En medfødt patogensensorstrategi som involverer ubiquitinering av bakterielle overflateproteiner, del 2

DISKUSJON

Metazoer bruker ubiquitinering som en allsidig mekanisme for å opprettholde cytosolisk homeostase, forhindre akkumulering av skadede proteiner/organeller og forsvare mot invaderende patogener (40, 41). Gitt variasjonen av patogener og forskjellige sett med skadede proteiner man møter, representerer identifiseringen av vanlige motiver for substratgjenkjenning og påfølgende ubiquitinering en smart strategi for ressursoptimalisering. Proteiner i eukaryote celler som er bestemt for proteolyse, identifiseres typisk av et tredelt degron-motiv (24).

Immunitet er kroppens evne til å bekjempe sykdom, inkludert reaksjoner på bakterier, virus og andre skadelige stoffer. Hvis kroppens immunsystem er kompromittert, vil det ikke være sterkt nok til å takle sykdomsangrepet. Studier har vist at underernæring har en innvirkning på immunsystemets funksjon, noe som gjør kroppen mer utsatt for infeksjoner og sykdom. Protein er et av de viktigste stoffene for å opprettholde immunitet.

Proteiner er laget av aminosyrer, noen av dem kalles essensielle aminosyrer fordi de må tilføres av mat og ikke kan syntetiseres av kroppen. Disse essensielle aminosyrene inkluderer tryptofan, leucin, fenylalanin, lysin, isoleucin, metionin, valin og histidin. Dersom kroppen ikke får i seg nok essensielle aminosyrer, kan det føre til nedsatt proteinomsetning, noe som kan påvirke immunsystemets funksjon.

I tillegg bidrar et proteininntak av høy kvalitet til å opprettholde et normalt immunsystem og kroppsfunksjoner. Når kroppen mangler protein, kan det føre til et svekket immunsystem og kroppen er mer utsatt for sykdom. Hvis menneskekroppen mangler protein i lang tid, kan det forårsake langvarig skade på immunsystemet, noe som gjør mennesker mottakelige for ulike sykdommer.

Derfor er et balansert kosthold og riktig trening nøkkelen til å opprettholde proteininntaket. Folk kan dekke kroppens proteinbehov ved å spise mer proteinrik mat som kjøtt, fjærfe, fisk, bønner, egg, meieriprodukter, korn, nøtter og frø. I tillegg kan moderat trening også øke kroppens behov for protein og absorpsjonseffektivitet. Et balansert og variert kosthold og en sunn livsstil er nøklene til å opprettholde immunitet, holde kroppen sunn og stabil, og motstå invasjon av sykdommer. Fra dette synspunktet må vi forbedre immuniteten vår. Cistanche kan forbedre immuniteten betydelig fordi polysakkaridene i kjøtt kan regulere immunresponsen til det menneskelige immunsystemet, forbedre stressevnen til immunceller og forbedre immuniteten til immuncellene. Bakteriedrepende effekt.

Klikk cistanche deserticola supplement

Dette fikk oss til å undersøke om lignende motiver kunne bli funnet på patogenoverflater, der de kan fungere som en proxy for substratgjenkjenning. Her demonstrerer vi at verts ubiquitin-ligaser bruker lignende molekylære signaturer for å registrere fylogenetisk forskjellige patogener. Patogengjenkjenning via vanlige molekylære mønstre/motiver (PAMPs) er et godt karakterisert trekk ved medfødt immunitet (42). Resultatene våre antyder at degronlignende sekvenser i bakterielle overflateproteiner virker på en måte som tilsvarer PAMP-er, for å gi intracellulær patogenovervåking. Denne modusen operand kan utnyttes ytterligere av verten for presentasjon av mikrobielle proteinantigener på hovedhistokompatibilitetskompleks I for å indusere en sterk CD8-respons rettet mot intracellulære patogener.

Den potensielle betydningen av ubiquitin-mediert påvisning av patogener for vertsforsvar fremheves ytterligere av den betydelige gjenværende ubiquitineringen som er oppdaget i mutant SPN som mangler både BgaA og PspA. Dette indikerer at det er flere, uidentifiserte substrater for ubiquitin-maskineriet, med den resulterende redundansen som sikrer robust patogenavskjæring. Spesielt gir noen umiddelbare spørsmål om degron-motivet og dets betydning for bakteriene (annet enn å være en gjenkjennelig enhet) en interessant evolusjonsvinkel.

