En MRNA-vaksine fremkaller STING-avhengige antitumorimmunresponser

Abstrakt

Lipid-formulerte RNA-vaksiner har blitt mye brukt for sykdomsforebygging og behandling, men deres virkningsmekanisme og individuelle komponenter som bidrar til slike handlinger gjenstår å avgrense. Her viser vi at en terapeutisk kreftvaksine sammensatt av en protamin/mRNA-kjerne og et lipidskall er svært potent i å fremme cytotoksiske CD8þ T-celleresponser og mediere antitumorimmunitet. Mekanistisk er både mRNA-kjernen og lipidskallet nødvendig for fullt ut å stimulere ekspresjonen av type I-interferoner og inflammatoriske cytokiner i dendrittiske celler. Stimulering av interferon-b-ekspresjon er utelukkende avhengig av STING, og antitumoraktivitet fra mRNA-vaksinen er betydelig kompromittert hos mus med et defekt Sting-gen. Dermed fremkaller mRNA-vaksinen STING-avhengig antitumorimmunitet.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

1. Introduksjon

Rask utvikling og verdensomspennende bruk av mRNA-vaksiner for forebygging av SARS-CoV-2-infeksjon har vist kraften til mRNA-baserte legemidler i helsevesenet1,2. På grunn av deres store molekylvekt og negative ladning, må mRNA-molekyler pakkes inn i leveringsbærere for å effektivt komme inn i pattedyrceller. Pakking i leveringskjøretøyer i nanometerstørrelse har også fordelen av å beskytte mRNA-molekyler mot enzymatisk nedbrytning. Flere leveringsplattformer er utviklet for å passe formålet, for eksempel lipid nanopartikkel4, lipopolypleks (LPP)5, liposom-protamin-RNA (LPR)6, RNA lipoplex (RNA-LPX)7 og viruslignende vaksinepartikkel (VLVP) )8. Mens hver plattform har sin egen unike struktur og sammensetning, inneholder de fleste kjøretøyer et ionisk lipidmolekyl som letter mRNA-pakking og unnslipping av mRNA-molekyler fra endosomene. Med suksessen til de profylaktiske vaksinene er det en generell erkjennelse at mRNA-terapi kan brukes til å behandle kanskje de fleste, om ikke alle, sykdomstyper9e12. Faktisk har mRNA-baserte terapeutiske kreftvaksiner blitt studert i mange år13,14. Nylige fremskritt i kliniske studier har også vist deres anvendelsespotensial hos utvalgte kreftpasienter15e17. I motsetning til peptidkreftvaksiner som er fremstilt med adjuvansmolekyler18e20, kan mRNA-vaksinepartikler også tjene som selvadjuvans21.

For eksempel kan en to-komponent mRNA-basert kreftvaksine som inneholder fritt og protaminkompleksbundet mRNA også aktivere den tolllignende reseptor 7 (TLR7) signalering22. Men med den økende bekymringen for akutt medfødt immuntoksisitet fra naken mRNA, bruker de fleste etterforskere og selskaper modifisert RNA for å unngå medfødt gjenkjennelse av TLRs23. Følgelig spiller lipidkomponentene en viktig rolle i å øke adjuvansaktiviteten i mRNA-vaksinepartikkelen, fortrinnsvis ved å aktivere ikke-TLR-signalering. En fersk studie på lipidformulert, negativt ladet RNA-LPX bestående av 1,2- di-oktadecenyl-3-trimetylammonium (DOTMA, et kationisk lipid)/dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE, et hjelpelipid) liposom avslørte aktivering av interleukin 1 (IL1)-interleukin 1 reseptorantagonist (IL-1ra) aksen i regulering av sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, og den essensielle rollen til å aktivere to-trinns inflammasomveien i monocytter24. Interessant nok en ny undersøkelse av LNP-basert BNT162b2 fremstilt med ALC-0315 (et ionisert lipid), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC, et hjelpelipid) , polyetylenglykol-2000-N, N-di-tetradecylacetamid (PEG2000-DTA) og kolesterol viste nøkkelrollen til å aktivere type I interferonavhengig MDA5-signalering, men ikke TLR-er eller inflammasomer, for å stimulere begge medfødt og adaptiv immunitet til covid-19-vaksinen25. Disse studiene peker på muligheten for at leveringsplattformer bestående av variable lipidmolekyler kan stole på forskjellige signaltransduksjonsveier for vaksineaktivitet. Derfor er det viktig å fullt ut undersøke funksjonen til nøkkelmolekyler og deres kombinasjoner for å forbedre mRNA-terapien ytterligere.

I den nåværende studien setter vi opp eksperimenter for å dissekere den funksjonelle rollen til individuelle komponenter i en terapeutisk kreftvaksine. mRNA-vaksinepartikkelen (MVP) er sammensatt av en protamin/mRNA-kjerne som er innkapslet i et lipidskall bestående av et kationisk lipid, et hjelpelipid, et pegylert lipid og kolesterol (fig. 1A). Det er vist at inkludering av ladet lipid kan lette målrettet RNA-levering26, og dioleoyletylfosfatidylkolin (EDOPC) og dioleoyl-3- trimetylammoniumpropan (DOTAP) er to av de kationiske lipidene som er testet for dette formålet5,27. Vi undersøkte stimulering av ekspresjon av interferon-b (IFN-b), IL-1b og tumornekrosefaktor-a (TNF-a) av mRNA-kjernen, mRNA-fri bærer og hele MVP, og korrelerte slike aktiviteter til TLR7, mitokondriell antiviral signalering (MAVS, også kjent som IPS-1), stimulator av IFN-gener (STING), og TIR-domeneholdig adapter som induserer IFN-b (TRIF)-signalering. Deretter undersøkte vi rollen til protamin i kjernen og kationisk lipid i skallet for å stimulere IFN-b og TNF-a uttrykk. Til slutt sammenlignet vi antitumorimmunresponser fra MVP i villtype- og gen-knockout-mus.

Fordeler med cistanche tubulosa-Antitumor

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer

1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-etylfosfokolin (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfatidyletanolamin (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N- [amino(polyetylenglykol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoyl-3-trimetylammoniumpropan (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) (850375) ble kjøpt fra Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, USA). Kolesterol (C8667) ble hentet fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Reagensene ble oppløst i etanol i en konsentrasjon på 2 mg/ml for henholdsvis DSPE-PEG2k, 10 mg/ml for kolesterol og DOPC, og 20 mg/ml for EDOPC, DOPE og DOTAP. Protaminsulfat (P4020) ble oppnådd fra Sigma Aldrich. mRNA-molekyler som koder for ovalbumin (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) og luciferase (Luc-mRNA) (L-7204) ble kjøpt fra TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, USA). RNase-fritt vann (W0805-010) ble hentet fra GeneDEPOT (Baker, TX, USA). TLR7-agonisten imiquimod (tlrimq) og Sting-agonisten 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) var produkter fra Invivogen (San Diego, CA, USA). Lipofectamine 2000 (11668019) og Quant-iT™ RiboGreen™ RNA-analysesett (R11490) ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Rekombinant mus GM-CSF (554586) ble kjøpt fra BD Biosciences (San Diego, CA, USA). 500 Protein transporter inhibitor cocktail (00-4980-93) var et produkt fra Invitrogen. Cytofix/Cytoperm-sett (AB_2869010) ble kjøpt fra BD Biosciences. EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit (19851) ble oppnådd fra STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Følgende antistoffer ble hentet fra BioLegend (San Diego, CA, USA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) og anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643), og anti-CD{105}}PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) og anti-IFN-g-PE (554412) var fra BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) ble kjøpt fra ImmuDex (Fairfax, VA, USA). ELISA-sett for IL-1b (EM2IL1B) og TNF-a (BMS607-3) ble kjøpt fra Invitrogen, og ELISA-sett for CCL5 (DY478) og IFN-b (DY8234) ble hentet fra R&D Systems , Inc. (Minneapolis, MN, USA). Antistoffer for Western blot-analyse inkludert anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-aktin (4970) og anti-GAPDH (5174) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Figur 1. Fremstilling og karakterisering av mRNA-partikler. (A) Skjematisk oversikt over partikkelfremstilling av vaksine. (B) Agarosegelelektroforese viser at mRNA-molekyler ble beholdt i prøveinnlastingsbrønnen i prøver tilberedt med mRNA/protamin i forholdet 1:1 til 1:2. (CeF) Karakterisering av mRNA-vaksinepartikler (MVP) basert på prosentandel av innkapsling, polydispersitetsindeks, zetapotensial og størrelse. (G) Representative TEM-bilder av MVP2-partikler, målestokk Z 50 nm. (H) Prosentandel av eGFP-ekspresjon etter at DC2.4-celler ble behandlet med eGFP-MVP-er i 16 timer. (I) Fluorescerende avbildning av eGFP-uttrykkende DC2.4-celler, målestokk Z 400 mm. (J) Kvantitativ analyse av bioluminescens i BMDC-er behandlet med MVP-er innkapslet med luciferase-kodende mRNA i 16 timer. (K) Endringer i levedyktigheten til BMDC-er behandlet med PBS, mRNA-fri bærer, mRNA/protaminkjerne eller mRNA-innkapslet MVP2. Behandlingskonsentrasjoner var mRNA-ekvivalente. Data presenteres som gjennomsnittlig SEM (n Z 3). *P < 0,05; **P < 0,01.

2.2. Cellelinjer og cellekultur

Den murine DC2.4-dendritcellelinjen ble hentet fra ATCC (Manassas, VA, USA), og ble dyrket i RPMI-1640 inneholdende 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % penicillin-streptomycin. Den murine melanomcellelinjen B16-OVA ble anskaffet fra Dr. Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, USA). B16-OVA-celler ble dyrket i DMEM supplert med 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin. Den murine colon adenokarsinomcellelinjen MC38 ble kjøpt fra ATCC. Celler ble konstruert med OVA-ekspresjon og ble dyrket i DMEM med 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin. Cellekultur ble holdt ved 37 C med 5 % CO2.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

2.3. mRNA-vaksinepartikkelfremstilling

Alle mRNA-vaksinepartikler ble fremstilt ved å bruke NanoAssemblr Benchtop mikrofluidinstrument fra Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) ved å blande den organiske fasen og den vandige fasen. For å forberede den organiske fasen ble EDOPC (20 mg/ml), DOPE (20 mg/ml), kolesterol (10 mg/ml) og bis-DSPE-PEG2k (2 mg/ml) oppløst i etanol og blandet ved 34°C. :30:35:1 M-forhold med en strømningshastighet på 9 mL/min. For å forberede den vandige fase-mRNA-kjernen, ble mRNA blandet med protaminsulfat i 1:1 (vekt/vekt) i det mikrofluidiske instrumentet med en strømningshastighet på 9 ml/min. Etter 20 min inkubering ved 20 C ble mRNA-kjernen i vandig fase blandet med den organiske fasen for å generere mRNA-vaksinepartikler. Etter 20 minutter ble vaksinepartikkelsuspensjonen overført til et Amicon ultrasentrifugalfilter (MWCO 30 kDa), og 9-volumvann av molekylær kvalitet ble tilsatt for å fortynne etanolkonsentrasjonen fra 25 % til 2,5 %. Partikkelsuspensjonen ble deretter konsentrert ved sentrifugering ved 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ved 4 C. Et likt volum av 2 PBS ble tilsatt til det konsentrerte produktet for å justere det osmotiske trykket.

2.4. Gel retardasjonsanalyse

mRNA/protamin-kjernen ble først analysert ved gelretardasjon. Kort fortalt ble mRNA/protaminkjerne inneholdende 0,5 mg mRNA lastet inn i brønnen til en 1 % agarosegel i 1 TBE-løsning og elektroforese ble utført ved 120 V i 30 minutter (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). RNA-bånd ble farget med Gelred (Biotium, Hayward, CA) og påvist med et GelDoc-system (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Karakterisering av mRNA-vaksinepartikler

Størrelsesfordeling og zetapotensial ble målt med dynamisk lysspredning Zetasizer (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA). Innkapslingshastigheten ble bestemt ved bruk av et Quant-iT™ RiboGreen™ RNA-analysesett. Kort fortalt ble en vaksinepartikkelprøve inneholdende 0,5 mg mRNA fortynnet med en TriseEDTA-buffer (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) med eller uten 2 % Triton-X100 i en { {10}}brønnplate. Etter 10 min inkubering ved 37 C ble RiboGreen tilsatt i hver brønn, og fluorescensintensiteten ble målt. Innkapslingseffektivitet ble beregnet som vist i lign. (1): Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) av vaksinepartikler ble utført etter en tidligere beskrevet prosedyre9.

2.6. Dyr

Alle dyreoperasjonene ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Houston Methodist Hospital (protokollnummer AUP06200042). Mus ble plassert i et miljø som fullstendig oppfylte de regulatoriske standardene til National Institute of Health og American Association of Laboratory Animal Care-standarder. Villtype C57BL/6J mus og genetisk konstruerte mus inkludert Tlr7 /, Sting /, Mavs / og Trif / mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory.

2.7. Generering av murine benmargsavledede dendritiske celler (BMDCs)

Benmargsceller ble spylt ut fra lårbenet og tibia med komplett RPMI 1640. Røde blodceller ble lysert med en ACK-lysebuffer, og umodne benmargsceller ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 20 ng/ml rekombinant murin GM-CSF i 10 dager ved 37 C med 5 % CO2. Cellekulturmedium ble forfrisket på dag 3, 6 og 8, og ikke-adherente dendrittiske celler ble samlet på dag 10.

2.8. Måling av cytokiner og kjemokiner

BMDC-er ble sådd i en 24-brønnplate med en tetthet på 5  105 celler/brønn. Etter 1 time med bosetting ble cellene behandlet med 1 mg/ml imiquimod, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP, (1 mg/ml mRNA-ekvivalent) vaksinepartikler eller kontroller. Cellekulturmedier ble samlet 24 timer senere, og nivåer av TNF-a, CCL5, IFN-b og IL-1b ble målt ved bruk av enzymkoblede immunosorbentanalysesett (ELISA) ved å følge produsentens foreslåtte prosedyrer.

cistanche planteøkende immunsystem

2.9. Analyserer på DC-transfeksjon, DC-modning og stimulering

For å analysere DC-transfeksjonseffektiviteten in vitro, ble DC2.4-celler sådd ved 2.5 105 celler/brønn i en 24-brønnplate. Celler ble behandlet med eGFP- eller luciferase-kodende mRNA-innkapslede partikler ved en sluttkonsentrasjon på 1 mg mRNA/ml. Celler ble høstet 24 timer senere, vasket med 2% FBS i PBS-løsning og deretter resuspendert i samme løsning før de ble brukt for flowcytometrianalyse med et BD LSR II flowcytometer (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . For å måle DC-modning og antigenpresentasjon in vitro, ble BMDC-er sådd ved 2.5  105 celler/brønn i en 24-brønnplate og behandlet med 1 mg/ml OVA-MVP i 24 timer. BMDC-er ble farget i 30 minutter med antistoffer spesifikke for CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 og CD86 for DC-modning, og anti-H-2Kb (SIINFEKL) for antigenpresentasjon. For å bestemme stimulerende styrke in vivo ble C57BL/6J-mus vaksinert én gang med 10 mg OVA-MVP per mus i fotputen, og drenerende popliteale LN-er ble høstet 24, 48 og følgende celleoverflatemarkører: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Flowcytometri analyser på T-celleaktivering og spredning

For å måle T-celleaktivering in vivo ble mus vaksinert én gang med 10 mg OVA-MVP, og popliteal LN-er ble isolert etter 24 eller 48 timer. T-celler ble farget med følgende antistoffer: CD45, CD3, CD4, CD8 og CD69. For å påvise antigenspesifikke T-celler ble svulster, milt og popliteale lymfeknuter høstet 5 dager etter den andre vaksinasjonen. Vev ble behandlet for å generere enkeltcellesuspensjoner, og cellene ble farget med T-cellespesifikke antistoffer og OVA257e264-MHCI-dekstramer etter produsentens instruksjoner. For å måle intracellulært IFN-g-nivå ble 2  106 splenocytter eller celler isolert fra popliteale LN-er og svulster stimulert med 10 mg/mL OVA257e264-peptid i komplett RPMI 1640-medium supplert med 55 mmol/L b-merkaptoetanol og 1 proteintransporthemmer cocktail i 18 timer. Celler ble høstet og farget med T-cellespesifikke antistoffer. Etter fiksering og permeabilisering med Cytofix/Cytoperm-sett, ble cellene farget med anti-IFN-g-antistoff og brukt for analyse på BD LSR II flowcytometer (BD Biosciences). For å måle T-celleproliferasjon ble T-celler isolert fra miltene til OT-I-transgene mus ved bruk av et muse-T-celleisolasjonssett. De ble farget med 1 mmol/L CFSE i RPMI 1640 inneholdende 200 mg/mL BSA i 10 minutter ved 37 C. CFSE-merkede T-celler ble vasket to ganger med 5 volumer kald komplett RPMI 1640. I mellomtiden ble modne BMDC-er behandlet med 2 mg/ml OVA mRNA-innkapslet MVP i 24 timer før T-celleisolering. Når T-celler var klare, ble BMDC-er og T-celler dyrket sammen i et forhold på 1:5 (DC: T) i 72 timer. Celler ble samlet og farget med overflateantistoffer for T-celler, spredningen ble testet med et BD LSR II flowcytometer (BD Biosciences) og analysert. Alle flowcytometriresultater ble analysert med FlowJo v10-programvaren (Ashland, OH, USA).

2.11. Sporing av proteinuttrykk i levende mus

BALB/c-mus ble behandlet ved intra-fotpute-injeksjon med 10 mg Luc mRNA-innkapslet MVP. De ble injisert intraperitonealt med 30 mg RediJect D-luciferin per mus 6, 12, 24 eller 48 timer senere, og bioluminescens ble målt med Xenogen IVIS-200-bildesystemet (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, USA).

2.12. ELISpot-analyse

IP-filterplater ble forhåndsskylt med 50 mL 35 % etanol og vasket grundig 3 ganger med PBS før etanolen fordampet. Platene ble deretter belagt med anti-IFN-g-fangende antistoffer ved 4 C over natten. Platene ble blokkert med RPMI 1640 komplett medium inneholdende 55 mmol/L b-merkaptoetanol i 2 timer ved 37 C. Celler (1  105 splenocytter, 1  105 celler fra popliteal LN) ble sådd inn i hver brønn, og stimulert i 36 timer med 10 mg/ml OVA257e264-peptid. Medier ble kastet, og cellene ble vasket 4 ganger med PBST (PBS inneholdende 0,05% Tween 20) og to ganger med PBS. Etter den siste vask ble et anti-IFN-g deteksjonsantistoff tilsatt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur i mørket. Platene ble vasket 4 ganger med PBST og to ganger med PBS, og avidin-HRP ble tilsatt og inkubert i ytterligere 45 minutter ved romtemperatur i mørket. Til slutt ble platene vasket med PBST og PBS igjen som beskrevet ovenfor, og 50 ml AEC-substrat ble påført og observert for flekkreaksjon. Når flekker ble synlige, ble reaksjonen stoppet ved å kaste AEC-substratet og skylle det med dobbeltdestillert vann 5 ganger. Etter lufttørking over natten ble platene skannet og analysert med CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, USA).

2.13. Western blot-analyse

BMDC-er avledet fra villtype-, Mavs KO- eller Sting KO-mus ble samlet, og celler ble lysert i RIPA-cellelysebuffer supplert med protease- og fosfatasehemmere. Proteinkonsentrasjon i cellelysat ble målt med et BCA-proteinanalysesett. Proteinprøver ble separert med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. MAVS- og STING-ekspresjon ble påvist etter at membranen ble inkubert med et anti-MAVS- eller anti-STING-antistoff ved 1:2000 fortynning etterfulgt av immundeteksjon med SuperSignal West Pico og Femto Chemiluminescent Substrate. For å måle aktivering av STING-veien ble BMDC-er avledet fra villtypemus behandlet med bærer eller OVA mRNA-innkapslet MVP ved angitt konsentrasjon i 2 timer. Celler ble lysert og fortsatte for Western blot-analyse med anti-TBK1- og antifosfo-TBK1-antistoffer ved 1:2000 fortynning.

2.14. Antitumoranalyse

Murine tumormodeller ble generert ved å inokulere 2  105 celler B16-OVA melanomceller eller 5  105 MC38-OVA-celler per mus subkutant inn i venstre flanke av 6 til {{5} }uke gamle C57BL/6J hunnmus. Mus ble tilfeldig fordelt i behandlingsgrupper og behandlet to ganger atskilt med 7 dager med 10 mg OVA MVP eller kontroller i fotputen. Tumorvekst ble overvåket hver 2. dag. Tumorvolum ble beregnet i henhold til Eq. (2):

Mus ble avlivet 5 dager etter den andre vaksinasjonen, og vekten av tumorvev ble registrert.

2.15. Statistisk analyse

Alle resultater presenteres som gjennomsnittlig SEM. Statistikken ble vurdert med en enveis ANOVA-test ved bruk av Tukeys korreksjon for sammenligning med flere grupper og en uparet to-halet t-test for sammenligning med to grupper. Data ble analysert med GraphPad Prism v8.0.2-programvaren. P < 0.{{10}}5 ble ansett som statistisk signifikant (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Resultater

3.1. MVP medierer robust mRNA-ekspresjon i dendrittiske celler (DC)

Vi forberedte kjerne-skall-vaksinepartikler i en totrinns mikro-fluidisk tilnærming (Fig. 1A), og systematisk evaluerte individuelle komponenter i nanopartikkelen for å sette sammen en vaksinepartikkel med høy stabilitet, høyt cellulært opptak og høyt ekspresjonspotensial i DC. Gelelektroforese viste at en stabil mRNA-kjerne kunne dannes når mRNA-til-protamin-forholdet var på 1 eller lavere (fig. 1B). Ved å bruke eGFP-kodende mRNA som en surrogatmarkør fant vi at en lipidsammensetning med et molforhold på 34 % EDOPC/30 % DOPE/35 % kolesterol/1 % DSPEPEG2k ga en ideell innkapslingshastighet og den beste ekspresjonseffektiviteten (tabell 1, Støtteinformasjon Fig. S1AeS1D). Endring av ladningsforhold endret ikke innkapslingshastigheten, polydispersitetsindeksen eller overflateladningen til partiklene signifikant (tabell 2, fig. 1CeE); Imidlertid var størrelsen på de resulterende partiklene mellom 70 og 80 nm i diameter når forholdet var mellom 12 og 16, sammenlignet med en diameter på 120e130 nm når forholdet falt utenfor området (fig. 1F og G). Det beste uttrykket ble påvist i DC2.4-celler behandlet med MVP2 som hadde et ladningsforhold på 12 (fig. 1H og I). Et lignende mønster ble observert når partikler ble fremstilt med mRNA som koder for luciferase, og doseavhengig uttrykk ble påvist (fig. 1J). De mRNA-innkapslede partiklene viste ønskelig stabilitet siden de ikke mistet aktivitet etter lyofilisering eller fryse-tine (fig. S1E og S1F). I tillegg var det ingen cytotoksisitet etter at benmargsavledede dendritiske celler (BMDCs) ble behandlet med mRNA-kjernen alene, en bærerpartikkel fremstilt uten mRNA-molekyler, eller mRNA-holdig MVP2 (fig. 1K). Dermed viste MVP2 det beste uttrykkspotensialet. Den ble brukt til alle videre eksperimenter i studien, og merket som MVP i resten av teksten. MVP-partiklene kunne effektivt levere mRNA-molekyler in vivo, og det var ingen påvisbar toksisitet fra mRNA-innkapslet MVP basert på kroppsvektsendringer (fig. S1GeS1I).

3.2. MVP induserer effektivt antigenpresentasjon og T-celleaktivering in vitro og in vivo

Vi forberedte mRNA-kjerne, mRNA-fri bærer og OVA mRNA-innkapslet MVP, og brukte dem for å teste DC-modning og antigenpresentasjon (fig. 2A). BMDCs behandlet med MVP viste doseavhengig overekspresjon av DC-modningsmarkører inkludert CD40, CD80 og CD86 (fig. 2BeD). Behandling med enten den mRNA-frie bæreren eller mRNA-innkapslet MVP utløste MHC I-overekspresjon (fig. 2E), noe som indikerer at effekten var assosiert med bæreren i stedet for mRNA-komplekset. I tillegg resulterte MVP-behandling i celleoverflatevisning av OVA257e264-antigenepitop-MHC I-komplekset (SIINFEKL-MHC I) som ble påvist med et anti-SIINFEKL-MHCI-antistoff (fig. 2F), som demonstrerer effektiv antigenbehandling og presentasjon av BMDC-er . Videre, saminkubasjon av MVP-behandlede BMDCer med B3Z, en CD8þ T-cellelinje som spesifikt gjenkjente OVA257e264-epitopen, eller T-celler isolert fra milten til en OT-I-mus som uttrykte en OVA257e264-spesifikk T-celle reseptor, utløste IL-2-sekresjon, et resultat som ikke ble observert i T-celler samkubert med DC-er behandlet med bærer alene eller mRNA/protamin-kjernen alene (fig. 2G). Flowcytometrianalyse påviste 32,5 % proliferative CD8þ T-celler etter ko-inkubasjon med MVP (fig. 2H og I). OVA mRNA-innkapslede MVP-partikler ble også påført for å behandle mus ved intradermal injeksjon. Undersøkelse av celler i de drenerende lymfeknutene avslørte en jevn økning i CD86-ekspresjon blant både klassiske DC-er (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC) og plasmacytoide DC-er (pDC) i løpet av de første 48 timene, noe som indikerer stimulering av DC modning (fig. 2J). Behandling fremmet også berikelsen av CD8þ T-celler i lymfeknutene, med en betydelig økning i populasjonen av CD69þCD8þ T-celler (fig. 2K og L), noe som indikerer T-celleaktivering ved behandlingen. For å bestemme T-celleaktivering samlet vi celler i de drenerende lymfeknutene 3, 5 eller 7 dager etter MVP-behandling, og utførte ELISpot-analyser etter at celler ble utfordret med OVA257e264-antigenpeptidet (støttende informasjon Fig. S2). MVP-behandling utløste et stort hopp i IFN-g-utskillende celler i løpet av tiden, med en toppaktivitet på dag 5 (fig. 2M). Disse resultatene demonstrerte robust DC-stimulering, antigenpresentasjon og T-celleaktivering etter behandling med MVP.

Tabell 1 Sammensetning av nanopartikler innkapslet med eGFP-kodende mRNA.

Tabell 2Lipidsammensetning og ladningsforhold til MVPpartikler.

3.3. MVP fremkaller potent antitumorimmunitet i murine modeller av kolorektal svulst og melanom

MVP ble brukt for å behandle mus med MC38 tykktarmskreft og B16 melanom. I begge modellene blokkerte behandling med OVA mRNA-innkapslet MVP to ganger fullstendig tumorvekst subkutant; til sammenligning hadde ikke behandling med eGFP mRNA-innkapslet MVP eller vehikel alene noen detekterbar hemmende effekt på tumorvekst (fig. 3AeD, støttende informasjon fig. S3). I tråd med mønsteret av et CD4 til CD8-skift i lymfeknuter (fig. 2), observerte vi en økning i CD8þ/CD4þ T-celleforhold i svulster fra mus behandlet med OVA mRNA-innkapslet MVP (fig. 3E). I tillegg oppdaget vi forhøyede nivåer i IFN-gþCD8þ T-celler i miltene, lymfeknuter og svulster hos mus behandlet med OVA mRNA-innkapslet MVP, men ikke med bærer alene eller GFP mRNA-innkapslet MVP (fig. 3FeH, støtteinformasjon Fig. S4). Videre var det en signifikant økning i OVA257e264-MHCI dextramer-positive CD8þ T-celler i svulster fra den OVA mRNA-innkapslede MVP-behandlingsgruppen, noe som indikerer proliferasjon av antigenspesifikke CD8þ T-celler (fig. 3I). ELISpot-analyse med celler isolert fra miltene og lymfeknutene ga ytterligere støtte for T-celleaktivering (fig. 3JeM).

3.4. MVP stimulerer medfødt immunrespons ved å aktivere STING-avhengig signalering

Vi brukte mRNA-kjerne, mRNA-fri bærer og mRNA-innkapslet MVP for å behandle BMDC-er for å identifisere nøkkelfaktorer og veier som er ansvarlige for stimulering av type I IFN og inflammatorisk cytokinuttrykk. Interessant nok var MVP like potent som Tlr7-agonisten imiquimod til å utløse IFN-b-sekresjon, og bærer alene viste også aktivitet i å fremme IFN-b-sekresjon, selv om dens styrke ikke var så høy som MVP; mRNA-kjernen alene var imidlertid ineffektiv til å stimulere IFN-b-sekresjon (fig. 4A). Resultatet antydet at både mRNA og komponenter i bæreren var nødvendig for å maksimere IFN-b-ekspresjon. I mellomtiden viste imiquimod og bærer lignende aktivitet for å fremme TNF-a- og IL-1b-ekspresjon, mens MVP var mye kraftigere enn én av dem (fig. 4B og C). Ekspresjon av CCL5, et cytokin som vanligvis er assosiert med NF-kB og IFN regulatoriske faktorer, ble like stimulert i celler behandlet med imiquimod, bare bærer eller MVP (fig. 4D). TLR7, MAVS, STING og TRIF er nøkkelfaktorer i viktige signaltransduksjonsveier som medierer cellulære responser på viralt RNA og skadet DNA28e30. Vi genererte BMDC-er fra mus med Tlr7, Mavs, Sting eller Trif genet knockout (KO), og behandlet celler med mRNA-kjerne, mRNA-fri bærer eller mRNA-innkapslet MVP for å undersøke IFN-b og TNF-a uttrykk.

Figur 2. Stimulering av immunresponser med MVP. (A) Skjematisk visning av mRNA/protaminkjerne, mRNA-fri bærer og komplett MVP. (BeD) Modning av BMDC etter å ha blitt behandlet med OVA-MVP i 24 timer. (E og F) MHC I-ekspresjon og OVA257e264-antigenepitop-MHC I-kompleks i BMDC-er etter å ha blitt behandlet med OVA-MVP i 24 timer. (G) Nivå av IL-2 fra behandlede BMDCer co-inkubert med B3Z eller OT-I T-celler. (H og I) Flowcytometrianalyse av proliferative T-celler. Representative kromatogrammer av T-celler er vist. (J) DC-modning etter MVP-behandling in vivo. C57BL/6J-mus ble behandlet med OVA-MVP, og DC-er i popliteale lymfeknuter ble analysert. (K og L) T-cellepopulasjonsanalyse. C57BL/6J-mus ble behandlet med bærer eller OVA-MVP, og T-celler i popliteale lymfeknuter ble analysert med flowcytometri. (M) ELISpot-analyse. C57BL/6J-mus ble behandlet med OVA-MVP, og lymfeknuter ble samlet på de angitte tidspunktene. Isolerte celler ble brukt for måling av IFN-g-uttrykkende celler. Data presenteres som gjennomsnittlig SEM (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, ikke signifikant.

