noSpråk
Hjem / Kunnskap / Innhold

Kunnskap

Autofluorescens som en ikke-invasiv biomarkør for alderdom og avanserte glykeringssluttprodukter i Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

DISKUSJON

Tidligere har autofluorescens blitt brukt til å overvåke lipofuscin, alderspigmentet, som en biomarkør for senescens4,13. Selv om vi observerte rødtfluorescens som indikerer lipofuscin som sett i tidligere studier9, blåttfluorescens ble oppdaget på et tidligere stadium av livet da ormer ble undersøkt med en M165 FCfluorescens stereomikroskop (Leica Microsystems, Tokyo, Japan) (data ikke vist). Formålet med denne studien var å undersøke om den blå autofluorescensen kunne tjene som en mer sensitiv markør for å spore alderdommen til individuelle ormer.

anti- senescence cistanche function

Cistanche ForAnti-senescens

Buy Cistanche

Anti-aging Cistanche-produkt klar til å sendes


Defluorescens målt i individuelle ormer økte med alderen; jo færre ormerfluoresced, jo lengre forventet levealder. Altså blåfluorescens kan gi en alternativ biomarkør for å spore senescens. Imidlertid, Pincus et al. rapporterte at ormer som senere døde (innen 24 timer)fluoresced på grunn av biosyntesen av kynurenin; disse forskerne kalte dette blå lyset"dødfluorescens". Etter sigende dødfluorescens vedrflects emisjon av en glykosylert form av antranilsyre produsert av kynurenin-banen; bilenfluorescerende materiale påvises i lysosomlignende tarmgranulat31. Dette blå lyset kan være den samme dødsmarkøren som Coburn et al. observert iC. elegansi flere timer før og etter døden, og det ble angivelig sett hos både unge ormer utsatt for dødelig skade og ormer som døde naturlig av alderdom. Faktisk observerte vi atsnill-1mutant, som mangler kynureninase-aktivitet, var autofluorescerende mindre enn villtypen. Imidlertid indikerte resultatene våre at en del av det blåfluorescens er assosiert med aldring snarere enn med død. Spesielt, som vist i fig.3b, aldrende ormer viste økt blåttfluorescens selv når man ekskluderer data innhentet innen 2 dager før dødsfallet. Videre ormer fortsattfluoresced mer med aldring, uavhengig av tilstanden tilkynu-1genet. Redusertfluorescens ikynu-1mutant skal altså skyldes tapetav akselerasjon av AGE-syntese av kynureniner i stedet for mangel på dødfluorescens32.


Visse AGE-forbindelser erfluorescerende27. Vi konkluderte med at den blåfluorescens kan inkludere utslipp fra disse AGE-ene, atskilt fra det som kan tilskrives dødenfluorescens. Når ekstraherte ormeproteiner ble inkubert med sukker in vitro, blefluorescensintensitet og nivåene av AGE økte over tid. Ormer dyrket på et medium som inneholder ribosefluoresced mer enn kontroll dyr dyrkes i fravær av supplerende ribose, selv nårkynu-1ble mutert. Derimot viste ormer dyrket i nærvær av rifampicin, en kjent hemmer av AGEs produksjon, reduserte nivåer av blåttfluorescens. Faktisk indikerte fluorescensmikroskopi at 13-daggamle ormer sendte ut mer blått lys enn 3-daggamle unge voksne. Immunfarging med anti-CML- eller anti-pentosidin-antistoffer klarte ikke å vise tilstedeværelsen av diffust spredte AGE-er i et distribusjonsmønster som ligner det for blåttfluorescens. Defluorescens kan stamme fra andre rikeligfluorescerende AGE-er som vespertin A, LM-1 og argpyrimidin33,34.


