Antialdringseffekter av Piper Cambodianum Cistanche-ekstrakt på normale menneskelige dermale fibroblastceller og en sårhelende modell i mus Ⅱ

Cistancheekstrahere beskyttede NHDF-celler fra effekten av UV-bestråling

Hudceller reagerer raskt når de utsettes for UV eller cytokiner som interleukin (IL)-4 og IL-13.19Ved UV-eksponering stimuleres ulike faktorer, inkludert EGFR,20,21 TNFR,22mitogenaktivert protein (MAP) kinaser, ERK og c-Jun aminoterminal kinase (JNK).23Både JNK og p38 fosforylerer og aktiverer transkripsjonsfaktoren c-Jun, som igjen øker c-Fos og øker nivåene av transkripsjonsfaktoraktivatorprotein-1,24som er nødvendig for transkripsjon av MMP-er. Disse reseptorene aktiveres ved fosforylering av MAP-kinase og andre nedstrømsproteiner.25MAP-kinaser aktiveres ved fosforylering av spesifikke treonin- og tyrosinrester.24,26UV-eksponering fører til høy ekspresjon av c-Jun- og c-Fos-heterodimerer, mange cytokiner og vekstfaktorer, som fosforyleres av JNK og p38.27,28På samme måte ble p53-proteinnivåene forhøyet, fra 2,5 timer til 24 timer etter UV-eksponering.29Vi demonstrerte at celler utsatt for UV-bestråling i 24 timer uttrykte TNFR1- og EGFR-proteinnivåer, som sank på en doseavhengig måte når cellene ble behandlet medCistanche. Vi undersøkte effekten av UV-stråling på både fosforyleringen og aktiviteten til p38 (Thr180/Tyr182). Proteinnivåer av c-Jun og p53 ble nedregulert dramatisk iCistanche-behandlede celler (figur 4A og B).

Klikk her for å få mer informasjon om Cistanche for antialdringsbehandling

Cistanche-ekstrakt beskyttet UV-bestrålte NHDF-celler fra ROS

UVB-lys stimulerer produksjonen av ROS,30,31og UV-eksponering på huden produserer ROS som O2 ⋅−, H2 O2, og1 O2. 32Ubehandlet ogCistanche-behandlede celler ble utsatt for UV-bestråling i 24 timer, og genereringen av ROS ble målt ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS).

Figur 3Regulering av ECM-proteiner iCistanche-behandlede celler.Merknader: (A) NHDF-celler ble behandlet medCistanchei 24 timer. Cellelysater ble analysert ved immunblotting ved bruk av anti-kollagen, anti-elastin, anti-MMP-3 og anti-ERK-2 antistoffer. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Aktin, kollagen, elastin, MMP-3 og ERK-2 i immunutfellingene ble kvantifisert ved Western blotting. Søylehøyder er det respektive gjennomsnittet± SD-er av tre uavhengige eksperimenter. *P,0.05; **P,0.01. Forkortelser:Konsern, konsentrasjon; ECM, ekstracellulær matrise; ERK, ekstracellulær signalregulert kinase; MMP, matrise metalloproteinase; NHDF, normal human dermal fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; SD-er, standardavvik.

Figur 4Cistanche ekstrakthemming av ROS-produksjon i UV-bestrålte celler.Merknader: (A) NHDF-celler ble utsatt for UV-bestråling ved 40 J i 180 sekunder og behandlet medCistanchei 24 timer. Cellelysater ble analysert ved immunoblotting ved bruk av anti-TNFR6, anti-c-Jun, anti-c-Fos, anti-pp38 eller anti-p-JNK antistoffer. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Totalt og tyrosinfosforylert p38, JUK, aktin og TNFR6 i immunutfellingene ble kvantifisert ved Western-analyser. Barhøyder er gjennomsnittet± SD av tre uavhengige eksperimenter. *P,0.05; **P,0.01. Forkortelser:Konsern, konsentrasjon; EGFR, epidermal vekstfaktorreseptor; JNK, c-Jun aminoterminal kinase; JNK, c-Jun N-terminal kinase; NHDF, normal human dermal fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, reaktive oksygenarter; SD, standardavvik; TNFR, tumor nekrose faktor reseptor; UV, ultrafiolett.