Figur 3 Antitumoraktivitet fra MVP. (A) Hemming av MC38-OVA-svulstvekst. C57BL/6J hunnmus ble inokulert subkutant med 5  105 MC38-OVA-tumorceller/mus på dag 0 og behandlet med PBS-kontroll, vehikelkontroll, GFP-MVP eller OVA-MVP på Dag 3 og 10. (B) Hemming av B16-OVA-svulstvekst. C57BL/6J hunnmus ble inokulert subkutant med 2  105 B16-OVA-tumorceller/mus på dag 0 og behandlet med PBS-kontroll, vehikelkontroll, GFP-MVP eller OVA-MVP på dag 3 og 10. (C og D) Bilde og vekt av B16-OVA-svulster på dag 17. (E) T-cellepopulasjon i svulster fra mus etter behandling. (FeH) IFN-gþCD8þ T-celler i milter, lymfeknuter (LN) og svulster hos mus etter behandling. (I) OVA-spesifikke CD8þ T-celler i svulster hos mus etter behandling. (JeM) Bilder og kvantitativ analyse av ELISpot-analyse av milt- og LN-celler fra mus etter behandling. Data presenteres som gjennomsnittlig SEM (n Z 5). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001.

KO-status for Mavs og Sting i BMDCs ble bekreftet med Western blot-analyse (støttende informasjon Fig. S5A). Overraskende nok utslettet Sting KO stimulerende aktivitet på IFN-b-sekresjon fra både bærer alene og MVP (fig. 4E), noe som indikerer at MVP aktiverte type I IFN-ekspresjon gjennom STING. For å støtte oppfatningen oppdaget vi fosforylering av tankbindende kinase 1 (TBK1) (Fig. S5B), en kinase som ofte er assosiert med STING-aktivitet31. I tillegg var denne veien uavhengig av TLR7-signalering, siden IFN-b-ekspresjon ikke ble kompromittert i celler behandlet med imiquimod (fig. 4E). Til sammenligning hadde Trif eller Mavs KO en minimal innvirkning på IFN-b-ekspresjon fremmet av MVP. Som forventet var imiquimod ineffektivt for å stimulere IFN-b-sekresjon i BMDCer avledet fra Tlr7 KO; Tlr7 KO hadde imidlertid en negativ innvirkning på den stimulerende effekten fra MVP (fig. 4E). Interessant nok ble en annen profil observert på TNF-a-sekresjon fra de samme behandlingene. Knockout av Sting, Trif eller Tlr7 hadde ingen til minimal innvirkning på MVP-stimulert cytokinekspresjon. Knockout av Mavs, derimot, reduserte TNF-a-nivåene dramatisk i celler behandlet med enten bærer alene eller MVP (fig. 4F). Resultatet indikerer at MAVS er en nøkkelregulator for TNF-a-uttrykk i DC-er ved MVP-behandling.

3.5. MVP stimulerer STING- og MAVS-veier for å fremme sekresjonen av IFN-I og inflammatoriske cytokiner

For å identifisere komponenter i kjøretøyet som er ansvarlig for stimulering av STING- og MAVS-signalering, forberedte vi kjøretøyer og MVP-er ved å erstatte eller utelate nøkkelkomponenter og brukte dem til å behandle BMDC-er. Sting-agonisten sykliske GMP-AMP (cGAMP) tjente som en positiv kontroll ved å stimulere IFN-b-sekresjon. Ved å erstatte det kationiske lipidet EDOPC i bæreren med et annet positivt ladet lipid, DOTAP, utslettet IFN-b-sekresjonen fullstendig. Til sammenligning ble den stimulerende effekten fra bæreren og MVP beholdt med eller uten protamin, og slik stimulerende aktivitet var avhengig av et intakt Sting-gen (fig. 4G). Interessant nok fremmet ikke BMDC-er behandlet med individuelle komponenter av lipidskallet inkludert EDOPC sterk IFN-b-sekresjon (støttende informasjon Fig. S6). Dermed var EDOPC avgjørende for STING-aktivering, og aktiviteten er avhengig av dannelsen av en lipid-nanopartikkel (dvs. vehikel eller MVP). Vehikel og MVP forberedt med EDOPC eller DOTAP ble også brukt for å behandle BMDCS avledet fra villtype- og Mavs KO-mus, og TNF-nivåer i cellevekstmedier ble bestemt. Som forventet eliminerte utskifting av EDOPC med DOTAP eller DOPC stimulerende innsats fra kjøretøyet og MVP. I tillegg ble TNF-a-nivået betydelig redusert i Mavs KO-celler sammenlignet med villtypeceller, men ikke redusert (fig. 4H), noe som indikerer at ytterligere faktorer kan være involvert i mediering av MVP-stimulert TNF-a-ekspresjon.

3.6. STING-veien er avgjørende for MVP-mediert anti-tumor immunrespons

Både villtype- og knockout-mus ble behandlet med OVA mRNA-innkapslet MVP, og DC-modning og T-celleproliferasjon ble undersøkt. Sting KO reduserte prosentandelen av CD80þ og CD86þ DC-celler og CD69þ T-celler betydelig (fig. 5AeD). ELISpot-analyse avslørte signifikant reduserte IFN-g-produserende celler i miltene og lymfeknutene fra Sting KO-mus sammenlignet med villtypemus etter at de ble behandlet med samme dose MVP (fig. 5EeH). Påvirkningen fra Mavs KO var minimal, da ingen forskjell ble overvåket på CD44þCD8þ minne T-celler, OVA257e264-MHCI dextramer-positive CD8þ T-celler, eller antall IFN-g-produserende celler i lymfeknutene sammenlignet med vill- type mus (fig. 5IeL). Resultatet forsterker forestillingen om at flere faktorer i tillegg til MAVS kan være involvert i MVP-stimulert inflammatorisk cytokinekspresjon. Både villtype- og Sting KO-mus ble påført for å inokulere B16-OVA-svulster, og mus ble behandlet med PBS-kontroll eller OVA-mRNA-innkapslet MVP. Flowcytometrianalyse på lymfeknute- og tumorprøver samlet fra vaksinerte mus viste et betydelig redusert antall IFN-g-produserende CD8þ T-celler i Sting KO-musene (fig. 6A og B). Som et resultat ble tumorvekst fullstendig hemmet i villtypemus behandlet med MVP, sammenlignet med bare delvis hemming hos Sting KO-musene (fig. 6C).