For å gi eggeplommen for oocyster,C. eleganshermafroditter konsumerer sin egen intestinale biomasse, noe som resulterer i tarmatrofi og ektopisk eggeplommeavsetning senere i livet. Vitellogeniner (plommeproteiner) var til stede i to ganger høyere nivåer i gamle ormer (sammenlignet med yngre dyr), som rapportert tidligere35, og utstilt seks ganger størrefluorescens etter glykering in vitro. Disse dataene antydet at vitellogeniner i seg selv ville generere 12-doblingfluorescens hos eldre ormer sammenlignet med unge voksne teoretisk. Western blotting viste at hovedbåndene som reagerte med anti-CML-antistoffet var eggeplommeproteinene. Dette funnet samsvarer med de tidligere rapportene fra Nakamura et al., som oppdaget kraftig glykering av vitellogenin36, og Golegaonkar et al., som oppdaget redusert glykasjon i vitellogenin-2, vitellogenin-6 og forlengelsesfaktor 1 alfa i rifampicinbehandlede nematoder30. Etter sigende fungerer vitellogeniner som antioksidanter og bidrar til levetiden til honningbidronninger37. IC. elegans, spiller vitellogeniner en avgjørende rolle i stressresistens 38. Siden antioksidanter lett kan oksideres selv, kan akkumulering av glykert vitellogenin svekke beskyttelsen mot oksidativ skade, noe som resulterer i det omvendte forholdet mellom forventet levealder og intensiteten av blåttfluorescens observert i denne studien. Imidlertid har Sornda et al. nylig rapportert at levetid ikke er relatert til motstand mot oksidativt stress mediert av YP115/YP88 (vitellogenin-6)39. Disse forskerne foreslo at akkumulering av vitellogenin YP170, avledet fra vitellogeniner 1–5, forårsaker intestinal atrofi og redusert levetid, mens akkumulering av YP115/YP88 kan forsinke intestinal atrofi og forlenge levetiden. Glykering av vitellogenin-6 og den resulterende dysfunksjonen kan derfor bidra til alderdom. Selv om forlengelsesfaktorerflUoresced tre ganger mer intens etter in vitro glykering, var mengdene av disse proteinene like mellom unge og gamle ormer. Derfor kan bidraget fra denne faktoren til forbedret autofluorescens være mindre enn det som kan tilskrives vitellogeniner.

anti- senescence cistanche function


Cistanchehar blitt brukt generelt som modell forstuderesenescens og anti-senescens intervensjoner. Vi foreslo bruk av ormen som en modell for å undersøke effektene av lang levetidav melkesyrebakterier8. Gitt demonstrasjonen (i denne studien) at blåfluorescens i nematoder er en mulig indikator på AGE-akkumulering, det foreslår viCistanche hermafroditter kan tjene som en modell for å undersøke nytten av anti-senescens-intervensjoner som virker via undertrykkelse av AGE-produksjon. I kontrast er det usannsynlig at autofluorescens vil være en biomarkør for alderdom for mannlige ormer fordi vitellogeniner må være knappe.

anti- senescence cistanche function

Fig. 5 Blå fluorescens fra kynu-1 mutanter, som ikke skal avgi dødsfluorescens. enFluorescensintensitet (ex 340/em 430) for 7-daggamle og 13-daggamlekynu-1mutanter (n = 37 hver); eldre ormer slapp fortsatt ut merfluorescens enn yngre ormer, til tross forkynu-1mutasjon. Imidlertid ingen signifificant-forskjell ble påvist i autofluorescensverdiene av Mann–WhitneyU test.b En 7-daggammel orm vedlikeholdt med ribose avga mer blåttfluorescens til tross forsnill-1mutasjon. Blåfluorescens avC. elegansdyrket med ribose (n = 24) eller sorbitol (n = 18) ble sammenlignet med kontrollormer uten sukker (n = 20). Autofluorescensverdiene ble sammenlignet med det ikke-parametriske stålet–Dwass-metoden (**p < 0.01). c Overlevelseskurver avC. elegansdyrket med ribose (n = 62) eller sorbitol (n = 84) ble sammenlignet med kontrollormer uten sukker (n = 64). Ormene var 3 dager gamle på dag 0. Nematodeoverlevelse ble beregnet av Kaplan–Meier-metoden, og overlevelsesforskjeller ble testet for signifikans ved bruk av log-rank test (**p < 0.01).


METODER

NematoderCistanche Bristol-stamme N2 og dens derivate mutantstammer ble vennlig levert av Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota. Mutasjonene som ble brukt i denne studien var CB1370daf-2 (e1370)og CB1003kynu-1 (e1003). Nematoder ble opprettholdt og forplantet på NGM i henhold til standard teknikk 40. Ormegg ble gjenvunnet fra voksne ormer etter eksponering for en natriumhypokloritt/natriumhydroksidløsning som tidligere beskrevet 41. Eggsuspensjoner ble inkubert over natten ved 25 grader for å tillate klekking, og suspensjonen av ormer i L1-stadium ble sentrifugert ved 156 ×g i 1 min. Supernatanten ble fjernet, og de gjenværende larvene ble overført til ferske peptonfrie modifiserte NGM (mNGM) plater dekket medE colistamme OP50 (OP50). Stammer ble dyrket på mNGM-agarplater ved 25 grader bortsett fradaf-2stamme, som ble dyrket ved 20 grader til L4-stadiet. Alle analyser ble startet med unge voksne ormer som begynte å legge egg ved 25 grader. Det var ikke nødvendig med etisk godkjenning for nematodene.BakteriestammerOP50 ble brukt som den internasjonalt etablerte maten til nematoder. Trypton soyaagar (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan) ble brukt til å dyrke OP50. Bakterier (100 mg våtvekt) ble suspendert i 0,5 ml M9-buffer; en 50-µL alikvot av bakteriesuspensjonen ble deretter spredt på mNGM i 5.5-cm-diameter plater med mindre annet er angitt.


anti- senescence cistanche function

Multivariat analyse av autofluorescens

Populasjoner på 100 voksne hver ble gjenfunnet ved 3 og 17 dagers alder,vasket tre ganger, konsentrert i 3 µL M9-buffer og lagret frossetpå–80 grader frem til bruk. Før ekstraksjon, 3 µL lyseringsbuffer (bestående av50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 prosent natriumdodecylsulfat(SDS), 1 prosent Triton X-100, 1 mM fenylmetylsulfonylfluoride (PMSF), og
2 prosent 2-merkaptoetanol) og 4 µL 15 prosent SDS ble fordelt til hvert rør. Prøver ble deretter utsatt forfihar fryse-tine-sykluser for å frigjøre protein. Fotoluminescerende spektre ble samlet med enfluorescensspektrofotometer (Hitachi FL{{0}}) med datatolkingsprogramvare (FL Solutions ver. 2.0). Fluorescensegenskaper til nematodesuspensjoner var

analysert ved hjelp av en eksitasjonsemisjonsmatrise (EEM)fluorescensspektroskopi. Multivariat analyse (eksitasjon med én bølgelengde med flerebølgelengdeutslipp og synkron skanningfluorometri) ga EEM-plott bestående av enkeltskanningseksitasjon, og den synkronefluorescensspektra for hver serie ble tegnet.



Fluorescensspektra av aldrende ormer

Ormer (3–13 dager gamle) ble gjenvunnet fra et vekstmedium inneholdende 2'-deoxy-5-fluorouridin (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan). Detteforbindelse blokkerer den embryonale utviklingen av avkom, og utelukker dermed kontaminering av avkom. Individuelle aldrende ormer ble samlet innrør, vasketfemganger, konsentrert i 3 µL M9-buffer og lagret frosset kl–80 grader frem til bruk. Før ekstraksjon, 100 µL lyseringsbuffer(bestående av 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM PMSF og 1 µL proteaseinhibitorcocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA)) ble tilsatt til hvert rør. Prøvene ble deretter malt ved hjelp av en Mini Cordless Grinder (Funakoshi, Tokyo, Japan) for å frigjøre dem
protein. Proteininnhold ble kvantitativt målt ved bruk av Pierce™ 660 nm proteinanalysereagens (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, USA) og et NanoDrop OneC-instrument (Thermo Fisher Scientific). Defluorescensspekteret ble bestemt for hver 30-µL prøve (inneholdt 1,5μg av totalt protein) ved bruk av en multimodus-rist

mikroplateleser modell SH-9000Lab med SF6 Data Treatment Software(Corona Electric, Ibaraki, Japan). Hver måling ble utført tre ganger.


image

Måling av autofluorescens av individuelle levende ormer (wrap-drop-metoden)

Tilfeldig utvalgte ormer ble vasket med M9 buffer, og deretterindividuelle ormer ble plassert i 1.0 µL M9 buffer på Saran Wrap clingfilm (Asahi Kasei, Tokyo, Japan) strakte seg over en 384-brønnsvart plate(STEM, Tokyo, Japan). Små fordypninger ble dannet på hver brønn ved å bruke enreplikator (Watson, Kobe, Japan). Denne modifikasjonen var å gjenopprette ormer trygt etter målingen, slik at den aldersavhengige endringen av autofluorescens for hver orm kunne spores. Klengenfilm ble valgt fordi den autofluoreserte mindre enn andre kommersielt tilgjengeligefilms.

Imidlertid ble de tomme dataene (kun M9-buffer) sjekket tre ganger forhver brønn, med tanke påsvingningfra godt til godt. Minimale deteksjonsgrenser og kvantifiserbare grenser ble bestemt på grunnlag av blanke data for hver dag somμ (gjennomsnittet av det tomme)Plus3.29σ (standardavvik) ogμPlus√2 × 10σ, henholdsvis. Autofluorescensen i kroppen til hver orm

ble fanget med en multimodus-gittermikroplateleser. Ettermåling ble hver orm individuelt opprettholdt på en 4.0-cmdiameter plate dekket med OP50 (2 mg/10μL M9 buffer) ved 25 grader . HverAnalysen ble utført på minimum 20 ormer og gjentatt to ganger.


Levealdersmåling

Ormer ble holdt på mNGM-plater dekket med OP50 ved 25 grader inntil 13 dager gamle. Etter vurdering avfluorescensanalyse, 30 ormer hver varflyttet til separate nye mNGM-plater dekket med OP50. Platene ble inkubert ved 25 grader, og levende og døde ormer ble skåret hver 24. time. En orm ble ansett som død når den ikke klarte å reagere på en forsiktig berøring med en ormeplukker.

anti- senescence cistanche function


AGE etter in vitro glykering

Proteinekstraksjon ble utført som tidligere beskrevet. Tre dager gamle ormer ble brukt til kunstig glykering. Proteinprøvene (2 mg/ml)ble inkubert med 500 mM glukose, 100 mM ribose eller 500 mM fruktose(finalkonsentrasjon). Alle prøvene ble inkubert ved 37 grader i 0–4 uker. Alikvoter (50μL) ble dispensert til brønnene på en polystyrenplate
(Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan) og inkubert i 2 timer ved 37 grader. Etterfjerning av prøveløsningen, ble platen vasket med PBS-T(fosfatbufret saltvann (PBS), 0,05 prosent Tween 20); 250μL av 3 prosent skummet melkble tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert i 2 timer ved 37 grader. Hvervel så ble vasket med PBS-T, og 100μL av en anti-AGE (anti-CML)
monoklonalt antistoff (klon nr. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japan; 75 ng/ml) ble dispensert til hver brønn; platen ble deretter inkubert i rommettemperatur i 1 time. Etter vask med PBS-T, 100μL av en peroksidase-konjugertgeit-anti-mus IgG-antistoff (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, USA; 1:150,000) ble dispensert til hver brønn, og
platen ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter vask med PBS-T, 100μL av en arbeidsløsning (tetrametylbenzidin (TMB) fargeløsning: peroksidløsning= 1:1; ELISA POD substrat TMB-sett, populær,Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) ble dispensert til hver brønn, og platen ble holdt ved romtemperatur i mørket til den ble bråkjølt av

tillegg på 100μL av 1 mol/L svovelsyre per brønn. Absorbansen til hverbrønn ved 450 nm (sub: 650 nm) ble deretter målt umiddelbart med en mikroplateleser. ELISA ble utført tre ganger for hver av testbetingelsene.


Western blotting for aldrende ormer

Prøver ble behandlet med 4× Bolt™ LDS prøvebuffer (Thermo Fisher Scientifific) og 10× Bolt™ Prøvereduksjonsmiddel (Thermo Fisher Scientifific), og hver prøve inneholder 1,5μg av totalt protein ble kjørt på en Bolt™ 4–12 prosent Bis-Tris Plus Gel (Thermo Fisher Scientifific). Deretter ble proteinene overført fra gelen til en polyvinylidenfluoridmembran (ATTO, Tokyo, Japan) og blokkert med 5 prosent skummet melk i PBS- 0.1 prosent Tween 20 i 1 time. Membranen ble inkubert over natten ved 4 grader med et anti-AGE (anti-CML) monoklonalt antistoff (klon nr. 6D12 ved 1:1000), vasket med PBS-T og deretter inkubert ved romtemperatur i 1 h med et peroksidase-konjugert geit-anti-muse-IgG-antistoff (1:25,000). Etter vask med PBS-T, ble membranen inkubert med ECL prime western blotting-deteksjonsreagens (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) og skannet ved hjelp av et ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) eller ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare UK). Membraner ble deretter vasket med PBS-T, inkubert med Western BLoT-strippingbuffer (Takara, Shiga, Japan) i 30 minutter ved romtemperatur og vasket igjen med PBS-T. Membranen ble re-probed av anti-vitellogenin antistoffer YP115 og YP170 (hver 1:10 000) ved 4 grader over natten42, vasket med PBS-T og inkubert med geit-anti-rotte-IgG-antistoff konjugert med peroksidase (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, USA) ved romtemperatur i 2 timer. For lasting av kontroller ble membranene re-probed ved bruk av et anti-aktin-antistoff (klon nr. C4; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) og peroksidase-konjugert anti-mus-antistoff (GE Healthcare UK). Tetthetene til vitellogenin (YP170 og YP115) og CML-bånd i hver bane ble normalisert mot aktinbåndene i den respektive bane. Båndtettheter ble analysert ved bruk av ImageQuant TL-programvare (GE Healthcare). Hver analyse ble utført to ganger.


Effekter av ribose og rifampicin på AGEs in vivo

Tre dager gamle ormer ble dyrket på mNGM inneholdende 400 mM riboseeller 400 mM sorbitol for å matche osmolariteten til høy ribose; ormemat ble gitt som varme (100 grader, 10 min)-drept OP50 for å hindre bakteriene i å fermentere sukkeret. For å forhindre kontaminering av avkom, ble ormer overført til ferske tallerkener daglig i 4 dager til de var fullstendig

ferdigegglegging (7 dager gammel). For å vurdere påvirkningen av ribose, utførte vi overlevelsesanalyser og målte autofluorescens. En orm varansett som død da den ikke klarte å reagere på en mild berøring med en ormeplukker. Ormer som døde som følge av å feste seg til platens vegg ble ikke inkludert i analysen og ble sensurert. I et eget eksperiment,MGM som inneholder 50 µM (endeligkonsentrasjon) rifampicin (oppløst iDMSO) ble brukt. Hver analyse ble gjentatt to ganger.


anti- senescence cistanche function

Fig. 6 Autofluorescens av vitellogenin (Vit) og forlengelsesfaktor (EF). enSpektrofotometri (eks 325/em 350–600) av vitellogenin ogforlengelsesfaktor før og etter glykering in vitro med ribose i 14 dager: gly-Vit og gly-EF er glykert vitellogenin og glykatforlengelsefaktor, henholdsvis. Riboflflavin (Rib) vises som representantlfluorescerende forbindelse. Utdrag fra 17-daggamle ormer (villtype N2) er vist for sammenligning (C. elegans). b In vitro glykering av vitellogenin og forlengelsesfaktor ved ribose ga økninger i autofluorescens
over tid.c Western blotting-analyse av AGE og vitellogeniner i prøver ekstrahert fra ormpopulasjoner (villtype N2) i forskjellige aldre. Blottene ble avledet fra den samme gelen og ble behandlet med hvert antistoff i rekkefølge.d Kvantifiseringav vitellogeniner og AGE fra vestligeblotting ved hjelp av densitometri. Eksperimenter ble gjentatt to ganger, og dataene fra et representativt eksperiment er vist. Både linje og stiplet linje i rød farge viser foldendringene til AGE, mens de i svart indikerer mengder vitellogeniner. Lukkede sirkler og kryss er for data for bånd som samsvarer med henholdsvis YP170 og YP115


Identifikasjon av gamle ormespesifikke proteiner

Massespektrometrianalyse av ekstrakter fra 3- og 17-daggamle nematoderble utført på et AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF massespektrometer (Newark, NJ, USA) med Protein Pilot versjon 4.0. Begge matrisene varfordøyd av trypsin og blandet med en matriseløsning (7 mg/L av - cyano-4-hydroksykanelsyre i 0,1 prosent (v/v) trifluoreddiksyre (TFA), 70 prosent
(v/v) acetonitril (ACN)). Dekarhastigheten brukt for separasjon var 300 ml/min.og separasjon ble oppnådd ved bruk av en lineær gradient av to mobile faser ({{0}},1 prosent (v/v) TFA i 2 prosent ACN (løsningsmiddel A) og 0,1 prosent (v/v) TFA i 80 prosent ACN(løsningsmiddel B)) i følgende proporsjoner: A/B= 100/0–50/50 (60 min), A/B= 50/50–0/100 (20 min), A/B= 0/100 (10 min). Et MALDI-TOF Mass-system ble brukt for å oppnå en peptidmassefingeravtrykk. Peptid matching ogproteinsøk ble utført mot Swiss-Prot versjon 57.0-databasen.


Ekstraherte proteiner ble oppløst i 50 mM ammoniumbikarbonat(AmBic) for å gi proteinkonsentrasjoner mellom 0,1 og 1 µg/µL. For å maksimere løseligheten til proteiner, beregnes et volum av vannRapigest (Waters Corporation, Milford, MA, USA) ble tilsatt for å gifiendelige konsentrasjoner av 0.1–0,2 prosent Rapigest i prøver før fordøyelsen. Prøvene
ble oppvarmet til 40 grader med risting i 10 minutter; innholdet da varsentrifugert, og den resulterende pellet ble suspendert i AmBic inneholdende 10 mM DTT. Prøvene ble oppvarmet ved 80 grader i 15 minutter og pelletert ved romtemperatur. En alikvot av 200 mM jodacetamid (IAM) i 50 mMAmBic ble lagt til hver prøve for å gi enendeligIAM konsentrasjon av

20 mM (i nærvær av et 2 x molart overskudd av DTT); blandingen da varinkubert i mørket ved romtemperatur i 30 minutter for å tillate alkyleringsreaksjonen å fortsette. Trypsin i 50 mM AmBic ble blandet med hver løsning ved 1:50 (trypsin: proteinkonsentrasjon). Prøver ble fordøyd i minst 4 timer eller over natten ved 37 grader med risting. Følgendesentrifugering, TFA og ACN ble tilsatt for å giendeligkonsentrasjoner på 0.5–1.0 prosent TFA og 2 prosent ACN i volum. Prøvene ble ristet i 2 timer ved 60 grader. Etter sentrifugering ved 22 200 ×g i 5 minutter var supernatantenpipettert inn i et hetteglass med autosampler. Proteiner ble fordøyd med trypsin tidligeretil analyse ved omvendt-fase væskekromatografi ved bruk av et Ultimate3000RSnanoLC-system (Thermo Fisher Scientific) koblet til et ESI-Q-TOF-system (Impact II Bruker Daltonics). Gjær alkohol dehydrogenase(ADH1_GJÆR)-protein ble tilsatt i prøvene som en intern standard;spiking ble utført for å gi en mengde på ca. 50 fmol avstandard på søylen.


Autofluorescens etter in vitro glykering

Vitellogenin i PBS-løsning ({{0}}.053 µM) ble kjøpt fra Biosense Laboratories AS (Bergen, NORGE). Forlengelsesfaktorløsning (1,17 uM) ble kjøpt fra Abnova Corporation (Taipei City, Taiwan). Disse løsningene ble glykert med 0,1 mM ribose i 23 dager ved 37 grader. Riboflflavin ble kjøpt fra Sigma (Tokyo, Japan) og oppløst i PBS ved 0,1 mM. Hver løsning ble målt ved fluorescensspektrofotometri under de samme forholdene.

Immunfluorescensav unge og gamle ormerAlderssynkronisert CB1003 matet med OP50 ble inkubert ved 25 grader. Tre dager gamle og 13-dager gamle voksne ble permeabilisert med Bouin's rørfikseringsprotokoll43.


anti- senescence cistanche function

Fig. 7 Fluorescensbilder av 3-daggamle og 13-daggamle kynu-1-mutanter. a–cTre dager gamle ormer ogd–f 13-daggamle ormer, med råbilder i kolonne 1. For å utelukke mulige effekter av dødfluorescens som starter fra 2 dager før ormene' død, mutantenkynu-1var brukt. Autofluorescens sees i bildene i kolonne 2 og 3. Bildene i kolonne 3 ble forstørret fra de angitte (med rektangler) områdene av bildene i kolonne 2. Eldrede ormer (13-daggamle) autofluorescertesignififiklart høyere enn unge ormer (3-daggamle). Hver skalalinje indikerer 50μm. g Kvantifiseringav blåttfluorescensved hjelp av ImageJ og ImageQuant TL programvare. Hver stolpe representerer gjennomsnittsverdiene avfluorescensintensitet per 1 mm2 av ni ormer. ** indikerer en statistisk signififikan ikke skille mellom 3-daggamle og 13-dagers ormer ved enp verdi < 0.01. Feilstreker representerer SE.