Degron-motivet er dispenserbart in vivo, og om noe, mutering eller sletting av motivet forbedret intracellulær persistens, noe som resulterte i økt virulens. Dette underbygges av våre resultater at mutasjon i degron-motivet kan brukes av patogener for å unnslippe ubiquitin-mediert gjenkjennelse som sett for SPN serotype 19F. Imidlertid kan den konserverte naturen til degron-motivet i BgaA på tvers av flertallet av SPN-serotypene tyde på en motstrategi vedtatt av bakterier for å være mindre dødelig for verten.

Dette kan gi en mulighet for patogenet til å øke sine beboelige habitater. Samtidig kan ubiquitinering av bakterieoverflaten eller utskilte proteiner ved degron-motivet modulere dem funksjonelt for å dempe eller omkoble vertsresponsen for eventuell fordel (43). Derfor kan tilstedeværelsen eller fraværet av eukaryote-lignende funksjonelle domener eller motiver (som degroner) være avhengig av en patogen nisje og tilpasset for å unngå eller modulere vertsimmunresponser.

En lignende patogenfølingsmekanisme som involverer guanylatbindende proteiner har også vært involvert i bakteriell clearance; imidlertid, i motsetning til ubiquitinering, rapporteres deres rolle å være begrenset til gramnegative patogener (44–47). Ubiquitinering retter seg mot patogenet uavhengig av Gram-opprinnelse, for eksempel er RNF213 dokumentert målrettet mot Listeria spp. uavhengig av fravær av LPS (48). Vi eliminerer derfor ikke muligheten for dens antimikrobielle virkning mot SPN også.

En patogen overflate kan ubiquitineres med flere kjedetyper av forskjellige E3-ligaser med interkjedeinteraksjoner (41). Spesielt når det gjelder Mtb, har Smurf1 og Parkin vist seg å danne K48- og K63-kjedetyper som fungerer synergistisk for å bryte ned patogenet (12). Å forstå den mekanistiske rollen til K48 ubiquitinering og E3-ligasene involvert under infeksjonsscenarier er fortsatt understudert. Når det gjelder STm, har en enkelt E3-ligase ARIH1 blitt avbildet for å målrette cytosolisk STm med K48 ubiquitinkjeder som fører til deres eliminering fra systemet (15). Basert på våre og andres funn, blir K48-Ub-merkede patogener til slutt degradert mens de er assosiert med proteasomalt maskineri.

Denne studien viser imidlertid K48-Ub-dekorasjon av spesifikke bakterielle overflateproteiner. Noen patogener er kjent for å aktivt modifisere overflateproteinene deres, beskytte dem mot ubiquitinering og påfølgende drap, og understreker dermed betydningen av overflatelokalisering av ubiquitinsubstratet (10). I tillegg har flere obligate intracellulære patogener utviklet strategier for å de-ubiquitinere seg selv, eller vertsregulatoriske komponenter, for å unngå ubiquitin-mediert clearance (5). Sammen understreker disse funnene viktigheten av ubiquitin-mediert alarmarousal som en grunnleggende intracellulær patogensensormekanisme sentral i vertsforsvaret.

Vår studie demonstrerte videre den sentrale rollen til SCF E3-ligase, spesielt med FBXW7, i bakteriell ubiquitinering som forsterker patogennedbrytning. Heterozygote mutasjoner i FBXW7, spesielt R505C (en kritisk rest i substratgjenkjenningslomme), utløser flere karsinomer og lymfatisk leukemi hos mennesker (49, 50). En fersk kohortbasert studie indikerte at nesten 43 prosent av pasientene med kronisk lymfatisk leukemi (KLL) bukker under for bakteriell lungebetennelse og sepsis, etterfulgt av soppinfeksjoner (51).