cistanche planteøkende immunsystem

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Diskusjon

I den nåværende studien har vi systematisk undersøkt de funksjonelle rollene til individuelle komponenter i MVP på stimulering av anti-tumor immunresponser. Vår cellebaserte studie har tydelig vist at både mRNA-molekyler og den RNA-frie bæreren i MVP er nødvendig for dens fulle aktivitet for å fremme ekspresjonen av IFN-b og en rekke inflammatoriske cytokiner inkludert IL-1b og TNF -a i dendrittiske celler. Slike cytokiner har vist seg å spille viktige roller i aktivering av dendrittiske celler og vaksinemediert antitumorimmunitet20. Vår studie har også avslørt at stimulering av cytokinproduksjon er avhengig av en rekke viktige signaltransduksjonsveier involvert i medfødt immunsansing inkludert de mediert av STING og MAVS. Mens STING er avgjørende for IFN-b-ekspresjon, er MAVS hovedsakelig involvert i regulering av TNF-a-ekspresjon (fig. 6D). Betydningen av STING-signalering på MVP-mediert antitumorimmunitet er ytterligere demonstrert ved redusert T-celleaktivitet og følgelig kompromittert tumorvekstinhibering hos Sting KO-mus. Dette resultatet er i tråd med andre rapporter om at STING-aktivering bestemmer cytotoksisk T-cellemediert antitumorimmunitet32. MAVS er en nøkkelformidler i RIG-I-reseptoren (RLR) signalering som respons på virusinfeksjon. Aktivering av denne veien fører til en kaskade av inflammatoriske responser33. Det er spennende at T-celleaktivitet ikke er kompromittert i Mavs KO-mus, gitt at MAVS-signalering helt klart spiller en stor rolle i å regulere uttrykket av inflammatoriske cytokiner inkludert TNF-a. En mulig årsak er at stimulering av slike cytokiner av MVP er mediert av flere veier, og forstyrrelse av MAVS-veien reduserer ikke cytokinekspresjon til et lavt nok nivå til å forårsake en betydelig innvirkning. Alternativt kompenseres tapet av MAVS-signalering av de andre banene. Ytterligere studier er nødvendig for å identifisere disse veiene for å forstå virkningsmekanismen til MVP-vaksine ytterligere. Selv om TLR7 tradisjonelt har vært assosiert med mRNA-terapi21, ser det ikke ut til at TLR7-signalering spiller noen stor rolle i å formidle MVP-aktivitet. Bruken av fullt metylerte mRNA-molekyler i den nåværende studien kan ha gjort TLR7-signaleringen mindre relevant. Det har blitt godt demonstrert at RNA-metylering undertrykker gjenkjennelse av TLRs23. TRIF er et nøkkeladapterprotein for TLR3/7/8-signalering28. Knockout of Trif påvirker heller ikke MVP-aktivitet, noe som forsterker forestillingen om at de ovennevnte TLR-ene inkludert TLR7 ikke spiller en stor rolle i å formidle cellulære responser på MVP. Flere Sting-agonister har blitt brukt i utvikling av kreftvaksine, inkludert sykliske dinukleotider og små og store molekylære forbindelser34e37. Slike Sting-agonister må tilsettes som eksterne adjuvanser under vaksinepreparering, noe som tilfører et nytt lag av kompleksitet til vaksinesammensetningen. I tillegg kan den eksternt tilsatte Sting-agonisten forårsake uønskede bivirkninger når den separeres fra mRNA-komplekset. Til sammenligning fungerer vår MVP som en selvadjuvans og fungerer i sammenheng med en kreftvaksine, siden ingen av de individuelle komponentene i vaksinen inkludert EDOPC kan fremme cytokinekspresjon. Interessant nok kan det kationiske fosfolipidet EDOPC ikke erstattes med det ikke-fosfolipidet DOTAP som også er positivt ladet. Det er spennende å spekulere i den potensielle mekanismen for forskjellen mellom disse to kationiske lipidene. Imidlertid har det blitt dokumentert at andre egenskaper til en lipidmolekylkomponent som hydrofobitet kan ha en dyp innvirkning på den generelle funksjonen til en nanopartikkel og dens leveringseffektivitet for nukleinsyrer38. Derfor må man være forsiktig med å velge de riktige molekylene for å forberede en fullt funksjonell mRNA-vaksine. Oppsummert har vi utviklet en potent mRNA-basert terapeutisk kreftvaksine og tildelt individuelle komponenter i vaksinen med deres funksjonalitet. Virkningsmekanismen er ganske forskjellig fra andre mRNA-plattformer som brukes til profylaktiske og terapeutiske intervensjoner. Kunnskapen hentet fra den nåværende studien vil definitivt lede fremtidig utvikling av ytterligere mRNA-terapi.

Figur 4 Fremme av medfødte immunresponser av MVP. (AeD) BMDC-er behandlet med 1 mg/ml imiquimod, 1 mg/ml mRNA-ekvivalent kjerne, bærer eller MVP i 24 timer. IFN-b-, TNF-a-, IL-1b- og CCL5-nivåer ble målt med ELISA. (E og F) IFN-b og TNF-a uttrykk for BMDCer avledet fra villtype og gen knockout (KO) mus. BMDC-er ble behandlet med de angitte reagensene i 24 timer. IFN-b og TNF-a ble målt med ELISA. (G) IFN-b i BMDC-er avledet fra villtype- og Sting-knockout-mus. BMDC-er ble behandlet med 20 mg/ml cGAMP, 1 mg/ml mRNA-ekvivalent kjerne, bærer eller MVP i 24 timer. Kjøretøy (DOTAP): forberedt ved å erstatte EDOPC med DOTAP; bærer (uten protamin): fremstilt ved å utelate protamin. ND: ikke detekterbar. (H) TNF-a i BMDC-er avledet fra villtype- og Mavs-knockout-mus. BMDC-er ble behandlet med 1 mg/ml mRNA-ekvivalent kjerne, bærer eller MVP i 24 timer. Kjøretøy (DOTAP): forberedt ved å erstatte EDOPC med DOTAP; kjøretøy (DOPC): forberedt ved å erstatte EDOPC med DOPC. Data presenteres som gjennomsnittlig SEM (n Z 3). ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, ikke signifikant.

