/g ekstrakt. Ved å bruke Vc (de radikalfjernende aktivitetene med henholdsvis 2932,91 ±93,63 og 1873,56±121,68 umol TE/g ekstrakt) som positiv kontroll, hadde forbindelse 6 den sterkeste antioksidantaktiviteten i ABTS- og DPPH-radikalfjernende analyser med 151,819,32 mol og ± 819,30 mol og ±819,30 mol TE/g ekstrakt (s<0.05）, respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract,="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover,="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">
I tillegg diskuteres antioksidantstruktur-aktivitetsforholdet til flavonoidene (1-6) av varierende grader av hemmende effekter. Forbindelse 2 hadde mer anti-tioksidantaktivitet enn forbindelsene 1, 3 og 5, noe som antydet at 3,4-dihydroksygruppene i dihydrochalcones i 2 kan spille en kritisk rolle mot ABTS, DPPH-radikalfjernende aktivitet og FRAP-antioksidant aktivitet, og glukosedelen substituert ved C-4'i 2 kan spille en viktig rolle på dens antioksidantkapasitet [4]. Videre viste forbindelse 6 den høyeste antioksidantaktiviteten sammenlignet med andre forbindelser, noe som antydet at flavan-3-oler (katechin) sannsynligvis viser en bedre radikalfjernende aktivitet enn dihydrochalkoner og flavanoner [27]. Oppsummert ble forbindelsene 2, 5 og 6 med god antioksidantaktivitet valgt videre for cytobeskyttende effekter mot oksidativt stress av H2O2 i neste studie.
2.6. Forholdet mellom antioksidantaktivitet og TPC/TFC-innhold
Konsentrasjoner av TPC og TFC var sterkt korrelert med antioksidantaktivitet fra verdiene til FRAP (r{{0}}.982 og 0.977) og ABTS (r=0.959 og 0,965), henholdsvis. Korrelasjonsmatrisen viste også sterk korrelasjon mellom ABTS- og FRAP-verdiene (r =0.992). Videre ble det utført en multivariat analyse (PCA), som ble ekstrahert fra dataene i tabell 1. Som vist i figur 2, forklarte PCA 94,44 prosent av total variasjon, der PC1 sto for 84,73 prosent av variansen og PC2 sto for 9,71 prosent. FRAP-, ABTS- og DPPH-analysene med EAF og RWF er plassert i øvre høyre kvadranter, og TPC- og TFC-konsentrasjoner med BF og BF-Cto E er plassert i de nedre høyre kvadrantene i henholdsvis PC1-positive score. I mellomtiden er DF og BF-A til B med lave TPC- og TFC-konsentrasjoner plassert langs aksen til PC1-negative skårer. Disse funnene viste at TPC- og/eller TFC-konsentrasjonene er nært assosiert med antioksidantkapasitet, og jo høyere TPCor TFC-konsentrasjoner i fraksjonene og underfraksjonene er, desto høyere er antioksidantkapasitetsverdiene. Disse resultatene viste at det høye innholdet av fenoler og flavonoider i forskjellige fraksjoner og underfraksjoner fra A. fragrans-blader kan bidra til antioksidantaktivitet.
Figur 2. PCA-analyse av totale fenoler, flavonoider og antioksidantaktivitet. Midler med forskjellige bokstaver indikerer betydelige forskjeller (s<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">
Denne artikkelen er hentet fra Molecules 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules