Anti-aldring - Klotho genaktivert stillas fremmer foryngende sårhelingsrespons i menneskelige fettavledede stamceller

Nøkkelord:anti-aldring; -Klotho; genaktivert stillas; fettavledede stamceller; angiogenese;matriseavsetning;foryngende helbredelse

Klikk her for å få Herb Cistanche for anti-aldring og sårheling

1. Introduksjon

Sårheling er en kompleks biologisk prosess som krever en tett orkestrering av flere cellulære hendelser [1]. I den aldrende befolkningen blir imidlertid cellulære hendelser forstyrret, noe som fører til forsinket helbredelse [2]. Forstyrrelsen i helbredelsesmekanismene oppstår delvis på grunn av redusert hjemsøking av stamceller fra benmargen og andre rådende metabolske sykdommer som diabetes [3,4]. I sårbehandling blir bruk av biomaterialstillaser stadig mer vanlig som behandling. Biomateriale stillaserbeskytte såret mot infeksjon, absorbere såreksudater og holde såret fuktig for å forhindre vevsnekrose [5]. Terapeutika kan også lastes inn i biomateriale stillaser og fremme raskere tilheling i vanskelige sår [1]. Imidlertid kan det hende at biomaterialstillaser alene ikke effektivt orkestrerer de mange signalkaskadene som oppstår i såret. Levering av stamceller er noen ganger foreslått som en løsning for å moderere de komplekse signalhendelsene i såret [6]. 

Stamceller skiller ut parakrine faktorer og kan differensiere til celler fra flere vevslinjer [7]. Stamceller leveres vanligvis inn i såret gjennom intradermale injeksjoner [6], aktuell sprøyting [8], eller som vevskonstruerte transplantater [9]. De siste årene har bruken av vevskonstruerte transplantater for kronisk sårheling gradvis vunnet bredere aksept på grunn av deres evne til å lege sår raskt [9–11]. Apligraf® og Dermagraft® er to av de mye brukte Food and Drug Administration (FDA)-godkjente biokonstruerte konstruksjonene for kronisk sårbehandling [12,13]. Generering av disse transplantatene krever imidlertid langvarig cellekultur for å produsere høye celletall [14]. Ved bruk av stamceller kan langvarig dyrking øke cellulær senescens og redusere stammen til stamcellene [15,16]. Derfor er det å opprettholde stamcellene til stamcellene sentralt for å oppnå den optimale terapeutiske responsen. Terapeutisk genlevering til stamcellene ved bruk av ikke-virale vektorer er en potensiell strategi for å forbedre stamcellenes funksjonalitet [17]. Tradisjonelt blir cellene transfektert i 2D-kulturer og senere transplantert in vivo [18]. Imidlertid, plattformer som de genaktiverte stillasene, bestående av biomateriale stillasene funksjonaliserte med nanopartikler som bærer det terapeutiske transgenet [19], at gruppen vår har vært banebrytende for å tilby en alternativ løsning for transfeksjon av cellene i et 3-D-miljø. Denne studien fokuserte på å utvikle en genaktivert versjon av 3D kollagen-kondroitinsulfat (coll-CS) stillaset som har et enormt klinisk oversettelsespotensial, siden sammensetningen ligner sammensetningen til Integras Dermal Regeneration Template (DRT), en klinisk godkjent stillas for kronisk sårheling [20]. Vi bruker først og fremst en kationisk polymer kalt polyetylenimin (PEI) for å kondensere DNA-plasmider som koder for vekstfaktorgener som stromal-avledet faktor-1 alfa og nervevekstfaktor og sette dem sammen til ladede nanopartikler [21–23]. Disse ladede nanopartikler blir deretter bløtlastet inn i vårt coll-CS-stillas for å generere de genaktiverte stillasene. Våre tidligere studier har også vist at det PEI-baserte genaktiverte stillaset kan forårsake forbigående overekspresjon av det terapeutiske transgenet i en rekke sårhelende celler og fremme deres regenerative evner [21,24,25]. Tradisjonelt ble det genaktiverte stillaset utviklet for å målrette vertsceller og fremme lokal reparasjon [26]. Nye bevis indikerer imidlertid at celleladede genaktiverte stillaser har overlegen styrke til å regenerere komplekse vevsstrukturer enn genaktiverte stillaser alene [27]. 

Cellulær overflod er et av de avgjørende kravene for generering av vevskonstruerte transplantater [28]. Fettvevet er en rik kilde som kan forsyne et stort antall stamceller. Fettvevet inneholder så mange som 500 ganger stamcellene for den samme massen av benmarg, en tradisjonell vevskilde for stamcelleekstraksjon [29]. Dessuten kan stamcellene ekstraheres fra fettvevet ved hjelp av en minimalt invasiv fettsugingsprosess [29]. Vår nylige studie fant at humane fettavledede stamceller (ADSCs) viser utmerket biokompatibilitet med coll-CS-stillaset. Bruk av et pro-angiogent genaktivert stillas forbedret ADSCs regenerative responser ytterligere [30]. Imidlertid har ADSC-ene en tendens til å miste sin stamness ved utvidelse [31]. Tidligere fant vi at et anti-aldringsprotein -Klotho kan betydelig forbedre spredningen av sunne og diabetiske humane ADSCs [32]. De fleste studier bruker generelt primærvarianten -Klotho [33–35] og har vist at proteinet kan øke levetiden til ADSC-er ved å aktivere telomerase-transkripsjonsaktiviteten [33]. - Klotho-overuttrykkende MSC-er har også vist seg å ha sterke anti-fibrotiske effekter ved nyreskade gjennom hemming av Wnt/ -catenin signalering [36]. Men rollen til -Klotho i stamceller forblir relativt uutforsket.