Figur 5 Antitumorimmunresponser hos Sting og Mavs knockout-mus. (AeD) Redusert DC- og T-celleaktivering i Sting knockout-mus. Både villtype- og Sting-knockout-mus ble behandlet med OVA mRNA-innkapslet MVP, og lymfeknuter ble samlet 48 timer senere for DC- og T-cellemåling. (EeH) Reduserte IFN-g-uttrykkende T-celler i milt og lymfeknuter fra Sting knockout-mus. Både bilder av flekker og kvantitative analyser vises. (IeL) Ingen påvirkning på T-celleaktivitet i Mavs knockout-mus. Både villtype- og Mavs knockout-mus ble behandlet med PBS-kontroll eller OVA mRNA-innkapslet MVP, og lymfeknuter ble samlet 48 timer senere for måling av CD44þCD8þ minne T-celler (I), OVA257e264-MHCI dextramer-positive CD8þ T-celler (J), og antall IFN-g-produserende celler (K ​​og L). Data presenteres som gjennomsnittlig SEM (n Z 3 eller 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, ikke signifikant.

Figur 6 Stingavhengig antitumorimmunitet. (A og B) Analyse av IFN-g-uttrykkende T-celler i lymfeknuter og tumorvev etter villtype- og Sting-knockout-mus som bærer B16-OVA-svulster ble behandlet med OVA mRNA-innkapslet MVP. Mus ble behandlet på dag 3 og 10, og lymfeknuter og svulster ble samlet på dag 15. Enkeltceller ble analysert med flowcytometri. (C) Hemming av tumorvekst i villtype- og Sting-knockout-mus. Mus ble behandlet med PBS-kontroll eller MVP på dag 3 og 10. Data presenteres som gjennomsnittlig SEM (n Z 5). *P < 0,05; ****P < 0,001; ns, ikke signifikant. (D) Skjematisk syn på MVP-stimulering av signaltransduksjonsveier som fører til cytokinproduksjon i DC-er. Mens stimulering av IFN-b-ekspresjon utelukkende medieres av STING, er det flere faktorer inkludert MAVS som medierer TNF-a- og IL-1b-ekspresjon.

Referanser

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, et al. Effekten av mRNA-1273 SARS-CoV-2-vaksinen ved fullføring av blindfase. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, et al. Sikkerhet og effekt av en tredje dose BNT162b2 Covid-19-vaksine. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. Overvinne cellulære barrierer for RNA-terapi. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanopartikkelsystemer for å muliggjøre genterapi. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, et al. Lipopolyplex potenserer antitumorimmunitet ved mRNA-basert vaksinasjon. Biomaterialer 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, et al. Systemisk levering av modifisert mRNA som koder for herpes simplex virus 1 tymidinkinase for målrettet kreftgenterapi. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, et al. Systemisk RNA-levering til dendrittiske celler utnytter antiviralt forsvar for kreftimmunterapi. Nature 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L, et al. Viruslignende mRNA-vaksine for kreftbehandling. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA-vaksiner ny æra i vaksinologi. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, et al. CAR T-celler produseres in vivo for å behandle hjerteskade. Science 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Er det noe håp om en HIV-funksjonell kur i tiden for mRNA-vaksiner? Virus 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Struber M, Kirchhoff S, Bukur T, et al. En ikke-inflammatorisk mRNA-vaksine for behandling av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt. Science 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNA-vaksine for kreftimmunterapi. Mol Kreft 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, et al. mRNA i kreftimmunterapi: utover en kilde til antigen. Mol Kreft 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Personlige RNA-mutanomvaksiner mobiliserer polyspesifikk terapeutisk immunitet mot kreft. Nature 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M, et al. En RNA-vaksine driver immunitet ved sjekkpunkthemmer-behandlet melanom. Nature 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, et al. Aktivt tilpasset vaksinasjonsforsøk for nydiagnostisert glioblastom. Nature 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Kreftimmunterapi. En dendritisk cellevaksine øker bredden og mangfoldet av melanom neoantigen-spesifikke T-celler. Science 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Neoantigen-vaksine genererer intratumorale T-celleresponser i fase Ib glioblastomforsøk. Nature 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, et al. Synergistisk aktivering av antitumorimmunitet med en partikkelformet terapeutisk vaksine. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Gir medfødt følelse av mRNA-vaksineadjuvansitet. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Messenger RNA-baserte vaksiner med dobbel aktivitet induserer balansert TLR-7-avhengig adaptiv immunrespons og gir antitumoraktivitet. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Undertrykkelse av RNA-gjenkjenning av Toll-lignende reseptorer: virkningen av nukleosidmodifikasjon og den evolusjonære opprinnelsen til RNA. Immunity 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, et al. IL-1 og IL-1ra er nøkkelregulatorer for den inflammatoriske responsen på RNA-vaksiner. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M, et al. Mekanismer for medfødt og adaptiv immunitet mot PfizerBioNTech BNT162b2-vaksinen. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Erstatningen av hjelpelipider med ladede alternativer i lipidnanopartikler letter målrettet mRNA-levering til milten og lungene. J Control Release 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, et al. Lite forstyrrende RNA for kreftbehandling: overvinne hindringer i levering. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Type I interferonrespons og medfødt immunfornemmelse av kreft. Trender Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Mitotisk progresjon etter DNA-skade muliggjør mønstergjenkjenning i mikrokjerner. Nature 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. DNA-skade starter type I-interferonsystemet via den cytosoliske DNA-sensoren STING for å fremme antimikrobiell medfødt immunitet. Immunitet 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helikasen DDX41 registrerer intracellulært DNA mediert av adapteren STING i dendrittiske celler. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, et al. Størrelsen på terapeutisk STING-aktivering bestemmer CD8þ T-cellemediert antitumorimmunitet. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Mønstergjenkjenning og signaleringsmekanismer for RIG-I og MDA5. Front Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. STING-agonist-formulerte kreftvaksiner kan kurere etablerte svulster som er resistente mot PD-1-blokade. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, et al. Direkte aktivering av STING i tumormikromiljøet fører til potent og systemisk tumorregresjon og immunitet. Cell Rep 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, et al. Levering av mRNA-vaksiner med heterosykliske lipider øker antitumoreffektiviteten ved STING-mediert immuncelleaktivering. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y, et al. En STING-aktiverende nanovaksine for immunterapi mot kreft. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Transfeksjonsaktivitet av binære blandinger av kationiske o-substituerte fosfatidylkolinderivater: den hydrofobe kjernen modulerer fysiske egenskaper og DNA-leveringseffektivitet sterkt. Biophys J 2006;91:3692e706.