UV-bestråling økte ROS-produksjonen, mensCistanche ekstrakt redusert ROS-produksjon i NHDF-celler. ROS-nivåene til H2 O2 ble målt ved bruk av cellepermeantene 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat (CM-H2 DCFDA) (Figur 5A). UV-bestråling økte ROS-nivåene av H2 O2 , mens ROS-nivåene ble redusert medCistanche ekstrakt på en doseavhengig måte (figur 5B). Disse resultatene indikerte detCistancheekstrakt beskytter dermale fibroblaster mot UV-bestråling ved å redusere ROS-generering.

Makroskopisk observasjon av sårtilheling hos mus

Sår ble laget på ryggen til mus og deretter behandlet medCistancheuttrekk (0, 1, 10 og 50µg/ml); sårområdene ble målt hver dag i 4 dager. På dag 4 ble områdene rundt sårene innCistanche-behandlede mus viste redusert rødhet på en doseavhengig måte sammenlignet med ubehandlede sårområder (Figur 5). De ekstraktbehandlede sårområdene var mindre enn det ubehandlede sårområdet, og viste et doseavhengig mønster. På dag 4 ble sårområdene behandlet med 50µg/mlCistancheble fullstendig dekket av nytt epitel. Ingen sårområder ble infisert (figur 6A og B). Forholdet mellom sårområder på dagene 0 og 4 ble beregnet (figur 6C).

Diskusjon

Bruken av urtematerialer og forskjellige plantedeler har økt med samtidige fremskritt innen fytoterapi. Urtematerialer har blitt brukt i ulike former som mono- eller polyurtemedisiner, kosttilskudd og kostholdsingredienser, og mange har blitt kjente og trygge kommersielle varer.33Ulike planter, bl.aCistanche, har blitt undersøkt for deres potensielle farmakologiske egenskaper, men ingen sammenlignende studie ble tidligere utført medCistanche ekstrakt. Denne studien ble utført for å bestemmeeffektene avCistanche ekstrakt på sårhelingsaktiviteter ved bruk av snittsårmodeller hos mus. Sårheling innebærer reetablering av vevsintegritet gjennom prosesser assosiert med betennelses-, sprednings- og remodelleringsstadier.34 Hudremodelleringsstadiet er preget av reformulering og reformering av kollagenfiberkomponenter som forbedrer strekkstyrken.35Helingsprosessen reguleres hovedsakelig av biosyntese og avsetning av nytt kollagen og påfølgende modning.36I vår sårstudie,Cistanche ekstrakt viste økte sårhelende effekter sammenlignet med kontrollen (figur 1C og 6). Slik helbredelse kan skyldes økt kollagenkonsentrasjon og stabilisering av fibrene. I vevsreparasjonsprosessen øker inflammatoriske celler migrasjonen og proliferasjonen av endotelceller, noe som fører til neovaskularisering av bindevevsceller som syntetiserer ekstracellulære matriser, inkludert kollagen og keratinocytter, noe som resulterer i reepitelialisering av såret vev.37Den raskere sårkontraksjonshastigheten kan øke gapet junctional intracellulær kommunikasjon i fibroblaster og øke den raskere modningen av granulasjonsvev.38I snittsårmodellen ble mus behandlet medCistancheekstrakt viste raskere sårheling sammenlignet med kontrollene (figur 6). Tallrike studier har avslørt at nedregulering av p38-kinase-veien beskytter ulike villtype-p53--uttrykkende cellelinjer fra genotoksisk stress.39,40Dataene våre viste at p38-ekspresjon i UV-bestrålte celler ble nedregulert avCistanche behandling. Derfor,Cistanche ekstrakt hentet fra blader og stilker viste effektiv behandling i sårheling.Cistancheekstraher redusert ROS-produksjon fra UV-bestråling ved å rense ROS i NHDF-celler (figur 5A og B). Dessuten,Cistancheekstraher akselerert sårheling etter hudbestråling ((Figur 6A–C). Disse resultatene antydet atCistanche ekstrakt beskytter huden mot UV-bestråling, og kan være nyttig som et nytt råmateriale i kosmetiske bruksområder.

