Senescence omkobler mikromiljøsansing for å lette antitumorimmunitet

ABSTRAKT

Cellulær senescens involverer en stabil cellesyklusstans kombinert med et sekretorisk program som i noen tilfeller stimulerer immunclearance av senescerende celler. Ved å bruke en immunkompetent leverkreftmodell der senescens utløser CD8 T-celle-mediert tumoravvisning, viser vi at senescens også omformer celleoverflateproteomet for å endre hvordan tumorceller føler miljøfaktorer, som eksemplifisert ved type II interferon (IFN). Sammenlignet med prolifererende celler, oppregulerer senescentceller IFN-reseptoren, blir hypersensibilisert til mikromiljø-IFN og induserer mer robust de antigenpresenterende maskineri-effektene som også rekapituleres i humane tumorceller som gjennomgår terapiindusert senescens. Forstyrrelse av IFN-sensing i senescerende celler sløver deres immunmedierte clearance uten å deaktivere senescenstilstanden eller dens karakteristiske sekretoriske program. Resultatene våre viser at aldrende celler har en forbedret evne til å både sende og motta miljøsignaler og antyder at hver prosess er nødvendig for effektiv immunovervåking.

cistanche planteøkende immunsystem

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

BETYDNING:

Vårt arbeid avdekker et samspill mellom vevsremodellering og vevsfølende programmer som kan bli engasjert ved senescens i avanserte kreftformer for å gjøre tumorceller mer synlige for det adaptive immunsystemet. Denne nye fasetten av senescence etablerer gjensidige heterotypiske signalinteraksjoner som kan induseres terapeutisk for å forbedre antitumorimmunitet.

INTRODUKSJON

Cellulær senescens er et stressresponsprogram preget av en stabil cellesyklusstans og et sekretorisk program som er i stand til å remodellere vevsmiljøet (1). I normalt vev bidrar senescens til vevshomeostase under sårheling; I aldret eller skadet vev kan imidlertid avvikende akkumulering av senescentceller forårsake kronisk betennelse og redusert vevsregenerasjonsevne (2–4). Ved kreft har senescens vist seg å mediere både gunstige og skadelige effekter på vevsbiologi. På den ene siden gir senescens en barriere for onkogeninitiert tumorigenese og bidrar til antitumoraktiviteten til enkelte kreftterapier (5, 6). På den annen side kan persistensen av senescent tumorceller etter terapi produsere et vevsmiljø som fremmer tilbakefall og metastasering (7, 8). Det molekylære grunnlaget for disse motstridende biologiske utgangene er fortsatt dårlig forstått. En fasett av senescensprogrammet som sannsynligvis vil bidra til så mangfoldig biologi er den senescensassosierte sekretoriske fenotypen (SASP; ref. 9). SASP aktiveres gjennom en global kromatinremodelleringsprosess som utvikler seg og kontrolleres av sentrale epigenetiske regulatorer som BRD4 og proinflammatoriske transkripsjonsfaktorer som NF-κB og C/EBP- (10–12). Dette fører igjen til induksjon av gener som koder for vevsremodellerende proteiner som matrisemetalloproteinaser, vekstfaktorer og fibrinolytiske faktorer som er kjent for å spille avgjørende roller i sårhelingsprosessen (3, 13, 14). Andre SASP-komponenter inkluderer kjemokiner og cytokiner som kan endre sammensetningen og tilstanden til immunceller i vevet, noe som fører til immunmediert målretting og fjerning av selve senescentcellene (15, 16). Ikke desto mindre impliserer den avvikende akkumuleringen av senescerende celler i mange patologiske sammenhenger at immunmediert clearance ikke er et universelt resultat av senescens eller SASP og øker muligheten for at ytterligere mekanismer dikterer de paradoksalt gunstige og skadelige effektene av senescens i vevsbiologi og immunovervåking. (17–19).

Gjerne, alderdomsassosiert immunovervåking kan ha potente antikrefteffekter, selv om de nøyaktige effektormekanismene varierer med vev og celletype (10, 15, 16, 20). I musemodeller av hepatocellulært karsinom (HCC) blir levertumorceller trigget til alderdom eliminert av immunavhengige mekanismer engasjert av villtype (WT) p53 (15). I enighet er TP53 ofte mutert i humant HCC, spesielt i "proliferasjonsklassen"-svulster som viser den dårligste prognosen (21, 22). Selv om immunterapi og TP53-målrettingsmedisiner dukker opp som lovende strategier for å forbedre sykdomsutfall, er det molekylære grunnlaget for respons og resistens fortsatt ukjent (23–25). Derfor kan det å forstå mekanismene som aldrende levertumorceller blir synlige for immunsystemet lette strategier for å fremkalle antitumorimmunitet i TP53-mutert HCC som kan strekke seg til andre tumortyper.

Her bestemte vi oss for å etablere prinsipper som modulerer immungjenkjenning og fjerning av senescerende celler for å identifisere handlingsbare senescensmekanismer som kan utnyttes for å forbedre immunkontrollen av kreft. For dette formål utviklet vi en ny "senescens-induserbar" modell der leverkreftceller selektivt kan byttes til en senescerende tilstand gjennom genetisk modulering av endogen p53. Vi begrunnet dette ville etterligne effekten av terapier som utløser senescens (26, 27), samtidig som man unngår de forvirrende effektene av senescens-induserende terapier på immunceller eller andre komponenter i vevsmiljøet. Ved å bruke denne modellen og deretter utvide den til andre systemer, avslører vi at alderdom i tillegg til SASP driver en stor remodellering av celleoverflatens proteom og signaleringsprogrammer på en måte som er spådd å fundamentalt endre måten cellene føler og reagerer på miljøet. signaler, eksemplifisert her gjennom overfølsomhet overfor mikromiljø type II IFN (IFN). Denne prosessen muliggjør en mer robust oppregulering av antigenprosesserings- og presentasjonsmaskineriet i senescent tumorceller som gjør dem mottakelige for immunovervåking in vivo. Dermed avslører resultatene våre et omkoblet vevsfølingsprogram i senescerende celler som virker i samspill med SASP for å øke deres immunogene potensial, og dermed lette immunmediert tumoravvisning.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

RESULTATER

En p53-Restituerbar immunkompetent tumormodell for å studere alderdomsovervåking

For å studere hvordan senescens omprogrammerer celle- og vevstilstander, utnyttet vi en hydrodynamisk haleveneinjeksjon (HTVI)-teknikk (28) for å generere en senescens-induserbar leverkreftmodell kontrollert av en tumorspesifikk, restaurerbar p53 kort hårnåls-RNA (shRNA). Nærmere bestemt ble voksne leverhepatocytter av immunkompetente Bl/6-mus transfektert in vivo med en sovende skjønnhet SB13-transposase-vektor og to transposonkonstruksjoner (som koder for NrasG12D-IRES-rtTA og TRE-tRFP-shp53, eller "NSP") som integreres i genomet . I dette Tet-On-systemet undertrykkes endogen p53 i nærvær av doksycyklin (Dox) gjennom aktivering av induserbart shRNA koblet til RFP (fig. 1A), noe som muliggjør genetisk kontroll av senescens i etablerte svulster. I samsvar med samtidig forekomst av mutasjoner som inaktiverer TP53 og aktiverer celleproliferasjonssignalveier (f.eks. PI3K/AKT- og RAS/MAPK-kaskader) i humane levertumorer, førte samarbeidet mellom onkogen RAS og undertrykkelse av p53 til hepatocytttransformasjon, med de fleste mus som utvikler svulster med dårlig differensierte egenskaper 5 til 8 uker etter HTVI. Transkripsjonsprofilering avslørte at disse murine svulstene ligner "sprednings"-klassen av humant HCC (Supplementary Fig. S1A–S1F), som er den typiske klassen av humane HCC som huser TP53-mutasjoner (21, 22, 29).

Basert på tidligere arbeid (15), forventet vi at p53-reaktivering i systemet ovenfor ville utløse senescens og engasjere antitumorimmunitet. Følgelig utløste Dox-uttak dramatiske tumorregresjoner over flere uker, noe som førte til forlenget dyrs overlevelse (fig. 1B og C). Analyse av svulstene 14 dager etter tilbaketrekking av Dox avslørte den forventede nedreguleringen av p53 shRNA (som visualisert av den koblede RFP-reporteren) og akkumulering av senescensassosiert -galaktosidase (SA- -gal) uten noen merkbare effekter på RAS-effektor p-ERK (Fig. 1D). På samme måte ble en økning i SA- -galaktivitet og SASP-assosierte transkripsjonsprofiler, sammen med en samtidig proliferativ arrestasjon, observert i eksplanterte tumorceller 6 til 8 dager etter p53-restaurering (tilleggsbilde S2A– S2H). Det er verdt å merke seg at innpodning av disse kulturene (holdt på Dox for å opprettholde p53-demping) i Dox-matede immunkompetente mus ga synkrone og fokale sekundære svulster som gikk tilbake med lignende kinetikk som de primære svulstene ved tilbaketrekking av Dox (Fig. 1B; Supplerende Fig. S3A– S3E). Kontrolleksperimenter ved bruk av et Tet-Off-system eller inkorporering av et konstitutivt p53 shRNA utelukket muligheten for at Dox selv hadde noen effekt på tumoratferd i vår modell (Supplerende Fig. S3F og S3G). Derfor tillater dette systemet effektiv induksjon av senescens i tumorceller uten å ty til terapier som også kan endre vertens immunsystem. Gitt dens ekstra fleksibilitet, brukte vi den ortotopiske transplantasjonsmodellen (heretter referert til som "NSP") for mange av de mekanistiske studiene beskrevet nedenfor. Som forventet var de markerte tumorregresjonene nevnt ovenfor immun-mediert. Derfor gjennomgikk NSP-svulster som oppsto etter transplantasjon til immunkompromitterte nakenmus og Rag2−/−Il2rg−/− (R2G2) mus en fremtredende cytostatisk respons, men klarte ikke å regressere, med R2G2-dyr som viste de mest dyptgripende defektene (fig. 1E–G; Supplerende Fig. S3H og S3I). Siden nakne mus er defekte i adaptiv immunitet og R2G2 også er kompromittert for aspekter av medfødt immunitet, antyder disse resultatene at det adaptive immunsystemet er avgjørende for effektiv tumorregresjon i modellen og etablere en godt kontrollert eksperimentell kontekst for å utforske det mekanistiske grunnlaget for disse effektene.

