Anti-allergiske og anti-inflammatoriske effekter av Neferin på RBL-2H3 Cells Plus

Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon

3. Diskusjon

Patogenesen til atopisk dermatitt (AD) er ikke fullt ut forstått, men sykdommen er mediert av en unormal immunglobulin E (IgE) immunrespons i hudbarrieredysfunksjon. Blant dem kan mastceller (MC) forårsake IgE-medierte allergiske sykdommer, inkludert AD. Når mastceller aktiveres, frigjør de sine membranbundne cytoplasmatiske partikler, noe som fører til frigjøring av en rekke molekyler. Disse molekylene spiller en viktig rolle i patogenesen av AD og vertsforsvar [27]. Fordi hemming av mastcelleaktivering eller degranulering hjelper til med å regulere ulike IgE-medierte overfølsomhetsreaksjoner, er mastceller et av de ideelle målene for å utforske antiallergiske legemidler. I vår studie degranuleres mastceller som respons på forbindelse 48/80 og kalsiumionoforen A23187, og anti-DNP/IgE pluss DNP/HSA. Vi fant at referanse effektivt hemmet degranuleringseffekten til mastceller, noe som viste dens antiallergiske reaksjon. Dessuten ble økningen i intracellulært kalsium og aktivering av MAPK hemmet ved referanse. Videre ble hudmastcelleinfiltrasjonen forårsaket av DNCB og skrapeoppførselen forårsaket av forbindelse 48/80 også redusert. Derfor har mekanismen til neferins anti-atopisk dermatitt en multiplikatoreffekt på keratinocytter og mastceller.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, men la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogenese de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activation eller desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, det aumento de calcio intracellular og aktiviseringen av MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. På samme måte, en mekanisme for dermatitis antiatópica de la neferina har en effekt multiplicador sobre los queratinocitos og los mastocitos.

Klikk her for å vite mer

Cytoplasmaet til mastceller som finnes i vev er fylt med store, tette partikler av forhåndsdannede inflammatoriske mediatorer [28]. Prosessen med å frigjøre disse mediatorene fra sekretoriske granuler i mastceller kalles degranulering. Siden hemming av mastcelledegranulering kan regulere ulike IgE-medierte overfølsomhetsreaksjoner, er mastceller et av de ideelle målene for å utforske antiallergiske legemidler [29,30]. Våre resultater viser at referanse har en meget god effekt på degranulering av mastceller uavhengig av bruk av antigen, reseptorstimulator eller ionofor. Dette viser at referanse er et potensielt antiallergimiddel (figur 2).

Alle forhåndslagrede granuler, nylig syntetiserte mediatorer, og til og med granuler og deres komponenter kan brukes som MC-aktiveringsindikatorer [31]. I tillegg er standardmetoden måling av intracellulær Ca4t-konsentrasjon. De fleste av MC-sekretagogene (f.eks. antigen, forbindelse 48/80) som generelt har vært brukt i laboratoriet forårsaket en økning i den intracellulære Ca2 pluss-konsentrasjonen. Faktisk kan økningen i intracellulær Ca2 pluss-konsentrasjon også utløse MC-degranulering. Vanligvis induseres økningen i intracellulær Ca4t ved å aktivere MC med forbindelser, slik som thapsigargin (spesifikt blokkerer Sarco/endoplasmatisk Ca2 pluss ATPase, SERCA) pumper og ionoforer (dvs. ionomycin og A23187) [32,33]. Derfor, i den Ca2t-avhengige MC-aktiveringen, anses målingen av Ca2t-tilstrømningen også som en metode for å bestemme MC-aktiveringsforholdene. I MC-forskning er Fura-2 mye brukt for å bestemme intracellulær Ca2 pluss endringer. I våre eksperimenter fant vi at fluorescensintensiteten til aktiverte mastceller ble betydelig undertrykt etter å ha blitt behandlet med referanse (figur 3). Tidligere rapporter indikerte at økningen i intracellulær Ca4t-konsentrasjon var i samsvar med frigjøringen av histamin [34]. Derfor konkluderer vi at frigjøringen av histamin også vil bli hemmet av referansebehandlingen. Ytterligere eksperimenter er berettiget for å bekrefte denne hypotesen.