Dette bekrefter vår observasjon av den opphevede evnen til vertsceller som bærer FBXW7-mutasjoner til å registrere og eliminere patogener. Våre funn gir derfor en uventet molekylær forklaring på den økte risikoen for infeksjoner hos pasienter med KLL. Sammenhengen mellom genetisk polymorfisme i E3-ligasegener og mottakelighet for bakterielle infeksjoner er også underbygget av pasienter med Parkinsons sykdom, som er sårbare for tyfoidfeber eller spedalskhet (14), noe som tyder på det bemerkelsesverdige bidraget til E3-ligaser i vertens immunitet mot bakterielle infeksjoner og vedlikehold. av cellulær steady state.

Avslutningsvis dechiffrerte vi et universelt språk for å registrere cytosol-levende patogener som effektivt kunne brukes av verten for å gjenkjenne mikroorganismer for påfølgende eliminering. Samlet sett kaster disse funnene lys over forståelsen av de rudimentære cellulære immunprosessene, som kan utnyttes for å intensivere antibakteriell immunitet.

MATERIALER OG METODER

Cellekultur

Både human lunge alveolar karsinom (type II pneumocytt) cellelinje A549 [American Type Culture Collection (ATCC) nr. CCL185)] og den cervikale adenokarsinomcellelinjen HeLa (ATCC nr. CRM-CCL-2) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; HiMedia) supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (Gibco) ved 37 grader og 5 prosent CO2.

Bakteriestammer og vekstforhold

SPN (R6, serotype 2, gave fra Tim J. Mitchell, University of Birmingham, Storbritannia) ble dyrket i Todd-Hewitt-buljong supplert med 1,5 prosent gjærekstrakt ved 37 grader i 5 prosent CO2. Følgende antibiotika ble brukt til å dyrke SPN-kulturer ved behov: kanamycin (200 ug/ml), spectinomycin (100 ug/ml) og kloramfenikol (4,5 ug/ml). Ni hundre mikroliter av 0,4 OD600 (optisk tetthet ved 600 nm) dyrket SPN-kultur ble blandet med 600 ul 80 prosent steril glyserol (32 prosent endelig glyserolkonsentrasjon) og lagret i en -80 graders dypfryser. Disse glyserolbestandene ble brukt som startpodestoff for alle eksperimenter.

Escherichia coli DH5 og STm (ATCC 14028) kulturer ble dyrket i Luria-Bertani-buljong (LB) ved 37 grader under risteforhold (200 rpm), og når det var nødvendig, ble følgende antibiotika brukt: kanamycin (50 ug/ml), spectinomycin (100 ug/ml), kloramfenikol (20 ug/ml) og ampicillin (100 ug/ml). For alle infeksjonsanalyser ble bakterier dyrket til OD600 ~0,4, etterfulgt av resuspensjon i fosfatbufret saltvann (PBS) til en lignende tetthet før vertscellene ble infisert.

Screening av antatte ubiquitin-målproteiner

Alle overflateproteiner tilstede i STm- og SPN-proteomet ble først identifisert fra publisert litteratur. Komplette proteinsekvenser av overflateproteinene ble hentet fra UniProt, som deretter ble brukt til å identifisere tilstedeværelsen av degron-motiver. Et sett med 29 antatte degron-motiver ble kuratert fra publisert litteratur (24, 52, 53) og Eukaryotic Linear Motiv-databasen. Pythons regex-modul ble brukt til å identifisere plasseringen av alle slike kurerte motiver i overflateproteinsekvensene. Et lineært søk ble videre utført for å identifisere tilstedeværelsen av en lysinrest i nærheten (8 til 14 aminosyrerester) til hvert identifisert degron-motiv. Denne lysinresten antas å fungere som festestedet for ubiquitin-delen. Til slutt ble de kortlistede proteinsekvensene matet inn i IUPred (54), et proteinstrukturforutsigelsesverktøy, for å lokalisere tilstedeværelsen av en uordnet region mellom degron-motivet og proksimalt lysin. De resulterende proteinene (BgaA og PspA for SPN og RlpA for STm) ble valgt for evaluering som ubiquitineringsmål og dekoding av deres rolle i patogenclearance.

Konstruksjon av bakteriestamme

Allelutveksling ved homolog rekombinasjon ble utført ved bruk av genflankerende regioner som bar en innsatt antibiotikakassett for generering av mutante stammer i både SPN og STm (tabell S2).