cistanche planteøkende immunsystem

Senescence utløser en overgang fra tumorimmununnvikelse til immungjenkjenning

For å karakterisere de tumor-undertrykkende parakrine effektene av senescens, karakteriserte vi deretter immunmikromiljøene til svulster som huser p53-undertrykt (referert til som "prolifererende") og p53-restaurert (referert til som "senescent" ) tumorceller etter 1 uke med Dox-abstinens, et tidspunkt da senescens er etablert, men svulster har ennå ikke gått tilbake (supplerende figurer S2, S3 og S4A). Lesjoner som huser senescent tumorceller viste en ~1.8- ganger økning i totalt CD45+ immunceller sammenlignet med prolifererende kontroller (fig. 2A; ref. 15, 16). Immunfenotypiske og histologiske analyser (på dag 9 etter uttak av Dox) viste at dette innebar en fremtredende økning i prosentandelen lymfocytter (B-celler, CD4 T-celler og CD8 T-celler) og en nedgang i prosentandelen Gr1+ myeloid-avledede suppressorceller/nøytrofiler (CD11b+Gr1+Ly6Clo; Fig. 2B; Supplerende Fig. S4B). Selv om brøkdelen av makrofager som en prosentandel av den totale CD45-populasjonen forble uendret, ble de absolutte tallene markant økt (Fig. 2A og B; Supplerende Fig. S4C-S4E). Innenfor T-cellepopulasjonen viste akkumulerende CD8 T-celler markører for antigenopplevelse (CD44+, CD69+) og hadde en økt populasjon av effektorceller (CD44+CD62L−; Fig. 2C; ref. 30). Denne generelle ombyggingen av immunmiljøet førte til en betydelig økning i CD3:nøytrofilforholdet for svulster som huser senescentceller (tilleggsfig. S4F), effekter som samsvarer med lignende økninger i CD3:nøytrofilforholdet som har vært assosiert med immunreaktivitet hos mennesker leversvulster (31). Ombyggingen kunne visualiseres ved hjelp av 3D-avbildning etter vevsrensing (fig. 2D; tilleggsfigur S4G og S4H; tilleggsvideo S1; ref 32).

Figur 1. En p53-restituerbar tumormodell for å studere senescens-immunovervåking. A, Generering av den p53-restaurerbare, NRAS-drevne museleverkreftmodellen ved bruk av sleeping beauty transposon-systemet levert gjennom HTVI. (Opprettet med BioRender.com.) B, Representativt ultrasonogram av leverkreftmodeller for HTVI og ortotopisk injeksjon på det angitte tidspunktet etter p53-restaurering. C, Overlevelsesanalyse av mus i HTVI-modellen. D, representativt hematoksylin og eosin (H&E), immunfluorescens (IF) og senescensassosiert -galaktosidase (SA- -gal) farging av p53-undertrykt (p53 av) og -restaurert (p53 på for 14 dager) tumorseksjoner generert fra HTVI-modellen. Målestokk, 5{{30}} μm. EG, Ortotopisk injeksjon av GFP-luciferasevektor-transduserte NSP-tumorceller i leverene til immunkompetente og immundefekte musestammer. E, Tumorstørrelsesendring målt ved ultralyd ved p53-restaurering. R2G2, Rag2-Il2rg dobbel knockout-mus. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. n Større enn eller lik 9 for hver stamme. F, Representative makroskopiske bilder etter 21 dager av p53 på eller endepunkt p53 utenfor svulsten. G, Representativ IHC-farging av GFP-merkede tumorceller på dag 21 ved p53-restaurering. Skalastaver, 100 μm. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

For å finne de spesifikke immuncelletypene som er ansvarlige for immunovervåkingen av senescent tumorceller, genererte vi parallelle kohorter av mus som huser ortotopiske NSP-svulster og undersøkte virkningen av utarming av ulike immuncellepopulasjoner på tumorregresjoner etter Dox-uttak. Mens blokkerende antistoffer rettet mot nøytrofiler/monocytter (Gr1), naturlige drepeceller (NK1.1) og CD4 T-celler (GK1.5) ikke hadde noen effekt, uttømming av CD8 T-celler (2.43) og makrofager (ved bruk av liposomalt klodronat) , som selektivt retter seg mot makrofager (CD11b+F4/80+), men ikke klassiske dendrittiske celler (CD11b-CD11c+MHC-II+CD103+; ref. 33, 34), svekket tumorregresjon markant (fig. 2E; Supplerende Fig. S4I). For å karakterisere hvordan p53-drevet tumor-aldring resulterer i produktiv antitumor-immunitet, utførte vi enkeltcelle-RNA-seq (scRNA-seq)-analyse av nyisolerte CD45-celler fra prolifererende og senescent NSP svulster tidlig etter Dox-abstinens (8 dager; Supplerende Fig. S5A og S5B) og brukte algoritmen for differensialoverflodstesting Milo (35) for å fange opp celletilstandsforandringer i immuncelletypene som medierer denne prosessen (Supplerende Fig. S5C–S5F). i tråd med deres bidrag til tumorregresjon, viste CD8 T-celle- og makrofagsubpopulasjonene markerte endringer i mengde og tilstand. Når det gjelder T-celler, ble prolifererende (p53-undertrykte) svulster betydelig beriket i CD8 T-tilstander som viste høy ekspresjon av både dysfunksjonsmarkører (Tox, Tigit, Lag3, Ctla4, Pdcd1/PD1 og Cd160) og aktiveringsmarkører (Prf1) Fig. 2F og G, tilleggsfigur S5G, tilleggstabell S1). Disse CD8 T-cellene viste også høye nivåer av Tnfrsf9, en markør kjent for å avgrense T-celleundergrupper som har kapasitet til å bli gjenopplivet i humant HCC og andre krefttyper (36, 37). I sterk kontrast, i senescent (p53-reaktiverte) lesjoner, virket CD8 T-populasjoner svært aktivert, og viste lave nivåer av dysfunksjonsmarkører og høy ekspresjon av effektorcytokiner (f.eks. Ifng, Tnf; tilleggstabell S1). Følgelig viste transkripsjonsprofileringen av bulktumorvev immunaktive og cytotoksiske signaturer i eldre svulster som gjennomgikk regresjon (Supplerende Fig. S5H; ref. 38).

Figur 2. Senescens utløser en immununnvikelse-til-immungjenkjenningssvulstbryter. A, Representative bilder av CD45- og GFP-farging som markerer henholdsvis immunceller og tumorceller i p53-undertrykte og p53-restaurerte svulster (7 dager etter p53-restaurering). Høyre, kvantifiseringen av arealet av CD45+-farging ble beregnet fra 3 tilfeldige felt per mus. Hver prikk representerer en mus. B, Flowcytometrianalyse av det globale immunlandskapet i en ortotopisk NSP-levertumormodell. Immunfenotyping av aldrende svulster utføres 9 dager etter Dox-uttak, et tidspunkt når aldringstilstanden er fullt etablert, men forut for den massive svulstregresjonen. G-MDSC, granulocytiske myeloid-avledede suppressorceller; M-MDSC, monocytiske myeloid-avledede suppressorceller. Data samles fra 2 uavhengige eksperimenter, med n=7 i den prolifererende gruppen og n=9 i den senescent gruppen. Merk at ettersom det absolutte antallet CD45+-celler øker i senescent NSP-tumorlesjoner (A), øker det totale antallet av de angitte celletypene. C, Flowcytometrianalyse av CD8 T-celler. Data er samlet fra 2 uavhengige eksperimenter, med n=11 i de prolifererende og n=10 i de eldre gruppene. Eksperimenter ble utført 9 dager etter Dox-uttak. D, Representative vevsrensende bilder av de ortotopiske NSP-leversvulstene. T-celler, nøytrofiler og vaskulatur er merket med henholdsvis CD3-, MPO- og CD31-farging. Prøver ble samlet 9 dager etter tilbaketrekking av Dox. E, Tumorstørrelsesendring målt ved ultralyd ved p53-restaurering i mus etter utarming av spesifikke immuncelletyper ved bruk av antistoffer eller medikamenter. F, venstre, uniform manifold tilnærming og projeksjon (UMAP) plott av CD8 T-celler isolert fra p53-undertrykte prolifererende (PRO) og p{{30}}reaktiverte senescent (SEN) tumorer. Høyre, gensettanrikningsanalyse av T-celle utmattelsesmarkørgener i CD8+ T-celler fra prolifererende (p53-undertrykte) versus senescent (p53-reaktiverte) svulster. NES, normalisert berikelsesscore; Pval, P-verdi. G, UMAP-plott av ekspresjonen av utvalgte gener (Cd8a, Cd44, Tnfrsf9, Cd69, Tox og Fasl) mellom CD8 T-celler isolert fra senescent (p{{40}}reaktivert) og prolifererende (p{ {41}}undertrykte) svulster. H, Representative immunofluorescensbilder av CD8 T-celler og F4/80-positiv makrofagfarging i den ortotopiske NSP-levertumoren. Tumorprøver ble tatt 9 dager etter Dox-uttak. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Alle målestokker, 100 μm. En to-halet Student t-test ble brukt. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

Endringer i makrofagrommet ga ytterligere bevis på at svulstcelle-aldring utløste en immununnvikelse-til-overvåkingsbryter. Derfor indikerte scRNA-seq, immunfenotyping og histologi at tumorassosierte makrofagfenotyper gikk over fra F4/80lo; CD11chi-tilstander (cluster 8), inkludert immunsuppressive PD-L1+-populasjoner (karakteristisk for humane HCC-svulster med dårlig prognose; ref. 39, 40) til F4/80hi; CD11c-tilstander (klynge 0), definert ved høy ekspresjon av en antigenpresentasjonsgensignatur (tilleggsfigurer S5E–S5J og S6A og S6B; tilleggstabell S1). Merk at disse alderdomsassosierte F4/80hi; CD11c−-makrofager var spesielt følsomme for liposomal klodronatbehandling (Supplerende Fig. S6C–S6E), noe som også resulterte i en betydelig reduksjon i fraksjonen av aktive CD8, men ikke CD4 T-celler (Supplerende Fig. S6F og S6G), noe som indikerer en CD8 T-avhengig immunrespons som involverer samarbeid med makrofager. Følgelig bekreftet histologiske analyser at akkumulerende CD8-T-celler og F4/80+-makrofager ofte ble co-anriket etter alderdomsinduksjon i svulster (Fig. 2H; Supplerende Fig. S4D). Til sammen støtter disse biologiske og molekylære analysene en modell der svulstcellealdring induserer en brå overgang fra immununnvikelse til immunovervåking mediert av endringer i makrofager og CD8 T-celletilstander, noe som fører til produktiv antitumorimmunitet og, til slutt, tumoravvisning.

Senescence remodellerer vevssensorprogrammer og celleoverflatelandskap

Vi satte deretter ut for å utnytte modellen ovenfor for å forstå de molekylære mekanismene som er ansvarlige for å gjøre senescent tumorceller synlige for immunsystemet. Senes cence-induksjon involverer et kromatin-remodelleringsprogram som demper proliferative gener og aktiverer mange gener som koder for SASP-faktorer, hvor sistnevnte program i stor grad er avhengig av enhancer-leseren BRD4 (10). Vi utførte derfor transkripsjonelle profileringseksperimenter på NSP-celler under prolifererende (p53-undertrykte) versus senescent (p53- gjenopprettet) tilstander i fravær og nærvær av JQ1, et medikament som hemmer BRD4-funksjonen (tilleggstabell S2) ). I samsvar med forventningene reduserte p53-restaurering dramatisk uttrykket av proliferative gener og induserte ekspresjonen av velkjente SASP-faktorer (Fig. 3A; Supplerende Fig. S7A; ref. 7), inkludert flere cytokiner kjent for å stimulere T-celler (Cxcl16, Il18) ) eller makrofagaktivering og rekruttering (Csf2, som koder for protein GM-CSF) eller tidligere knyttet til senescens (Igfbp7, Igfbp3, Pdgfa). Som forventet fra tidligere arbeid (10), var mange av de oppregulerte SASP-kodingstranskripsjonene (~65%) BRD4-avhengige (Supplerende Fig. S7B). Tilsvarende ble en rekke vekstfaktorer og immunmodulatorer utskilt fra de senescerende cellene, som vurdert ved multipleksede cytokinanalyser, inkludert T-celle- og makrofagattraksjonsmidlene CCL5, CXCL9 og GMCSF, samt vaskulaturremodelleringsfaktoren VEGF (Supplementary Fig. S7C). Derfor er senescens i p53-restaurerte NSP-tumorceller assosiert med en robust SASP, i samsvar med den markerte ombyggingen av immunøkosystemet karakterisert ovenfor.

Påfallende nok viste undersøkelse av den subcellulære lokaliseringen for differensielt uttrykte gener (DEG) at senescent tumorceller ikke bare økte deres ekspresjon av utskilte ("ekstracellulære," EC) SASP-faktorer, men også viste store endringer i ekspresjonsnivåene til transkripsjoner som koder for overflateproteiner. ("plasmamembran," PM; fig. 3B). Faktisk kodet 25 % av totale oppregulerte DEG-er for PM-proteiner, en betydelig berikelse som avvek fra den tilfeldige fordelingen (15 %; Fig. 3B). Dynamiske PM-DEG-er ble koblet til proteintyrosinkinase-signaltransduksjon (Nrp1, Egfr), cytokinreseptoraktivitet (Ifngr1), ekstracellulære matrisereseptorer (Itgb3, Cd44) og ionetransportører (Slc12a1, Slc24a3) og fangede kjente senescens- Cd44, Vcam1 og Itgb3), noe som tyder på at aldrende celler kan ha en forbedret evne til å samhandle med og føle omgivelsene deres (fig. 3C; tilleggsfigur S7D; ref. 41–43). Interessant nok ble den senescensassosierte økningen i ekspresjonen av mange av disse PM-proteinene sløvet av JQ1, noe som tyder på at deres induksjon kan være en del av det bredere kromatinremodelleringsprogrammet koblet til SASP (fig. 3D; ref. 10). Det er verdt å merke seg at dyptgripende endringer i transkripsjonen av gener som koder for PM-proteiner også skjedde i p53-mangelfulle NSP-tumorceller behandlet med den senescens-induserende medikamentkombinasjonen trametinib og palbociclib (tilleggsfigur S7E, topppanel; tilleggstabell S2; ref. 20) og i en serie med 13 genetisk forskjellige TP53 WT- og TP53--mutante humane kreftlinjer avledet fra lever-, bryst-, lunge- og tykktarmskreft indusert til alderdom av forskjellige triggere (fig. 3E; Supplerende fig. S7F; ref. 44). Dette var spesielt robust for oppregulerte (men ikke nedregulerte) PM-DEG-er, som minner om effekter observert for EC SASP-faktorer (Fig. 3E; Supplerende Fig. S7E, bunnpanel). Derfor strekker det markant endrede uttrykket av celleoverflateproteiner vi observerte i modellen vår utover p53-indusert senescens og kan være et kjennetegn på senescenstilstanden.

Figur 3. Senescence remodellerer vevsfølende programmer og celleoverflatelandskap. A, Gensett-anrikningsanalyse (reaktom) av RNA-seq-data fra prolifererende (PRO, p53 av) versus senescent (SEN, p53 på i 8 dager) NSP-levertumorceller in vitro. NES, normalisert berikelsespoeng. B, Subcellulær lokalisering av DEG (P < 0.05; fold endring > 2) i alle påviste gener [transkripsjoner per kilobase million (TPM) > 1] fra RNA-sekv. C, Genontologi (GO) analyse av DEG-er som koder for PM-proteiner oppregulert i senescentceller. TM, transmembran. D, transkriptomisk analyse av alle DEG-er (prolifererende vs. senescent) i nærvær eller fravær av JQ1-behandling. C1-klyngen (i rødt) inneholder de senescensspesifikke genene som er følsomme for JQ1, og C4-klyngen (i blått) inneholder de spredningsspesifikke genene som er følsomme for JQ1. E, Meta-analyse av RNA-seq datasett fra SENESCopedia ved å utføre subcellulær lokalisering av DEGs (samme som Fig. 2D) og Fisher eksakt test for å undersøke den relative berikelsen av oppregulerte og nedregulerte EC/PM-DEGs avvek fra den tilfeldige fordelingen. Se også tilleggsbilde S7E og S7F. F, Massespektrometri (MS) analyse av PM-anriket proteom i prolifererende og senescerende celler. Proteinnivået er normalisert til gjennomsnittlig uttrykk for proteinet i alle prøvene. Kontroller er prøvene uten biotinmerking som tjener som bakgrunn. Røde og blå bokser representerer proteiner beriket i henholdsvis senescent og prolifererende celler. n=6 for både aldrende og prolifererende eksperimentelle grupper, og henholdsvis n=3 og 4 for deres kontroll. G, Distribusjon av oppregulerte og nedregulerte GeneCards kommenterte PM-proteiner profilert av MS. NC, ingen endring. H, Vulkanplott av GeneCards-annoterte PM-proteiner profilert av MS.

For å validere den globale ombyggingen av PM-faktorer i senescens på proteinnivå, utførte vi overflateproteomikk på isogene prolifererende og senescerende NSP-tumorceller, ved å bruke en biotinmerkende anrikningsmetode, der celleoverflateproteiner ble merket med membranugjennomtrengelig biotin, renset, og utsatt for massespektrometri (fig. 3F; tilleggsfig. S7G; ref. 45). En sterk korrelasjon mellom biologiske replikater under hver tilstand ble observert (Supplerende Fig. S7H), med påviste proteiner som ble beriket for annoterte PM-proteiner med 60 % etter induksjon av p53-indusert senescens. Av 887 proteiner som ble reproduserbart påvist, ble mer enn 50 % differensielt uttrykt. De fleste differensielt uttrykte proteiner korrelerte godt med retningsevnen observert i transkripsjonsprofileringsdataene våre, selv om noen ble differensielt uttrykt uten en tilsvarende endring i transkripsjonsnivåer (tillegg Fig. S7I).

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

Annoterte celleoverflateproteiner detektert ved massespektrometri ved senescensinduksjon inkluderte flere tidligere knyttet til senescens (f.eks. CD44 og VCAM1), forskjellige vekstfaktor- og cytokinreseptorer (f.eks. EGFR, ICAM1 og IFNGR1) og andre mindre karakteriserte faktorer (fig. 3F–H; tilleggsfigur S7J og S7K). Merk at settet med celleoverflateanrikede proteiner identifisert i vår modell viste begrenset overlapping med de som ble identifisert i humane fibroblaster som gjennomgikk onkogenindusert senescens (46), noe som tyder på heterogenitet mellom celletyper eller senescensutløsere. Uansett viser disse resultatene at i tillegg til å koble om i sekretorprogrammet deres, gjennomgår senescerende celler dyptgripende endringer i innholdet og forekomsten av celleoverflateproteiner og antyder at senescentceller får særegne mikromiljøsansende egenskaper som kan påvirke deres tilstand og skjebne in vivo .

Aldrende celler er primet for å registrere IFNg og forsterke IFNg-signalering

For å identifisere veier som funksjonelt kan påvirke hvordan senescerende celler føler miljøet sitt, gruvede vi transkripsjonelle og proteomiske datasett for senescensassosierte endringer knyttet til antitumorimmunitet. Interessant nok viste genontologi (GO)-analyse at type II interferon gamma (IFN)-respons (47) var blant de 5 beste kommenterte banene beriket under senescens og avhengig av celletilstandsspesifikke forsterkerprogrammer (dvs. JQ1-sensitive dvs. "Cl" i fig. 3D; tilleggsfig. S8A). Blant de endrede transkripsjonene bemerket vi flere positive regulatorer av IFN-signalering, inkludert IFN-reseptorunderenheten IFNGR1 (et av de mest signifikant oppregulerte proteinene fra våre proteomiske data) og flere interferoneffektorer (Irf1, Irf7 og Irf9; ref. 47, 48 ; Fig. 4A–C; Supplerende Fig. S8B og S8C). I tillegg til disse Brd4-sensitive-oppregulerte genene, ble transkripsjoner som koder for negative regulatorer av IFN-signalering (Ptpn2, Socs1 og Socs3) betydelig redusert (fig. 4C; ref. 49, 50). Lignende endringer ble observert i NSP-tumorceller behandlet med forskjellige alderdomsindusere (fig. 4C; Supplerende fig. S8D–S8G) og, mer generelt, i et panel av 13 humane bryst-, lunge-, lever- og tykktarmskreft. cellelinjer utløst til alderdom (fig. 4D; ref. 44). Derfor er endringer i uttrykket av type II IFN-signaleringskomponenter et generelt trekk ved senescerende celler, uavhengig av celletype, cellegenotype, art og arten til senescens-induktoren. Den samtidige økningen i IFN-signaleffektorer og reduksjonen i negative regulatorer førte til at vi antok en hypotese om at senescerende celler blir klargjort til å føle IFN i miljøet. For å teste denne hypotesen direkte, behandlet vi prolifererende og senescent NSP-celler med rekombinant IFN og utførte immunoblotting-analyser av JAK-STAT-signalaktivering. Selv om IFN dramatisk økte baseline-nivåene av STAT1 i begge stater, akkumulerte senescentceller mer fosforylert STAT1, uavhengig av senescensutløseren (fig. 4E; Supplerende fig. S8H). I tillegg fant vi også et økt nivå av fosforylert JAK1 i p53- restaurerte senescentceller, noe som ytterligere støtter funnene våre på en mer aktiv JAK–STAT-signalvei i senescentceller som registrerer IFN (Supplementary Fig. S8I). Som forutsagt fra transkripsjonsanalyser, utløste senescens også en reduksjon i PTPN2-protein (51), uavhengig av tilstedeværelsen av eksogent IFN (fig. 4E). Således aktiverer senescentceller mer effektivt IFN-signalering som svar på begrensende konsentrasjon av IFN i miljøet.

Senescence og EC IFNg oppregulerer i samarbeid antigenbehandlings- og presentasjonsmaskineriet

For bedre å forstå det funksjonelle bidraget til IFN-sensing til senescensprogrammet, sammenlignet vi deretter de fenotypiske og transkripsjonelle tilstandene av prolifererende og p53-restaurerte senescerende NSP-tumorceller behandlet med rekombinant IFN ved en lav (50 pg/ml) eller høyere (1 ng/ml) dose. Selv om tilsetningen av eksogent IFN til prolifererende eller senescent tumorceller hadde en ubetydelig effekt på levedyktigheten, proliferasjonen eller SASP-genekspresjonen til hver celletype ved dosene som ble testet (fig. 5A; Supplerende fig. S9A–S9D), markerte endringer i IFN pathway genuttrykk knyttet til senescent tilstand ble observert. Spesifikt avslørte overvåket klynging av Hallmark "IFN-responssignaturen" på tvers av prolifererende og senescerende celler tre DEG-moduler: (i) gener som nedreguleres under senescens uavhengig av IFN (inkludert de nevnte negative regulatorene); (ii) gener som er oppregulert under senescens uavhengig av IFN; og interessant nok (iii) et betydelig sett med DEG som er indusert i samarbeid av kombinasjonen av senescens og IFN (fig. 5B). Derfor utløser senescens kvantitative og kvalitative endringer i den transkripsjonelle responsen på IFN. En veletablert utgang av IFN-signalering som regulerer cellenes følsomhet for adaptiv immunovervåking er en økt kapasitet for antigenpresentasjon mediert av MHC klasse I-molekyler (MHC-I; ref. 47, 52). Faktisk inkluderte mange av genene oppregulert i senescentceller (klasse ii-gener) eller superindusert i nærvær av eksogent IFN (klasse iii-gener) komponenter i antigenpresentasjonsmaskineriet. Blant genene indusert under senescens (klasse ii-gener) var Tap1, transportører assosiert med antigenprosessering, og Psme1, en proteasomfaktor assosiert med antigenprosessering (53). De som var overfølsomme for eksogene IFN (klasse iii gener) inkluderte Nlrc5, en transkripsjonell koaktivator av MHC-I gener (54); MHC-I-monteringsfaktoren Tapbp; og MHC-I-underenheten B2m. To andre klasse iii gener var komponenter av immunoproteasomet (Psmb8 og Psmb9) hvis handlinger kan endre repertoaret av presenterte peptider når de overuttrykkes og er assosiert med en forbedret tumorrespons på immunkontrollpunktblokkade (55). Denne forsterkede produksjonen av IFN i senescentceller ble bekreftet av RT-qPCR og ble beholdt på enda høyere nivåer av eksogent IFN (fig. 5C; tilleggstabell S3). I samsvar med den multifaktorielle prosessen beskrevet ovenfor, ble denne effekten ikke observert i prolifererende tumorceller, selv de som overuttrykker et IFNGR1-cDNA og/eller behandlet med IFN (Supplerende Fig. S10A–S10D).

Figur 4. Eldgamle celler er primet til å registrere og forsterke IFN-signalering. A og B, IFNGR1-nivå på prolifererende og senescerende celler profilert ved massespektrometri (A) og validert ved flowcytometri (B). AU er en vilkårlig enhet. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. n=6 for både sprednings- og aldersgruppen. C, transkriptomisk analyse av utvalgte gener som regulerer IFN-signalering fra RNA-seq-data fra 3 uavhengige p53-restituerbare cellelinjer (NSP, NSM2 og NSP5) som gjenoppretter p53 sammen med NSP-celler behandlet med to andre senescensutløsere. SEN/PRO, senescent/proliferating; T + P, trametinib pluss palbociclib. D, mRNA-ekspresjon av utvalgte gener involvert i IFN-signalering i humane cellelinjer utløst til alderdom. Behandling: Ali, alisertib; Eto, etoposid; tallet angir lengden på behandlingen (dager). Data er hentet fra det offentlige datasettet SENESCopedia (44). E, Topp, immunoblotanalyse av NSP-celler under forskjellige senescent-utløsere i nærvær eller fravær av IFN (1 ng/ml). Nederst, kvantifisering av intensiteten til signalet fra immunoblot. p-STAT1, fosfo-STAT1 (Tyr701).