Prøver varfikseti Bouin's fikseringsmiddelmed metanol/ -merkaptoetanolved romtemperatur i 30 min. For å knekke neglebåndet ble det plassert ormerisopropanol og lagret kl–80 grader i 10 minutter, deretter inkubert ved romtemperatur i ytterligere 30 minutter. Defikseringsmiddelløsningen ble fjernet ogerstattet med BTB-løsning (25 mM boratbuffer, 0,5 prosent Triton X-100, 2 prosent
-merkaptoetanol) ved romtemperatur i 1 time; inkubasjon i BTB vargjentas totalt tre ganger. Ormene ble deretter overført fra BTB til BT (25 mM boratbuffer, 0,5 prosent Triton X-100), inkubert i antistoffbufferløsning (1× PBS, 0,5 prosent Triton X-100, 0,1 mM EDTA, {{10}},1 prosent bovint serumalbumin (BSA), 0,05 prosent natriumazid, pH 7,2) ved romtemperatur for

1 time, og blokkert med en antistoffbufferløsning som inneholder 10 prosent geiteserum(Cosmo Bio, Tokyo, Japan) ved 4 grader over natten. De primære antistoffene besto av et muse monoklonalt anti-AGE (anti-CML) antistoff (klon nr. 6D12; 1:125) og et anti-pentosidin antistoff (klon nr. PEN-12, Trans Genic; 1:5 0). Det sekundære antistoffet besto av Alexa Fluor 555- konjugert geit-anti-muse-antistoff (Abcam, Cambridge, England; 1:100). Alle antistofffortynninger ble utført ved bruk av antistoffbuffer inneholdende 0,5 prosent BSA. Prøver ble montert på glassglass ved bruk av VECTASHIELD antifade monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).



Fluorescensmikroskopi

Fluorescensbilder av 3- eller 13-daggamle voksne ormer, montert på glassplater som beskrevet ovenfor, ble tatt opp med en omvendtfluorescensmikroskop (BZ-X700; Keyence) med en 10× objektivlinse (CFI Plan Fluor DL10×/0,30). Autoflfluorescens av ormer en rødfluorescensfra AlexaFluor 555 ble sett med BZ-X DAPI (eksitasjonsbølgelengde (Ex), 360 ±20 nm; emisjonsbølgelengde (Em), 460 ± 25 nm) og TRITC (Ex, 545 ±12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)filtre, henholdsvis. Seksjonsbilder blefanget av seksjoneringsmodus med endimensjonal spaltetype med enbredde 32, og Z-stabel pitch 0.7μm for 40-μm-tykke prøver. For å kvantifisere det blåfluorescens, denfluorescensintensiteter målt ved bilde
Quant TL-programvare (GE Healthcare) ble normalisert til tetthetsverdier per 1 mm2 av en orm's projeksjonsområde. Kroppsstørrelsen ble bestemt med Adobe Photoshop Elements og ImageJ-programvare utviklet av National Institutes of Health. I dette systemet, området til en orm's projeksjonble estimert automatisk og brukt som en indeks for kroppsstørrelse.



Statistisk analyse

Korrelasjonen av forventet levealder ble beregnet ved bruk av Spearman's rang korrelasjonskoeffisient. Autofluorescensnivåene etter in vitro glykering ble sammenlignet ved bruk av to-faktor faktoriell ANOVA og Scheffe's F test. DeELISA-verdier etter in vitro glykering ble sammenlignet ved bruk av enkeltfaktor ANOVA og Dunnett-testen for flere sammenligninger. Nematode overlevelseble beregnet av Kaplan–Meier-metoden, og overlevelsesforskjeller ble testet for signifikans ved bruk av log-rank test. Autofluorescensverdiene etter rifampicinbehandling og aldring avdaf-2ogkynu-1mutanter ble sammenlignet for hver ved bruk av Student's t test, gjentatt måling to-faktor ANOVA, og Mann–WhitneyU test. Autofluorescensverdiene etter ribosebehandlinger for N2 ellerkynu-1mutant ble sammenlignet ved å bruke det ikke-parametriske stålet–Dwass metode. Tetthetene fra autofluorescensmikroskopi ble sammenlignet med Student's t-test. Der det ble observert signifikans, ble data klassifisertfified som *p < 0.05 and **p < 0.01. All statistiske analyser ble utført med Microsoft Excel supplert medtilleggsprogramvarenPlusStatcel 3 (OMS, Tokyo, Japan) og JSTAT for Windows(Nankodo, Tokyo, Japan).


Rapporteringssammendrag

Ytterligere informasjon om forskningsdesign er tilgjengelig i NaturforskningenRapporteringssammendrag koblet til denne artikkelen.


DATA TILGJENGELIGHET

Datasettene generert under den nåværende studien er tilgjengelige fra tilsvarendeforfatter på rimelig forespørsel.