For SPN ble 500-bp oppstrøms og nedstrøms regioner av bgaA, pspA og genene hans amplifisert fra genomet med passende primere (tabell S3) og satt sammen i pBKS-vektoren. Etter kloning av disse fragmentene ble en antibiotikaresistenskassett (spectinomycin for pose samt pspA og kloramfenikol for hysA) satt inn i denne konstruksjonen. De lineariserte rekombinante plasmidene ble deretter transformert til WT SPN ved bruk av kompetansestimulerende peptid 1 (GenPro Biotech), rekombinanter ble valgt ved bruk av respektive antibiotika, og generstatning ble bekreftet ved polymerasekjedereaksjon (PCR) og sekvensering av de respektive genloci. For STm ble λ-rød rekombinasemetoden brukt for generering av gendelesjonsmutanter (55).

Kort fortalt ble sekvenser homologe til endene av taugenet vedlagt i primersekvensene som brukes for amplifikasjon av kanamycinresistenskassetten. Kassetten ble deretter elektroporert inn i WT STm-stammen, og knockouts generert ved homolog rekombinasjon ble valgt basert på kanamycinresistens. Gensletting ble bekreftet ved bruk av PCR og sekvensering av genlokuset. Fulllengde pspA, hysA og en trunkert bgaA-T (1 til 3168 bp) ble klonet under P23-promotoren i skyttelvektoren pIB166 (56) og brukt for komplementering.

Disse rekombinante plasmidene ble også brukt for stedsrettet mutagenese for å generere forskjellige varianter av bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, og bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK3314, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, ), og his (hysADegron-BgaA og hysADegron-PspA) ved bruk av passende primersett (tabell S3) og transformert til ΔbgaA- og ΔpspA-mutanter. Alle kloner ble verifisert ved DNA-sekvensering. Ekspresjon av forskjellige varianter av BgaA, PspA og HysA ble bekreftet ved Western blot ved bruk av passende antistoffer.

Antistoffer og reagenser

Anti-Enolase og anti-PspA serum (S. Hammerschmidt, Universitetet i Greifswald, Tyskland); anti-BgaA-serum (S. King, Ohio State University, USA); og antistoffer spesifikke for His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub-kobling (Millipore, 05-1307), K63-Ub-kobling (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreonin (CST, 9381S), IgA, Kappa fra murint myelom, klon TEPC-15 (Sig, M1421), og PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) ble anskaffet. Følgende sekundære antistoffer ble brukt: pepperrotperoksidase (HRP)-merket anti-kanin (BioLegend, 406401), HRP-merket anti-mus (BioLegend 405306), anti-kanin Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-kanin Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), biotin-konjugert anti-mus immunoglobulin A (Life Technologies, M31115), anti-mus Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-mus Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), anti-goat Alexa. Fluor 633 (Invitrogen, A21082) og FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Proteinuttrykk og rensing

BgaA-T og dets varianter ble klonet i pET28 ved bruk av Xba I/Not I-restriksjonsseter. Rekombinante plasmider som koder for BgaA-T med N-terminal His-tag ble transformert inn i E. coli BL21 (DE3) celler for proteinekspresjon. Nytransformerte kolonier ble dyrket i LB inneholdende kanamycin (5 0 ug/ml) ved 37 grader på en shaker inkubator i 12 timer. Én prosent av primærkulturen ble tilsatt 1 liter LB-buljong og inkubert ved 37 grader på en shaker-inkubator til OD600nm nådde mellom 0,6 og 0,8. Proteinekspresjon ble indusert ved tilsetning av 100 μM isopropyl- -D-tiogalaktopyranosid (IPTG) og dyrking av kulturen videre ved 37 grader i 5 til 6 timer med omrøring ved 150 rpm.

Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 6000 rpm i 10 minutter ved 4 grader. Cellepelleten ble resuspendert i buffer A [25 mM tris (pH 8,0) og 300 mM NaCl] og lysert ved sonikering. Cellerester ble separert ved sentrifugering (14, 000 rpm, 50 min, 4 grader), og supernatanten ble påført en Ni-NTA-kolonne, ekvilibrert med buffer A. Kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolumer buffer A, og de His-merkede proteinene ble eluert med imidazol (250 mM) i buffer A. Alle variantene av BgaA-T ble uttrykt og renset ved bruk av samme prosedyre. FBXW7 ble subklonet i pGEX-4 T-1-vektoren med en N-terminal glutation S-transferase (GST)-tag fra pCMV6-Entry-FBXW7-vektoren ved bruk av Eco RI-restriksjonsenzymet.