Også i samsvar med genuttrykksendringene beskrevet ovenfor, oppregulerte senescent tumorceller MHC-I mer robust som respons på lave nivåer av eksogent IFN sammenlignet med prolifererende motparter. Mens celleoverflatenivåer av MHC-I av både prolifererende og senescerende celler var lave ved baseline og indusert av eksogent IFN, viste senescerende celler en signifikant økning i MHC-I-proteinekspresjon (fig. 5D). Lignende synergier ble observert for celleoverflate-HLA-uttrykk (identisk med MHC-I i mus) i humane kreftceller fra leveren og andre krefttyper utløst til senescens med Butlin, som engasjerer ap53-avhengig senescence-program (56) , eller trametinib/palbociclib, som fortrinnsvis retter seg mot tumorceller med en aktivert MAPK-vei (tilleggsbilde S11A–S11D; ref. 20). Merk at de kombinatoriske effektene av medikamentbehandling og IFN på HLA-ekspresjon krevde senescens-induksjon og forekom ikke i levertumorceller som ikke klarte å senescere på grunn av en spontan eller konstruert p53-mutasjon (uresponsivt til disposisjon) eller en ikke-hyperaktivert MAPK-vei (uresponsiv) til trametinib/palbociclib). Videre, selv om type I og II IFN-responsveier inkluderer overlappende komponenter, kan ikke eksogen IFN-behandling erstatte IFN ved å produsere en robust MHC-I-induksjon i senescerende celler eller en sterk differensiell induksjon mellom prolifererende og senescerende celler i vår p53-restaureringsmodell ( Supplerende Fig. S11E og S11F). Disse dataene antyder at murine og humane celler trigget til å senescere får en økt kapasitet for antigenbehandling og presentasjon i nærvær av begrensede mengder IFN.

Senescent tumorceller hyperaktiverer IFNg-signalveien in vivo

For å bestemme in vivo-konsekvensene av omkoblingen av IFN-signalering identifisert i senescentceller, tilpasset vi deretter et IFN-sensing (IGS) reportersystem for å direkte visualisere intracellulær IFN-signaliseringsaktivering i sanntid (57). Denne reporteren består av en serie konsensus-IFN-aktiverte sekvenser, som har spesifisitet til type II IFN over andre signaler (57), etterfulgt av en cDNA-sekvens som koder for ZsGreen1 fluorescerende protein og er koblet til et konstitutivt uttrykt RFP-transgen for å visualisere transduserte celler ( Fig. 6A). NSP-tumorceller som uttrykker denne konstruksjonen var RFP-positive og viste en doseavhengig økning i ZsGreen1-signal ved behandling med IFN in vitro som økte etter p53-induksjon eller etter behandling med senescens-induserende legemidler (fig. 6B; Supplerende fig. S12A og S12B) .

Vi brukte deretter dette systemet til å overvåke signalaktivitet etter senescence-induksjon i svulster. Reportertransduserte tumorceller (på Dox) som uttrykker konstitutiv RFP ble injisert i leverene til Dox-matede syngene mottakere, og ved tumormanifestasjon ble Dox fjernet for å indusere p53-ekspresjon og utløse senescens som ovenfor (se fig. 1 og 2). Regresserende svulster ble isolert 9 dager etter Dox-uttak for 3D-avbildning av reporteraktivitet og parallell vurdering av IFN-signalering sammenlignet med prolifererende kontroller (fra mus holdt på Dox). Som illustrert i fig. 6C, viste prolifererende tumorceller lite, om noen, reporteruttrykk, mens tumorceller utløst til å senescere in vivo viste et mer fremtredende ZsGreen1-signal (fig. 6C og D; Supplerende video S2). Denne effekten falt sammen med en spesifikk økning i nivåer av IFN-protein (men ikke type I IFN) i tumorvevsekstrakter (Fig. 6E; Supplerende Fig. S12C).

For å teste om den endrede sammensetningen av immunceller i senescerende svulster (fig. 2; Supplerende figurer S5–S6) bidro til det forbedrede signalet til IGS-reporteren, utførte vi in ​​vitro-samkulturanalyser som tillot eksponering av senescent eller prolifererende tumorceller for en like antall aktiverte CD8 T-celler, som vi identifiserte via scRNA-seq-data som den dominerende cellulære kilden til IFN in vivo (fig. 6F–H). Aldrende celler viste fortsatt en betydelig økning av ZsGreen1-signalet sammenlignet med prolifererende kontroller (fig. 6I). I samsvar med en ikke-celle-autonom signalaktivering ble IFN ikke påvist i kondisjonerte medier fra NSP-tumorceller under proliferative eller senescente forhold (Supplerende Fig. S12D), men likevel ble IFN lett oppdaget ved samdyrking med CD8 T-celler, en effekt som var ytterligere forsterket ved tilsetning av makrofager og assosiert med økt MHC klasse I på senescent celler samt økt aktivering av CD8 T-celler (Supplerende Fig. S12E–S12J). Samlet støtter disse dataene en modell der heterotypiske interaksjoner mellom senescent tumorceller og immunceller sensibiliserer svulsten for eksogent IFN, noe som fører til forbedret antigenpresentasjon og effektiv immunovervåking.

Figur 5. Senescence og EC IFN samarbeider for å oppregulere antigenbehandlings- og presentasjonsmaskineri. A og B, mRNA-ekspresjon av gener i prolifererende og senescerende NSP-celler in vitro i nærvær eller fravær av IFN (50 pg/ml) behandling. mRNA-nivået er normalisert til gjennomsnittlig uttrykk for genet i alle prøver. A, DEG-koding SASP-faktorer i modellen vår. B, IFN-responsgener fra Hallmark-signaturdatabasen. C, RT-qPCR av utvalgte antigenpresentasjonsveigener i prolifererende og senescentceller behandlet med lav (50 pg/ml) eller høy (1 ng/ml) konsentrasjon av IFN. Prøver er fra 2 biologiske replikater. D, MHC-I nivå av prolifererende og senescent celler behandlet med IFN i 24 timer målt ved flowcytometri. MFI, median fluorescensintensitet. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM.

Figur 6. Senescens forsterker IFN-mediert heterotypisk signalering fra aktiverte immunceller til tumorceller. En grafisk illustrasjon av IGS-reporteren. (Opprettet med BioRender.com.) B, venstre, representative flowcytometri-plott som måler ZsGreen1-signaler i prolifererende og senescent NSP-celler behandlet med 1 ng/ml IFN. Høyre, kvantifisering av prosentandelen av ZsGreen1-positive celler ved IFN-behandling. MFI, median fluorescensintensitet. C og D, representativ 3D-avbildning av vevsrensede svulster fra den ortotopisk injiserte lever NSP-cellelinjen som uttrykker IGS-reporter (C). Kvantifisering av 3 tilfeldig utvalgte felt fra levertumoren til hver mus (D). n=5 og n=3 for henholdsvis prolifererende og senescent-gruppene (9 dager etter p53-restaurering). Målestokk, 100 μm. E, topp, cytometrisk perlearray-analyse for IFN-nivået fra in vivo tumorvevslysatprøver (7 dager etter p53-restaurering). Nederst, transkripsjoner av indikerte gener fra RNA-seq av in vivo bulkprøver av svulster generert av HTVI (PRO, p53 off; SEN, p53 restaurering i 12 dager). TPM, transkripsjoner per kilobase million. Notert Ifna/b-klynge inneholder 14 Ifna-undertyper og 1 Ifnb-gen. F og G, uttrykk for Ifng i tumorinfiltrerende immunceller profilert av scRNA-seq i den transplanterbare NSP-modellen (som i fig. 2, en prøve samlet på dag 8 etter p53-restaurering). H, Uniform manifold tilnærming og projeksjonsplott av ekspresjonen av Havcr2 (koder for TIM3) og Ifng i CD8 T-celler høstet fra prolifererende (P) og senescent (S) tumorlesjon. Topppanelet er replikert fra fig. 2F (venstre) for å indikere celler som tilsvarer hver tilstand. I, Kvantifisering av ZsGreen1-intensiteten til NSP-tumorceller i OT-I T-cellen og SIINFEKL-uttrykkende tumorcelle-samkultureksperiment (effektor-til-mål-forhold, 5:1) etter 20 timer med samkultur. Signal målt ved flowcytometri. T + P, trametinib pluss palbociclib. Se eksperimentelle detaljer i tilleggsfigur S12E. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. To-tailed Student t-test ble brukt. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

IFNg-signalering i senescent tumorceller er nødvendig for immunovervåking

Resultatene våre antyder at den immunmedierte clearance av senescent NSP-tumorceller involverer de kombinerte effektene av SASP, kjent for å stimulere immuncelle-rekruttering (10, 20, 58), sammen med en tidligere undervurdert kapasitet til senescent celler for forbedret sensing og respons på EC-signaler, som vist her med IFN . For å teste bidraget til det senescensassosierte IFN-sensorprogrammet til immunovervåkingen av senescenstumorceller, undersøkte vi hvordan forstyrrelse av IFNGR i tumorcellene, eller IFN-utarming i verten, påvirker clearance av NSP-tumorceller ved induksjon av senescens. . Faktisk ble tumorregresjon (men ikke senescens per se; Supplerende Fig. S13A–S13D) svekket ved knockout (KO) av IFNGR1 (Fig. 7A og B; Supplerende Fig. S14A–S14C), en effekt som var enda mer uttalt for IFNGR-intakte svulster podet inn i Ifng−/− mus (fig. 7C og D) og assosiert med forventet tap av overflate MHC-I i tumorceller (tilleggsfig. S14D og S14E).