REFERANSER

1. Brenner, S. Genetikken tilCaenorhabditis elegans. Genetikk 77, 71–94 (1974).
2. Riddle, DL, Blumenthal, T., Meyer, BJ, Priess, JR (red.).C. elegans II. (KaldSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1997).
3. Herndon, LA et al. Stokastiske og genetiske faktorer påvirker vevsspesifikk nedgang i aldringC. elegans. Natur 419, 808–814 (2002).
4. Klass, MR Aldring i nematodenCaenorhabditis elegans: store biologiske og miljømessige faktorer som påvirker levetiden.Mech. Aging Dev. 6, 413–429 (1977).
5. Son, HG, Altintas, O., Kim, EJE, Kwon, S. & Lee, SV Aldersavhengige endringer og biomarkører for aldring iCaenorhabditis elegans. Aldringscelle 18, e12853 (2019).
6. Yoshino, J., Mills, KF, Yoon, MJ & Imai, S. Nikotinamidmononukleotid, en nøkkel NAD(Plus) middels, behandler patofysiologien til diett- og aldersindusert diabetes hos mus.Cell Metab. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel, MS, Lapierre, LR & Mack, HID Nye emner iC. elegansAldringsforskning: transkripsjonsregulering, stressrespons og epigenetikk.Mech. Alder ing Dev. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda, T., Yasui, C., Hoshino, K., Arikawa, K. & Nishikawa, Y. Inflfluens av melkesyrebakterier på levetiden tilCaenorhabditis elegansog vertsforsvar mot Salmonellaenteriskserovar Enteritidis.Appl. Environ. Microbiol. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura, T., Ikeda, T., Yasui, C., Saeki, S. & Nishikawa, Y. Mekanisme som ligger til grunn for lang levetid indusert av bifidobakterier iCaenorhabditis elegans. Biogerontologi 14, 73–87 (2013).
10. Clark, LC & Hodgkin, J. Commensals, probiotika og patogener iCae Caenorhabditis elegansmodell.Cellemikrobiol. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro, F. & Gems, D. Ormer trenger også mikrober: mikrobiota, helse og aldring iCaenorhabditis elegans. EMBO Mol. Med. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim, Y. & Mylonakis, E.Caenorhabditis elegansImmunkondisjonering med den probiotiske bakterienLactobacillus acidophilusstamme NCFM forsterker Gram-positive immunresponser.Infisere. Immun. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N. & Driscoll, M. In vivo spektrofluorimetriavslører endogene biomarkører som rapporterer helsespenn og kostholdsbegrensninger iCaenorhabditis elegans. Aldringscelle 4, 127–137 (2005).
14. Coburn, C. et al. Antranilitfluorescensmarkerer en kalsiumforplantet nekrotisk bølge som fremmer organismedød iC. elegans. PLoS Biol. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus, Z., Mazer, TC & Slack, FJ Autoflfluorescens som et mål på senescens iC. elegans: se til rødt, ikke blått eller grønt.Aldring (Albany NY) 8, 889–898 (2016).
16. Sebekova, K. & Sebekova, KB Glykerte proteiner i ernæring: venn eller fiende?Exp. Gerontol. 117, 76–90 (2019).
17. Giacco, F. & Brownlee, M. Oksidativt stress og diabetiske komplikasjoner.Opplag Res. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth, V. et al. Avanserte glykeringssluttprodukter og deres reseptor RAGE i Alzheimer's sykdom.Neurobiol. Alder 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo, Q., Yang, W., Chen, JY & Wang, Y. Metabolsk syndrom møter slitasjegikt.Nat. Rev. Rheumatol. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou, P. & Bohm, M. Avanserte sluttprodukter for glykering: nøkkelspillere i aldring av huden?Dermatoendokrinol 4, 259–270 (2012).
21. Liu, J. et al. Reseptor for avanserte glykeringssluttprodukter fremmer prematursenescens av proksimale tubulære epitelceller via aktivering av endoplasmatiskretikulumstressavhengig p21-signalering.Cellesignal 26, 110–121 (2014).

22. Mendler, M., Schlotterer, A., Morcos, M. & Nawroth, PP Forstå diabetisk polynevropati og lang levetid: hva kan vi lære av nematodenCae norhabditis elegans? Exp. Clin. Endokrinol. Diabetes 120, 182–183 (2012).


Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950


























Du kommer kanskje også til å like