GST-merket FBXW7 ble uttrykt i E. coli BL21 (DE3) celler etter induksjon av proteinekspresjon med 0.1 mM IPTG og vekst ved 30 grader i 4 timer. GST-FBXW7 fra E. coli råekstrakt ble renset ved bruk av Glutathione-Sepharose (GE HealthCare) kolonnekromatografi. Fraksjoner som inneholdt rensede proteiner ble slått sammen og konsentrert opp til 0,5 mg/ml ved bruk av et 10-kDa molekylvekt cutoff-filter (Amicon) ved sentrifugering ved 4700 rpm ved 4 grader. Renheten til proteinene ble kontrollert på SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) etterfulgt av farging med Coomassie-blått.

Vertscelletransfeksjoner

BgaA-T ble klonet i doksycyklin-induserbar vektor pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene nr. 130261) ved bruk av et infusjonskloningssett (Takara). En positiv klon ble bekreftet ved Sanger-sekvensering. FBXW7R505C-mutasjon ble utført ved stedsrettet mutagenese ved bruk av pMRX-GFP-FBXW7 som en mal og bekreftet ved Sanger-sekvensering. Alle transfeksjoner ble utført ved bruk av Lipofectamine 3000-reagens (Thermo Fisher Scientific), og valg ble gjort i nærvær av blasticidinhydroklorid (2 ug/ml; HiMedia).

siRNA-rettet genet knockdown

For RNA-interferensmediert knockdown av spesifikke gener, ble følgende siRNA-er brukt: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) og siGSK3DGETharmacon ONTARGEThar (Qiagen, 1027423). SMARTpool L-003010-00-0005). Kort fortalt ble A549-celler dyrket i en 24-brønnplate forbigående transfektert med genspesifikke siRNA-er eller scramble (siControl) (150 pmol) ved bruk av Lipofectamine 3000 i henhold til produsentens instruksjoner. Trettiseks timer etter transfeksjon ble cellene behandlet for Western blotting og immunfluorescens- eller penicillin-gentamycin-beskyttelsesanalyser.

Strukturprediksjon og modellering

Alle strukturer ble forutsagt av AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) og visualisert ved bruk av PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, versjon 2.0 Schrödinger, LLC). Strukturer ble fargekodet i PyMol basert på IUPred (54) skårer fra ordnet (blått) til uordnet (rødt) til hvitt.

Western blotting

SPN-kulturer dyrket til {{0}}.4 OD600nm ble lysert ved sonikering, og råekstrakter ble samlet etter sentrifugering (15,000 rpm, 30 min, 4 grader). For A549s ble monolag vasket flere ganger med PBS og lysert i iskald radioimmunutfellingsanalyse (RIPA) buffer [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1 prosent Triton X-100, 0,5 prosent natrium deoksycholat og 1 prosent SDS] som inneholder proteasehemmercocktail (Promega), natriumfluorid (10 mM) og EDTA (5 mM). Cellesuspensjonen ble kort sonikert og sentrifugert for å samle cellelysater. Proteiner tilstede i bakterie- eller A549-cellelysater (10 eller 20 ug) ble separert på 12 prosent SDS-PAGE-geler og overført til en aktivert polyvinylidendifluoridmembran. Etter blokkering i 5 prosent skummet melk, ble membranene undersøkt med passende primære og HRP-merkede sekundære antistoffer. Blottene ble til slutt utviklet ved å bruke et forbedret kjemiluminescenssubstrat (Bio-Rad).
Penicillin-gentamicin beskyttelsesanalyse