Foruten forskjellen i forskningsfokus mellom de - og -Klotho, anti-aldringKlotho-proteiner er ennå ikke fullt ut inkorporert i vevsteknikkstrategienefor sårheling. Derfor, i denne studien, søkte vi å studere den funksjonelle effekten av en -Klotho-genaktivert stillas på menneskelige ADSC-er for sårhelingsapplikasjoner. Viundersøkte først transkripsjonsaktivitetene til de klassiske pluripotensfaktorene (okt-4,Nanog og Sox-2), spredningsmarkør (Ki-67) og sårhelingsregulatorer (TGF- 3 og TGF- 1) i ADSC-ene. Vi vurderte deretter bioaktiviteten til de kondisjonerte mediagenerert av det ADSCs-ladede genaktiverte stillaset for å evaluere dets parakrine potensial.Til slutt undersøkte vi regenereringen av basalmembranen (fibronektin, laminin,og kollagen IV) og arrassosierte proteiner ( -SMA og elastin) i ADSC-ladedegenaktivert stillas for å evaluere kontrollert vevsmodning.

2. Resultater

2.1. -Klotho genaktivert stillas forsterker forbigående menneskelige ADSCs stamstyrke og pro-reparative gener

Genekspresjonsanalyse viste først at ADSC-ene på det genaktiverte stillaset overuttrykte -Klotho-genet over 172-fold (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1EN). Dette funnet bekreftet den effektive interaksjonen mellom ADSC-ene med det genaktiverte stillaset. Analyse av spredningsmarkøren Ki-67 bekreftet videre at ADSC-ene på det genaktiverte stillaset også opprettholdt en robust spredningskapasitet over 14 dager (figur1EN). Etter å ha bekreftet overuttrykket av anti-aldring -Klotho-genet, vi vurderte deretter stamcellers foryngelse gjennom aktivering av "pluripotens"-faktorer i ADSC-ene. Totalt sett bemerket vi en forbigående regulering av alle tre transkripsjonsfaktorene i løpet av de 14 dagene (figur1B). ADSC-ene viste imidlertid bare en signifikant økning i ekspresjonen av Oct-4-genet som ble opprettholdt til dag 14. Spesifikt viste ADSC-ene en 2.5--fold (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Nivåene av pro-fibrotisk TGF- 1 gen i - Klotho-overuttrykkende ADSC-er ble funnet å være på nivå med den for den genfrie stillasgruppen i løpet av de 14 dagene. Nivåene av anti-fibrotisk TGF- 3 var signifikant (3.6-fold,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Klotho genaktivert stillas

Forbedrer den parakrine styrken til menneskelige ADSC-er2.2.1. Pro-angiogen bioaktivitet Bioaktivitetstesten av CM generert av ADSCs-ladet genaktivert stillas viste først at den kunne kontrollere den metabolske aktiviteten i HUVECs tidsmessig. Dag 3 CM økte den metabolske aktiviteten i HUVEC signifikant, mens bruk av gammel CM fra dag 14 reduserte HUVECs metabolske aktivitet signifikant (figur2EN). Etter å ha observert dette, testet vi deretter den pro-angiogene virkningen av CM fra dag 3 og 14 på HUVEC-ene sådd på Matrigel. Som forventet, dag 3 CM fra den genaktiverte stillasgruppen betydelig (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Imidlertid skjedde ingen ytterligere økning i angiogen aktivitet med dag 14 CM sammenlignet med dag 3 CM. Dagen 14 CM fra begge gruppene viste også lignende pro-angiogen effektivitet (figur2C). Samlet indikerer vårt funn at det genaktiverte stillaset forbigående fremskynder ADSCs pro-angiogene respons.

pro-fibrotisk TGF- 1. ** og * indikererp < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± standardavvik (n = 3).