Figur 5Cistanche-mediert hemming av ROS-produksjon i UV-bestrålte celler.Merknader: (A) Celler ble behandlet med UVB-bestråling (40 J) i den angitte tiden og deretter inkubert med 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat i 30 minutter. Genereringen av ROS ble målt ved FACS. (B) Celler ble eksponert for UVB (40 J) i 180 sekunder og behandlet med den angitte konsentrasjonen avCistanchei 24 timer. ROS-produksjonen ble estimert med farging av 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat og analysert ved FACS.Forkortelser:FACS, fluorescensaktivert cellesortering; FITC, fluorescein-isotiocyanat; NHDF, normal human dermal fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, reaktive oksygenarter; UV, ultrafiolett; UVB, ultrafiolett B.

Figur 6Sårhelende effekter på svekket musehud.Merknader: (A) Sår med 5- mm diameter ble skapt på rygghuden til 7-uke gamle hannmus C57Bl/6 (n)=3). Utvinningen av sår ble evaluert medCistanchebehandling i de ulike konsentrasjonene (negativ kontroll og ettersårbehandling medCistanchepå 1, 10 og 50µg/ml). (B) Sårarealet ble bestemt ved å måle diameteren på de åpne sårene. (C) Sårarealet ble beregnet ved å bruke dimensjonen til de åpne sårene; *P,0.05; **P,0.01. Forkortelser:Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn; Konsentrasjon, konsentrasjon.

Konklusjon

Denne studien undersøktepotensielle antialdrings- og sårhelende effekter av Cistanche-stamme- og bladekstrakti NHDF-cellerog en musemodell for sårheling. Debehandling av NHDF-celler med Cistanche ekstrakterfremmer gjenoppretting av det ripede områdetpå en doseavhengig måte så vel som forbedring av ECM-genekspresjon. I tillegg Cistancheekstraktervar i stand tilbeskytte cellen mot UV-eksponering ved å redusere ROS-produksjonen. Til slutt blir disse observasjonene ytterligere evaluert og bekreftet i modellmusene for in vivo sårheling. Derfor,Cistanche-ekstrakt representerer et lovende nytt terapeutisk middel for anti-aldring og sårhelende behandling.

Anerkjennelser:Denne studien ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av Ministry of Education (NRF-2014R1A1A3050752). Forfatterne vil gjerne takke Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB) for å gi tilCistancheekstrakter.

Formidling Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter i dette arbeidet.

Referanser

1. Slominski AT, Zmijewski MA, Semak I, et al. Cytokromer p450 og hudkreft: rollen til lokale endokrine veier.Anticancer Agents Med Chem. 2014;14(1):77–96. 

2. Gilchrest BA. Hudaldring og fotoaldring.Dermatol Nurs. 1990; 2(2):79–82. 

3. Ha TY. Utvikling av funksjonelle matvarer for et sunt liv.Koreansk J Crop Sci. 2006;51:26–39.

4. Makrantonaki E, Zouboulis CC. Molekylære mekanismer for aldring av huden: toppmoderne.Ann NY Acad Sci. 2007;1119:40–50. 

5. Seo MY, Chung SY, Choi WK, et al. Antialdringseffekt av risvin i dyrkede humane fibroblaster og keratinocytter.J Biosci Bioeng. 2009; 107(3):266–271. 

6. Kligman AM. Tidlig destruktiv effekt av sollys på menneskelig hud.JAMA. 1969;210(13):2377–2380. 

7. Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M. Bindevevsendringer i hud utsatt for naturlig og terapeutisk UV-stråling.Fotodermatol. 1985;2(1):15–26. 

8. Bech-Thomsen N, Wulf HC. Kreftfremkallende og melanogene effekter av en filtrert metallhalogen UVA-kilde og en rørformet fluorescerende UVA-bruningskilde med eller uten ekstra solsimulert UV-stråling i hårløse mus.Photochem Photobiol. 1995;62(4):773–779.

9. De MS, Lahiri SC. Studier av blader av Piper betle.Bull Calcutta Sch Trop Med. 1971;19(3):69–72.

10. Ferreres F, Oliveira AP, Gil-Izquierdo A, Valentão P, Andrade PB. Piper betleblader: profilering av fenoliske forbindelser ved HPLC/DAD-ESI/MS(n) og anti-kolinesteraseaktivitet.Phytochem Anal. 2014;25(5): 453–460.