SPN-stammer dyrket til OD600nm 0.4 i Todd-Hewitt-buljong supplert med 0.2 prosent gjærekstrakt (THY) ble pelletert, resuspendert i PBS ( pH 7,4), og fortynnet i analysemedium for infeksjon av A549-monolag med en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 10. Etter 1 times infeksjon ble monolagene vasket med DMEM og inkubert med et analysemedium inneholdende penicillin (10 ug/ml) ) og gentamicin (400 ug/ml) i 2 timer for å drepe ekstracellulær SPN. Cellene ble deretter lysert med 0,025 prosent Triton X-100, og lysatet ble sådd ut på Brain Heart Infusion agarplater for å telle levedyktig SPN. Prosentvis invasjon ble beregnet som [kolonydannende enheter (CFU) i lysatet/CFU som ble brukt til infeksjon] × 100. For å vurdere den intracellulære overlevelsen, 9 timer etter infeksjon (fra begynnelsen av penicillin-gentamycin-behandling), ble cellelysater fremstilt som nevnt ovenfor, og spredte plater og overlevende bakterier ble oppregnet. Overlevelseseffektivitet (prosent) ble representert som en fold endring i prosent overlevelse i forhold til kontroll ved angitt tidspunkt (normalisert til 0 timer).

Immunfluorescens

For immunfluorescensanalyse ble A549- eller HeLa-celler dyrket på dekkglass og infisert med SPN- eller STm-stammer ved MOI ~25 i 1 time etterfulgt av antibiotikabehandling i 2 timer. På ønskede tidspunkter etter infeksjon (9 timer for SPN-infeksjon i A549s og 3 timer for infeksjon med STm i HeLa), ble cellene vasket med DMEM og fiksert med isavkjølt metanol ved -2 ​​0 grader i 10 minutter. Videre ble dekkglassene blokkert med 3 prosent bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 2 timer ved romtemperatur (RT). Cellene ble deretter behandlet med et passende primært antistoff i 1 prosent BSA i PBS over natten ved 4 grader, vasket med PBS og inkubert med et passende sekundært antistoff i 1 prosent BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble dekkglass vasket med PBS og montert på glassplater sammen med VECTASHIELD med eller uten 4′,6-diamidino-2-phenylindole (Vector Laboratories) for visualisering ved hjelp av et laserskannende konfokalmikroskop (LSM 780, Carl Zeiss) ) under 40× eller 63× oljemål. Bildene ble hentet etter optisk seksjonering og deretter behandlet med ZEN lite-programvare (versjon 5.0). Superoppløsningsmikroskopi ble utført på lignende måte ved bruk av Elyra 7 (Carl Zeiss) i SIM-modus. For kolokaliseringsanalyse ble bakterier skåret ved visuell telling av n > 100 bakterier per replikat.

Transmisjonselektronmikroskopi

Etter infeksjon med SPN og STm ble cellene vasket med {{0}},1 M natriumkakodylatbuffer, fiksert med 2,5 prosent glutaraldehyd (Sigma-Aldrich) i 0,1 M natriumkakodylatbuffer ( Sigma-Aldrich) i 3 timer ved 4 grader. Etter fiksering ble cellene samlet gjennom en celleskraper og pelletert ved 2000 rpm i 10 min. Cellene ble deretter vasket med 0,1 M natriumkakodylatbuffer og etterfiksert med 1 prosent osmiumtetroksid i 0,1 M natriumkakodylatbuffer i 20 minutter ved 4 grader. Etter påfølgende vask med kakodylatbuffer og destillert vann, ble cellene deretter dehydrert i økende konsentrasjoner av etanol (50, 70, 95 og 100 prosent) og propylenoksid i 30 minutter og til slutt innebygd i epoksyharpiks (Electron Microscopy Sciences, 14300) polymerisasjon ved 75 grader i 45 min. Deretter ble kapslene overført til en 95 graders ovn i 45 min. Ultratynne seksjoner (70 nm) ble kuttet ved hjelp av en diamantkniv på en Leica EM UC7 Ultramicrotome og farget med 2 prosent uranylacetat og 1 prosent blycitrat og sett ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) ved 120 KV.

Ex vivo ubiquitinering

A549-uttrykker BgaA-T og varianter av det ble behandlet med MG132 (5 μM), og proteinuttrykk ble indusert med doksycyklin (100 ug/ml) i 24 timer. Celler ble deretter lysert i RIPA-buffer, og prøvene ble elektroforert med SDS-PAGE (8 prosent). Bekreftelse av proteinekspresjon og ubiquitinering av BgaA-T og dets varianter ble bevist ved Western blot etter sondering med henholdsvis anti-BgaA og anti-K{10}}Ub-antistoffer.