Figur 2. Pro-angiogen parakrin bioaktivitet av ADSCs-ladet genaktivert stillas CM. (A) CM produsert av det ADSCs-ladede genaktiverte stillaset i løpet av de 14 dagene demonstrerte en evne til tidsmessig å kontrollere HUVECs metabolske aktivitet. (B) Dag 3 CM fra den genaktiverte stillasgruppen forbedret dannelsen av endoteltubuli og dens forgrening betydelig sammenlignet med den for den genfrie stillasgruppen. (C) Tubulusdannelse og forgrening av endotelceller 6 timer etter eksponering for CM fra ADSCs seedet genaktivert og genfritt stillas, * indikerer p < 0.05. Data representerer gjennomsnittlig! standardavvik (n=3)

2.2.2. Hudfibroblastheling og modning

Et av funnene fra angiogenesestudien er at når det ADSCs-ladede genaktiverte stillaset modnes, fremmer det ikke lenger angiogenese. Videre på dag 14 var deres angiogene styrke lik den for den genfrie stillasgruppen (Figur 2B, C) Derfor undersøkte vi påvirkningen av alderen 14 CM på lukking av dermal fibroblastsår. I likhet med resultatet av angiogenesestudien, viste begge gruppene lignende nivåer av fibroblastsårlukking med dag 14 CM. Spesifikt helbredet begge gruppene såret med omtrent 40 prosent på 12 timer (Figur 3A). Dette funnet avslørte at under modning støtter den genaktiverte stillasgruppen, men fremmer ikke lukking av dermal fibroblastsår.

Ikke desto mindre, ettersom fibroblastene ble stimulert med gammel CM, studerte vi om påvirkningene av uttrykket av matriseproteiner involvert i sårmodning. Som forventet uttrykte dermale fibroblaster stimulert med CM fra den genfrie stillasgruppen rikelig det pro-fibrotiske kollagen I-proteinet (figur 3B). Tvert imot, fibroblaster stimulert med CM fra den genaktiverte stillasgruppen viste 5 0 prosent lavere ekspresjon (p < 0,05) av kollagen I-proteinet. I mellomtiden manglet begge gruppene uttrykket av anti-fibrotisk kollagen, og ingen forskjeller ble observert mellom de to gruppene. Samlet sett innebærer det at det genaktiverte stillaset forbedrer ADSC-sårmodulerende respons under modning.

Figur 3. Parakrin påvirkning på dermal tilheling og modning. (A) Eldre dag 14 CM fra begge gruppene utøvde lignende nivåer av sårlukkingsaktivitet i humane voksne dermale fibroblaster med omtrent 40 prosent på 12 timer. (B) CM fra det genaktiverte stillaset reduserte uttrykket betydelig av pro-fibrotisk kollagen i fibroblastene. " indikerer p < 0,05 Data representerer gjennomsnittlig=standardavvik (n=3). I figur 3B står GAS og GFS for henholdsvis genaktivert stillas og genfritt stillas

2.3. B-Klotho genaktivert stillas forbedrer kjellermembranregenerering med forbedret anti-fibrotisk respons i menneskelige ADSCer

Etter å ha observert det genaktiverte stillasets kontrollerte stimulering av ADSCs funksjonalitet, undersøkte vi til slutt ADSCs respons mot regenerering av dermale matriser og proteiner. Det genaktiverte stillaset forbedret kraftig regenereringen av ADSCs basalmembran. Spesifikt fremmet det genaktiverte stillaset signifikant avsetningen av basalmembrankomponenter laminin og kollagen IVFigur 4A). Etter den semikvantitative analysen bemerket vi også at matriseavsetningen fulgte en trend i forhold til den genfrie stillasgruppen. Trenden som ble observert varfibronektin (1.0-fold) < laminin (2.1-fold, p < {{10}}.05) < kollagen IV (8.8-fold, p < 0,01). Så snart evnen til å regenerere basalmembranen ble bestemt, vurderte vi ekspresjonen av proteiner som er avgjørende for overlegen kvalitativ helbredelse, for eksempel redusert arrdannelse. ADSC-ene på det genaktiverte stillaset demonstrerte et signifikant (p < 0,05) redusert uttrykk av det arrassosierte kontraktile proteinet a-SMA. a-SMA-uttrykket i ADSC-ene var lavere med 50 prosent i forhold til den genfrie stillasgruppen (figur 4B). Til slutt etter å ha observert det reduserte a-SMA-uttrykket, vurderte vi uttrykket av det elastiske matriseproteinet elastin. ADSC-ene på det genaktiverte stillaset demonstrerte et relativt overlegent kvalitativt elastinekspresjon gjennom avsetning av et modent fibrøst nettverk av elastin sammenlignet med ADSC-ene på det genfrie stillaset (Figur 4B).

Figur 4. Avsetning av pro-sårhelende matriseproteiner av ADSC-ene i det genaktiverte stillaset på dag 14. (A) ADSC-ene i det genaktiverte stillaset viste signifikant regen. drift av basalmembranen sammenlignet med ADSC-ene i det genfrie stillaset. ADSC-ene avsatte hovedsakelig et relativt modent nettverk av kollagen IV-proteiner, etterfulgt av laminin og fibronektin.(B) ADSC-ene i det genaktiverte stillaset uttrykte også 2- ganger lavere av SMA-proteinet sammenlignet med ADSC-ene i genet -gratis stillas. I forbindelse med kjellermem. brane-regenerering, avsatte ADSC-ene i det genaktiverte stillaset en kvalitativt bedre elastisk matrise. Alle bildene ble tatt gjennom 20x objektiv ved bruk av et IX73 Olympus-mikroskop* og * indikerer henholdsvis p < 0.01 og p < 0.05. Målestokk 50um. Data representerer gjennomsnittlig standardavvik (n=3).-SMA og fibronektin ble dobbeltimmunfarget.

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950