I samsvar med det kjente bidraget fra IFN-signalering og tumorcelle MHC-I til CD8+-engasjement (59), inneholdt svulster som manglet IFNGR1 eller som utviklet seg i Ifng−/−-mottakere færre CD8 T-celler enn deres WT-motparter i begge prolifererende og senescent tilstander (Supplerende Fig. S14F) mens de fortsatt induserer robust immuninfiltrat inkludert rikelig med makrofager (Fig. 7E og F; Supplerende Fig. S14G). Uansett var den svekkede senescensovervåkingsfenotypen ikke bare et resultat av denne reduksjonen i CD8 T-celler. Kokulturanalyser som ga ensartet eksponering av IFNGR1 KO og WT tumorceller til CD8 T-celler og makrofager viste fortsatt IFNGR1-avhengig drap av senescent tumorceller (tilleggsfigur S15A–S15E) - en avhengighet som krevde tilstedeværelsen av både T celler og makrofager og som ikke ble observert i prolifererende tumorceller under de samme forholdene. Samlet indikerer disse dataene at den forbedrede evnen til senescentceller til å sanse mikromiljø-IFN virker sammen med SASP-stimulert immuncelle-rekruttering for å muliggjøre gjensidig forsterkende heterotypiske interaksjoner mellom tumorceller, makrofager og aktiverte T-celler som forbedrer antigenpresentasjon og immunovervåking. , som fører til kraftige tumorregresjoner.

DISKUSJON

Aktivert av en murin svulstmodell der kreftimmununndragelse versus senescensovervåking er under tett genetisk kontroll, avslører vi hvordan senescerende celler dramatisk endrer deres evne til å både sende og motta miljøsignaler (Supplerende Fig. S16). I samsvar med kjente senescensprogrammer førte p53-drevet senescensinduksjon til demping av proliferative gener og induserte SASP. Imidlertid observerte vi også en dyp effekt på genuttrykk for PM-proteiner, inkludert en rekke vekstfaktorreseptorer og cytokinreseptorer som er spådd å drastisk endre hvordan senescentceller reagerer på miljøsignaler. Viktigere, selv om vi brukte en leverkreftmodell som vårt primære eksperimentelle system, ble en lignende omkobling i ekspresjonen av celleoverflatesensorer og genprogrammer som sensibiliserte for miljøsignaler observert i et bredt spekter av murine og humane tumorceller behandlet med senescens-induserende agenter, noe som antyder at det endrede sanseprogrammet er et generelt kjennetegn på den senescent tilstanden.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

En av de fremtredende sanseveiene som er endret i senescentceller involverer type II IFN-signalering. I vår leverkreftmodell og på tvers av alle senescerende tilstander vi undersøkte, er senescens ledsaget av celle-iboende transkripsjonelle endringer og proteinekspresjonsendringer som er spådd å forbedre signalering fra eksogent IFN. Faktisk aktiverte senescentceller mer robust IFN-effektorer som respons på IFN in vitro og in vivo, og både en intakt IFN-effektorvei og IFN i miljøet er nødvendig for effektiv CD8 T-celle-mediert clearance av senescent tumorceller. Selv om baneanalyse av senescerende celletranskriptomer alltid identifiserer type II IFN-signalering som en beriket funksjon, har overlapping mellom type I og II signaleringskomponenter og det faktum at IFN vanligvis ikke oppdages som en SASP-faktor etterlatt mekanistiske spørsmål angående type II IFN-signalering i senescens. stort sett uutforsket. Våre studier viser at slik berikelse i IFN-signalsignaturer til senescentceller reflekterer en forbedret kapasitet for IFN-sensing hvis utgang er mest fremtredende in vivo.

Figur 7. IFN-signalering i senescent tumorceller er nødvendig for immunovervåking. A, Ifngr1 KO av både prolifererende og senescent NSP-celler validert ved flowcytometri. B, Tumorregresjonsfenotype av Ifngr1 KO eller kontroll sgRNA-transfekterte tumorceller ortotopisk injisert i Bl/6N-mus ved p53-restaurering. Et kontroll-sgRNA rettet mot en genørken lokalisert på Chr8 (Ctrl KO) fungerer som en kontroll. C, Tumorregresjonsfenotype av foreldrenes NSP-tumorceller ortotopisk injisert i WT- eller Ifng KO-mus ved p53-restaurering. D, Representative makroskopiske bilder av svulst samlet på dag 21 etter p53-restaurering fra CE, Flowcytometrianalyse av CD45-overflod i svulst fra indikerte grupper. F, Representativ immunfluorescens i p{{10}}undertrykt (prolifererende) og p53-restaurert (senescent, 7 dager etter p53-restaurering) tumor fra den angitte verten. NSP-tumorceller ble transdusert med en GFP-uttrykkende vektor for visualisering. Målestokker, 50 μm. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. To-tailed Student t-test ble brukt. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Den kanskje mest veletablerte produksjonen av type II IFN-signalering involverer dens evne til å indusere antigenpresentasjonsmaskineriet. Faktisk induserte IFN celleoverflateekspresjon av MHC-I (eller HLA i humane celler) i vår modell under både prolifererende og senescensforhold. Imidlertid var IFN-indusert MHC-I-oppregulering mer uttalt i senescerende celler, en effekt som korrelerte med økt ekspresjon av transportøren assosiert med antigenprosessering, andre antigenprosesseringsfaktorer og strukturelle komponenter av MHC-I. En lignende overfølsomhet overfor IFN ved indusering av MHC-I/HLA ble observert i humane lever- og lungekreftcellelinjer som ble utløst til alderdom. Disse resultatene antyder at senescensprogrammet kan forbedre antigenpresentasjonen i ikke-immune celler, og dermed lette tumorimmunovervåking. Resultatene våre støtter en modell der den ultimate virkningen av senescentceller på vevsbiologi er diktert av de kombinerte effektene av hvordan de sender og mottar miljøsignaler. Ikke bare induserer senescentceller SASP, som utløser vevsremodellering og endrer celletilstanden og sammensetningen av immunceller i miljøet, men de endrer også dramatisk overflaten deres, noe som fører til en differensiell evne til å føle miljøfaktorer, her eksemplifisert ved IFN . Viktigere, forstyrrelse av IFN-signalering hadde ingen effekt på senescens-induksjon eller SASP i systemet vårt, men svekket påfølgende tumorregresjoner, noe som indikerer at endret miljøføling virker i samråd med SASP for å bestemme den endelige utgangen av senescensprogrammet - i dette tilfellet, immunovervåking. Disse effektene ser ut til å være en del av et koordinert epigenetisk program, ettersom både SASP- og sensingsprogrammene viser en fremtredende avhengighet av kromatinremodelleringsfaktoren BRD4.

Selv om mekanismen for immunovervåking i modellen vår avhenger av de samarbeidende effektene av CD8 T-celle- og makrofagpopulasjoner som reflekterer en overgang fra en "immun forkjølelse" til et "immun varmt" tumormikromiljø, kan andre medfødte eller adaptive immuncelletyper gjenkjenne og klare senescentceller i forskjellige sammenhenger, eller alternativt kan det hende at immunovervåking ikke forekommer i det hele tatt (18, 19). Utvilsomt reflekterer noen av disse distinksjonene heterogenitet i SASP-faktorsekresjon (13, 14), selv om resultatene våre øker muligheten for at omfanget og arten av endret miljøsansing også kan påvirke hvordan senescerende celler påvirker vevsbiologi. Selv om knockout av IFN-sensing (via Ifngr1 KO) og sletting av MHC-I (B2M KO) i senescerende tumorceller svekket deres immunovervåking in vivo, opphevet det ikke tumorregresjon etter senescensinduksjon, noe som indikerer at IFN-sensing i senescerende celler er ikke den eneste veien som bidrar til tumorregresjon. Uansett, det faktum at senescentceller kan reagere annerledes på miljøsignaler, innebærer at deres endelige molekylære tilstand i vev vil være annerledes enn i cellekultur, noe som understreker behovet for å bedre karakterisere prosessen in vivo.

Resultatene våre kan bidra til å forklare de paradoksale effektene av senescensbiologi i fysiologi og sykdom og ha implikasjoner for effektiv bruk av senescensmodulerende terapi. For eksempel, i vår modell, ble forskjellen mellom celleclearance og persistens av tumor, i det minste delvis, bestemt av tilstedeværelsen av miljømessig IFN og integriteten til type II IFN-signalering i de senescerende cellene. Dette antyder at variasjon i evnen til senescentceller til å rekruttere og sanse IFN-utskillende immunceller eller andre immuncelletyper kan ha en dyp innvirkning på senescent celleclearance, slik at redusert miljømessig IFN eller redusert type II IFN-signalering kan muliggjøre senescent cell persistens i vev. I sammenheng med kreft kan terapier som induserer svulstcellealdring - et cytostatisk program - utløse immunmediert svulstregresjon eller resensibilisere svulster til immunkontrollpunktblokade, men disse er ikke de universelle resultatene. Som sådan kan heterogenitet i SASP (som kan variere mellom tumorcelletyper og senescens-induktorer) eller IFN-sensing og output [kanskje påvirket av sletting eller mutasjon av IFN-vei eller HLA-komponenter (60) eller de reversible transkripsjonsmekanismene som avdekkes her] effektiviteten av slike terapier hos pasienter. I samsvar med denne oppfatningen forutsier terapidrevet induksjon av spesifikke SASP-profiler pasientutfall i en undergruppe av pasienter med eggstokkreft (61). Derimot kan strategier for å forbedre immunovervåkingen av senescentceller ved å øke deres følsomhet overfor IFN (f.eks. med PTPN2-hemmere) bidra til å skjev programmeringsutgang mot tumorcelleavvisning. Vi ser for oss at å undersøke dette og andre vevsremodellerings- og sensingsprogrammer i tumorbiopsier før og etter behandling (f.eks. gjennom transkriptomiske eller proteomiske profiler) kan avsløre nye responsbiomarkører og/eller kombinasjonsstrategier for å forbedre den kliniske behandlingen av kreft.