In vitro ubiquitinering

For in vitro ubiquitineringsanalyser ble rekombinante proteiner renset som beskrevet tidligere (58). SCFFBW7 E3-ligasekomplekset ble inkubert med rekombinant 0,1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0,25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) og ubiquitin (2,5 ug/ml; Boston Biochem) i nærvær av renset BgaA-T og dets varianter. Ubiquityleringsreaksjoner ble utført i analysebuffer [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosintrifosfat (ATP), 1 mM -merkaptoetanol og 0,1 prosent Tween 20] i 2 timer ved 25 grader . Reaksjonene ble stoppet med 5 x Laemmli-buffer, løst på SDS-PAGE-geler og analysert ved immunoblotting ved bruk av et anti-BgaA-antistoff.

In vitro kinaseanalyse

For å utføre in vitro kinaseanalyse ble GSK3 kinaseenzymsystemet (Promega) brukt i henhold til produsentens protokoll med følgende modifikasjoner. Kort fortalt ble 3 ug rekombinant BgaA-T tilsatt til 0,5 ug aktiv GSK3 med 400 μM ATP i reaksjonsbuffer sammensatt av 40 mM tris, (pH 7,5), 20 mM MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) og 50 μM ditiotreitol. Reaksjonen ble inkubert i 2 timer ved 30 grader og stoppet ved å tilsette 1 x Laemmli buffer. Prøvene ble deretter kokt og elektroforert for Western blotting som nevnt tidligere. Fosforylert BgaA-T ble påvist med et anti-fosfotreonin-antistoff.

In vivo modell

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 prosent startkroppsvekt, og uttalt nese- eller okulær utflod. Blodprøver ble tatt ved hjertepunktur under terminal anestesi, og miltene ble skåret ut postmortem for bakterietelling. Vevsprøver ble behandlet med en håndholdt vevshomogenisator, og homogenater ble seriefortynnet i PBS før flekker på blodagarplater. Platene ble inkubert over natten ved 37 grader, 5 prosent CO2, og antall bakteriekolonier ble vurdert neste dag.

Statistisk analyse

GraphPad Prism versjon 5 ble brukt til statistisk analyse. Statistiske tester utført for individuelle eksperimenter er nevnt i de respektive figurlegendene. P < 0.05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Data ble testet for normalitet og for å definere variansen til hver gruppe som ble testet. Alle multiparameteranalyser inkluderte korreksjoner for flere sammenligninger, og data presenteres som gjennomsnitt ± SD med mindre annet er angitt.

REFERANSER OG MERKNADER

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs og alarmins: Alt vi trenger å vite om fare. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Patogengjenkjenning og inflammatorisk signalering i medfødt immunforsvar. Clin. Microbiol. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Livet på innsiden: Den intracellulære livsstilen til cytosoliske bakterier. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, rollen til ubiquitylering i immunforsvar og patogenunndragelse. Nat. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, Ubiquitineringssystemet innenfor bakteriell vert-patogen interaksjoner. Microorganisms 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Global analyse av verts- og bakteriell ubiquitinome som svar på salmonella typhimurium-infeksjon. Mol. Cell 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, A mycobacterium tuberculosis overflateprotein rekrutterer ubiquitin for å utløse vertsxenofagi. Nat. Commun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation of lipopolysaccharide av RNF213 under bakteriell infeksjon. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubiquitin-ligasekompleks styrer xenofagi gjennom å gjenkjenne bakteriell overflateglykan. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Lysinmetylering beskytter et intracellulært patogen mot ubiquitylering og autofagi. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, en E3 ubiquitin-ligase med sans for bakterier. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Ubiquitin-ligasen Smurf1 fungerer i selektiv autofagi av mycobacterium tuberculosis og anti-tuberkuløs vertsforsvar. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBACsyntetiserte lineære ubiquitinkjeder begrenser cytosol-invaderende bakterier ved å aktivere autofagi og NF-KB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Ubiquitin-ligase parkin medierer motstand mot intracellulære patogener. Nature 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Utvide vertscellens ubiquityleringsmaskineri rettet mot cytosolisk Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com