REFERANSER

1. Di Micco R, Krizhanovsky V, Baker D, d'Adda di Fagagna F. Cellulær senescens i aldring: fra mekanismer til terapeutiske muligheter. Nat Rev Mol Cell Biol 2021;22:75–95.

2. Munoz-Espin D, Serrano M. Cellulær senescens: fra fysiologi til patologi. Nat Rev Mol Cell Biol 2014;15:482–96.

3. Demaria M, Ohtani N, Youssef SA, Rodier F, Toussaint W, Mitchell JR, et al. En essensiell rolle for senescentceller i optimal sårheling gjennom sekresjon av PDGF-AA. Dev Cell 2014;31:722–33.

4. Xu M, Pirtskhalava T, Farr JN, Weigand BM, Palmer AK, Weivoda MM, et al. Senolytika forbedrer fysisk funksjon og øker levetiden i alderdommen. Nat Med 2018;24:1246–56.

5. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. Onkogen Ras provoserer for tidlig cellealderdom assosiert med akkumulering av p53 og p16INK4a. Cell 1997;88:593–602.

6. Ewald JA, Desotelle JA, Wilding G, Jarrard DF. Terapi-indusert senescens ved kreft. J Natl Cancer Inst 2010;102:1536–46.

7. Coppe JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. Den senescensassosierte sekretoriske fenotypen: den mørke siden av tumorundertrykkelse. Annu Rev Pathol 2010;5:99–118.

8. Demaria M, O'Leary MN, Chang J, Shao L, Liu S, Alimirah F, et al. Cellulær senescens fremmer bivirkninger av kjemoterapi og tilbakefall av kreft. Cancer Discover 2017;7:165–76.

9. Coppe JP, Patil CK, Rodier F, Sun Y, Munoz DP, Goldstein J, et al. Senescensassosierte sekretoriske fenotyper avslører celle-ikke-autonome funksjoner av onkogen RAS og p53-tumorundertrykkeren. PLoS Biol 2008;6:2853–68.

10. Tasdemir N, Banito A, Roe JS, Alonso-Curbelo D, Camiolo M, Tschaharganeh DF, et al. BRD4 kobler enhancer-remodellering til senescens-immunovervåking. Cancer Discover 2016;6:612–29.

11. Chien Y, Scuoppo C, Wang X, Fang X, Balgley B, Bolden JE, et al. Kontroll av den senescensassosierte sekretoriske fenotypen av NF-kappaB fremmer senescens og øker kjemosensitivitet. Genes Dev 2011;25:2125–36.

12. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LC, Douma S, van Doorn R, Desmet CJ, et al. Onkogenindusert senescens videreført av et interleukinavhengig inflammatorisk nettverk. Cell 2008;133:1019–31.

13. Basisty N, Kale A, Jeon OH, Kuehnemann C, Payne T, Rao C, et al. Et proteomisk atlas over senescensassosierte sekretomer for utvikling av aldrende biomarkører. PLoS Biol 2020;18:e3000599.

14. Hernandez-Segura A, de Jong TV, Melov S, Guryev V, Campisi J, Demaria M. Demaskering av transkripsjonell heterogenitet i senescent celler. Curr Biol 2017;27:2652–60.

15. Xue W, Zender L, Miething C, Dickins RA, Hernando E, Krizhanovsky V, et al. Senescens og tumorclearance utløses av p53-restaurering i murine leverkarsinomer. Nature 2007;445:656–60.

16. Kang TW, Yevsa T, Woller N, Hoenicke L, Wuestefeld T, Dauch D, et al. Senescensovervåking av pre-maligne hepatocytter begrenser utviklingen av leverkreft. Nature 2011;479:547–51.

17. Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, Vadai E, Gal H, Biran A, et al. Nedsatt immunovervåking akselererer akkumulering av senescent celler og aldring. Nat Commun 2018;9:5435.

18. Lujambio A. Å tømme, eller ikke å rydde (aldrende celler)? Det er spørsmålet. Bioessays 2016;38 Suppl 1:S56–64. 19. Di Mitri D, Toso A, Chen JJ, Sarti M, Pinton S, Jost TR, et al. Tumorinfiltrerende Gr-1+ myeloide celler motvirker senescens ved kreft. Nature 2014;515:134–7.

20. Ruscetti M, Leibold J, Bott MJ, Fennell M, Kulick A, Salgado NR, et al. NK-cellemediert cytotoksisitet bidrar til tumorkontroll ved en cytostatisk medikamentkombinasjon. Science 2018;362:1416–22.

21. Llovet JM, Kelley RK, Villanueva A, Singal AG, Pikarsky E, Roayaie S, et al. Hepatocellulært karsinom. Nat Rev Dis Primers 2021;7:6.

22. Chiang DY, Villanueva A, Hoshida Y, Peix J, Newell P, Minguez B, et al. Fokale gevinster av VEGFA og molekylær klassifisering av hepatocellulært karsinom. Cancer Res 2008;68:6779–88.

23. Llovet JM, Castet F, Heikenwalder M, Maini MK, Mazzaferro V, Pinato DJ, et al. Immunterapier for hepatocellulært karsinom. Nat Rev Clin Oncol 2022;19:151–72.

24. Sangro B, Sarobe P, Hervas-Stubbs S, Melero I. Fremskritt innen immunterapi for hepatocellulært karsinom. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2021;18:525–43.

25. Levine AJ. Målretting av P53-proteinet for kreftbehandlinger: translasjonseffekten av P53-forskning. Cancer Res 2022;82:362–4.

26. Xiao Y, Chen J, Zhou H, Zeng X, Ruan Z, Pu Z, et al. Ved å kombinere p53 mRNA-monoterapi med immunsjekkpunktblokkade omprogrammeres immunmikromiljøet for effektiv kreftbehandling. Nat Commun 2022;13:758.

27. Demir O, Barros EP, Offutt TL, Rosenfeld M, Amaro RE. En integrert visning av p53-dynamikk, funksjon og reaktivering. Curr Opin Struct Biol 2021;67:187–94.

28. Suda T, Liu D. Hydrodynamisk genlevering: dens prinsipper og anvendelser. Mol Ther 2007;15:2063–9.

29. Hoshida Y, Nijman SM, Kobayashi M, Chan JA, Brunet JP, Chiang DY, et al. Integrativ transkriptomanalyse avslører vanlige molekylære underklasser av humant hepatocellulært karsinom. Cancer Res 2009;69:7385–92.

30. Kaech SM, Hemby S, Kersh E, Ahmed R. Molekylær og funksjonell profilering av minne CD8 T-celledifferensiering. Cell 2002;111:837–51.

31. Bruix J, Cheng AL, Meinhardt G, Nakajima K, De Sanctis Y, Llovet J. Prognostiske faktorer og prediktorer for sorafenib fordel hos pasienter med hepatocellulært karsinom: analyse av to fase III-studier. J Hepatol 2017;67:999–1008.

32. Adrover JM, Aroca-Crevillen A, Crainiciuc G, Ostos F, Rojas-Vega Y, Rubio-Ponce A, et al. Programmert "avvæpning" av det nøytrofile proteomet reduserer omfanget av betennelse. Nat Immunol 2020;21: 135–44.

33. Zeisberger SM, Odermatt B, Marty C, Zehnder-Fjallman AH, Ballmer-Hofer K, Schwendener RA. Klodronat-liposom-mediert uttømming av tumorassosierte makrofager: en ny og svært effektiv antiangiogene terapitilnærming. Br J Cancer 2006;95:272–81.

34. De Simone G, Andreata F, Bleriot C, Fumagalli V, Laura C, Garcia-Manteiga JM, et al. Identifikasjon av et Kupffer-celleundersett som er i stand til å reversere T-celledysfunksjonen indusert av hepatocellulær priming. Immunitet 2021;54:2089–100.

35. Dann E, Henderson NC, Teichmann SA, Morgan MD, Marioni JC. Differensiell overflodstesting på enkeltcelledata ved bruk av k-nærmeste nabografer. Nat Biotechnol 2022;40:245–53.

36. Kim HD, Park S, Jeong S, Lee YJ, Lee H, Kim CG, et al. 4–1BB avgrenser distinkt aktiveringsstatus for utmattede tumorinfiltrerende CD8(+) T-celler i hepatocellulært karsinom. Hepatologi 2020;71:955–71.

37. Li Y, Wang Z, Jiang W, Zeng H, Liu Z, Lin Z, et al. Tumorinfiltrerende TNFRSF9(+) CD8(+) T-celler definerer forskjellige undergrupper av klarcellet nyrecellekarsinom med prognose og immunterapeutisk respons. Onkoimmunologi 2020;9:1838141.

38. Bindea G, Mlecnik B, Tosolini M, Kirilovsky A, Waldner M, Obenauf AC, et al. Spatiotemporal dynamikk av intratumorale immunceller avslører immunlandskapet i menneskelig kreft. Immunitet 2013;39:782–95.

39. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C, et al. Aktiverte monocytter i det peritumorale stroma av hepatocellulært karsinom fremmer immunprivilegier og sykdomsprogresjon gjennom PD-L1. J Exp Med 2009;206:1327–37.

40. Lu LG, Zhou ZL, Wang XY, Liu BY, Lu JY, Liu S, et al. PD-L1-blokade frigjør iboende antitumorigene egenskaper til glykolytiske makrofager i hepatocellulært karsinom. Gut 2022;71:2551–60.

41. Milanovic M, Fan DNY, Belenki D, Dabritz JHM, Zhao Z, Yu Y, et al. Senescence-assosiert omprogrammering fremmer kreftstamme. Natur 2018;553:96–100.

42. Yousef H, Czupalla CJ, Lee D, Chen MB, Burke AN, Zera KA, et al. Eldret blod svekker hippocampus nevrale forløperaktivitet og aktiverer mikroglia via hjerneendotelcelle VCAM1. Nat Med 2019;25:988–1000.

43. Rapisarda V, Borghesan M, Miguela V, Encheva V, Snijders AP, Lujambio A, et al. Integrin beta 3 regulerer cellulær senescens ved å aktivere TGF-beta-veien. Cell Rep 2017;18:2480–93.

44. Jochems F, Thijssen B, De Conti G, Jansen R, Pogacar Z, Groot K, et al. Kreften SENESCopedia: en avgrensning av kreftcelle-aldring. Cell Rep 2021;36:109441.

45. Perna F, Berman SH, Soni RK, Mansilla-Soto J, Eyquem J, Hamieh M, et al. Integrering av proteomikk og transkriptomikk for systematisk kombinatorisk kimær antigenreseptorterapi av AML. Kreftcelle 2017;32:506–19.

46. ​​Hoare M, Ito Y, Kang TW, Weekes MP, Matheson NJ, Patten DA, et al. NOTCH1 medierer en veksling mellom to distinkte sekretomer under senescens. Nat Cell Biol 2016;18:979–92.

47. Castro F, Cardoso AP, Goncalves RM, Serre K, Oliveira MJ. Interferon-gamma i krysset mellom tumorimmunovervåking eller unnvikelse. Front Immunol 2018;9:847.

48. Platanias LC. Mekanismer for type-I- og type-II-interferon-mediert signalering. Nat Rev Immunol 2005;5:375–86.

49. Manguso RT, Pope HW, Zimmer MD, Brown FD, Yates KB, Miller BC, et al. In vivo CRISPR-screening identifiserer Ptpn2 som et kreftimmunterapimål. Nature 2017;547:413–8.

50. Song MM, Shuai K. Undertrykkeren av cytokinsignalering (SOCS) 1 og SOCS3, men ikke SOCS2-proteiner, hemmer interferon-mediert antiviral og antiproliferativ aktivitet. J Biol Chem 1998;273:35056-62.

51. Kleppe M, Soulier J, Asnafi V, Mentens N, Hornakova T, Knoops L, et al. PTPN2 regulerer negativt onkogen JAK1 i T-celle akutt lymfatisk leukemi. Blood 2011;117:7090–8.

52. Zhou F. Molekylær mekanismer av IFN-gamma for å oppregulere MHC klasse I antigen prosessering og presentasjon. Int Rev Immunol 2009;28:239–60.

53. McCarthy MK, Weinberg JB. Immunproteasomet og virusinfeksjonen: en kompleks regulator av betennelse. Front Microbiol 2015; 6:21.

54. Yoshihama S, Vijayan S, Sidiq T, Kobayashi KS. NLRC5/CITA: en nøkkelaktør innen kreftimmunovervåking. Trender Kreft 2017;3:28–38.

55. Kalaora S, Lee JS, Barnea E, Levy R, Greenberg P, Alon M, et al. Immunoproteasomuttrykk er assosiert med bedre prognose og respons på sjekkpunktbehandlinger ved melanom. Nat Commun 2020; 11:896.

56. Efeyan A, Ortega-Molina A, Velasco-Miguel S, Herranz D, Vassilev LT, Serrano M. Induksjon av p53-avhengig senescens av MDM2-antagonisten nutlin-3a i museceller av fibroblast opprinnelse. Cancer Res 2007;67:7350–7.

57. Hoekstra ME, Bornes L, Dijkgraaf FE, Philips D, Pardieck IN, Toebes M, et al. Langdistansemodulering av tilstedeværende tumorceller ved CD8(+) T-celleutskilt IFNgamma. Nat Cancer 2020;1:291–301.

58. Ruscetti M, Morris JPt, Mezzadra R, Russell J, Leibold J, Romesser PB, et al. Aldringsindusert vaskulær ombygging skaper terapeutiske sårbarheter ved kreft i bukspyttkjertelen. Cell 2020;181:424–41.

59. Dighe AS, Richards E, Old LJ, Schreiber RD. Forbedret in vivo-vekst og motstand mot avvisning av tumorceller som uttrykker dominerende negative IFN-gamma-reseptorer. Immunity 1994;1:447–56.

60. Gao J, Shi LZ, Zhao H, Chen J, Xiong L, He Q, et al. Tap av IFN-gammaveigener i tumorceller som en mekanisme for resistens mot anti-CTLA-4-terapi. Cell 2016;167:397–404.

61. Paffenholz SV, Salvagno C, Ho YJ, Limjoco M, Baslan T, Tian S, et al. Senescence-induksjon dikterer respons på kjemo- og immunterapi i prekliniske modeller av eggstokkreft. Proc Natl Acad Sci USA 2022;119:e2117754119.

62. Shao DD, Xue W, Krall EB, Bhutkar A, Piccioni F, Wang X, et al. KRAS og YAP1 konvergerer for å regulere EMT og tumoroverlevelse. Cell 2014;158:171–84.

63. Zhu C, Kim K, Wang X, Bartolome A, Salomao M, Dongiovanni P, et al. Hepatocyte Notch-aktivering induserer leverfibrose ved ikke-alkoholisk steatohepatitt. Sci Transl Med 2018;10:eaat0344.

64. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, Yukinaga H, Kuno A, Ueda HR. Avanserte CUBIC-protokoller for fjerning og bildebehandling av hele hjernen og hele kroppen. Nat Protoc 2015;10:1709–27.

65. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: en fleksibel trimmer for Illumina-sekvensdata. Bioinformatikk 2014;30:2114–20. 66. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: ultrarask universal RNA-seq aligner. Bioinformatikk 2013;29:15–21.

67. Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq-a Python-rammeverk for å jobbe med sekvenseringsdata med høy gjennomstrømning. Bioinformatikk 2015;31:166–9.

68. Love MI, Huber W, Anders S. Moderert estimering av fold endring og dispersjon for RNA-seq data med DESeq2. Genom Biol 2014;15:550.

69. Chen EY, Tan CM, Kou Y, Duan Q, Wang Z, Meirelles GV, et al. Enrichr: interaktivt og samarbeidende HTML5-genlisteberikelsesverktøy. BMC Bioinf 2013;14:128.

70. Foroutan M, Bhuva DD, Lyu R, Horan K, Cursons J, Davis MJ. Enkeltprøveskåring av molekylære fenotyper. BMC Bioinf 2018;19:404.

71. Binder JX, Pletscher-Frankild S, Tsafou K, Stolte C, O'Donoghue SI, Schneider R, et al. KOMPARTEMENTER: forening og visualisering av protein subcellulær lokalisering bevis. Database (Oxford) 2014;2014:bau012.

72. Cancer Genome Atlas Research Network. Omfattende og integrerende genomisk karakterisering av hepatocellulært karsinom. Cell 2017; 169:1327–41.

73. Colaprico A, Silva TC, Olsen C, Garofano L, Cava C, Garolini D, et al. TCGAbiolinks: en R/Bioconductor-pakke for integrativ analyse av TCGA-data. Nucleic Acids Res 2016;44:e71.

74. Hanzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gensettvariasjonsanalyse for mikroarray og RNA-seq data. BMC Bioinf 2013;14:7.

75. Bankhead P, Loughrey MB, Fernandez JA, Dombrowski Y, McArt DG, Dunne PD, et al. QuPath: åpen kildekode programvare for digital patologi bildeanalyse. Sci Rep 2017;7:16878.

76. Bernstein NJ, Fong NL, Lam I, Roy MA, Hendrickson DG, Kelley DR. Solo: dublettidentifikasjon i encellet RNA-Seq via semi-overvåket dyp læring. Cell Syst 2020;11:95–101.

77. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Romlig rekonstruksjon av enkeltcelle-genekspresjonsdata. Nat Biotechnol 2015;33:495–502.

78. McInnes L, Healy J, Melville J. UMAP: uniform manifold tilnærming og projeksjon for dimensjonsreduksjon. arXiv: 1802.03426 [Fortrykk]. 2018. Tilgjengelig fra: https://doi.org/10.48550/arXiv.1802.03426.

79. Traag VA, Waltman L, van Eck NJ. Fra Louvain til Leiden: garanterer lokalsamfunn med god tilknytning. Sci Rep 2019;9:5233.

80. Korsunsky I, Millard N, Fan J, Slowikowski K, Zhang F, Wei K, et al. Rask, sensitiv og nøyaktig integrering av enkeltcelledata med Harmony. Nat Methods 2019;16:1289–96.