Mastceller har betydelig forskjellig funksjonell utgang.cistanche dosering redditDisse inkluderer degranulering, dannelse av arakidonsyreforløpere, kjemotaksi og cytokinproduksjon, og er alle avhengige av kalsiumsignalene til en viss grad, uavhengig av sentralstimulerende midler [32] Aktivert MC frigjør cytokiner, som er de viktigste mediatorene av allergier og inflammatoriske sykdommer [32] 35]. Produksjonen av cytokiner av aktiverte mastceller er resultatet av induksjonen av cytokin-gentranskripsjon i disse cellene. Stimuleringen av mastceller fører til aktivering av NF-kB og AP-1 og produksjon av mange cytokiner [36]. MAPK-kaskadesignalveier spiller en viktig rolle i reguleringen av ekspresjonen av cytokiner. Aktiveringen av disse banene gjennom PKCs aktivering av PI resulterer i aktivering av ulike gener, inkludert inflammatoriske cytokingener som IL-1, IL-6 og TNF [37]. Våre nyere studier har vist at referanse kan hemme cytokinene som frigjøres ved aktivering av keratinocytter. Samtidig fant vi også at pathway-aktiveringen av MAPK også vil bli hemmet av referansebehandlingen [18]. I vår nåværende studie viste vi at referanse også kan redusere uttrykket av cytokiner gjennom hemming av MAPK-aktivering i mastceller (figur 4 og 5). Aktiveringen av NFkB reduseres også på grunn av inhiberingen av MAPK-aktivering (figur 6).

Cistanche kan anti-aldring

En rekke studier har rapportert at en rekke cytokiner hos AD-pasienter er forhøyede, noe som fører til hudbarriere dysfunksjon, inkludert cytokiner utskilt av keratinocytter og Th2-deriverte cytokiner [38,39]. I tillegg er det rapportert at disse utskilte cytokinene også kan nedregulere uttrykkene av tight junction (T])-proteiner og terminale differensieringsgener, inkludert filaggrin (FLG), loricrin (LOR) og involukrin (IVL) [39,40 ](Pro)filaggrinekspresjon er redusert i AD og er omvendt assosiert med MC-tryptase og IL-6[41]. IL-1 medierer kronisk betennelse hos mus med nedsatt hudbarriere [35]. I en tidligere studie ble det rapportert at uttrykkene til FLG, IVL og LOR ble nedregulert etter påføring av DNCB på dorsalhuden til NC/Nga-mus [42,43]. I denne studien ble uttrykkene for FLG, IVL og LOR betydelig redusert i dorsalhuden til kontrollgruppen, noe som indikerte at den epidermale barrieren var svekket. Administrering av referanse gjenopprettet signifikant reduserte uttrykk av FLG, IVL og LOR etter behandling av DNCB, mens referanseadministrasjon økte uttrykkene av IVL og LOR noe sammenlignet med kontrollgruppen (Figur 8). Det er kjent at forbindelse 48/80 er en effektiv aktivator av hudmastceller. Hudresponsen stimulert av forbindelse 48/80 kan indusere skrapeadferd ved å frigjøre histamin fra mastceller [44]. Histamin frigjort fra aktiverte mastceller spiller en viktig rolle i økningen i vaskulær permeabilitet forårsaket av forbindelse 48/80. Under menneskelig kløe vurderes også histamin frigjort fra mastceller gjennom ulike stimuli. ansett å være en viktig mekler. Derfor er hemming av degranulering av mastceller et viktig skritt i å regulere histaminfrigjøring under skrapeoppførsel. I denne studieforbindelsen forårsaket 48/80 effektiv aktivering av hudmastceller. Imidlertid reduserte forbehandling med referanse signifikant degranuleringsnivået til mastceller (figur 2).cistanche ekstrakt fordelerDisse resultatene indikerer at den anti-ripe atferdseffekten av referanse kan skyldes reduksjonen i vaskulær permeabilitet ved å regulere mastcelledegranulering (Figur 9).

Det er generelt etablert at AD-pasienter lider av hudbarrieredysfunksjon, hudbetennelse eller begge deler, så det er vanskelig å finne en passende behandlingsmetode. Derfor anbefales vanligvis kombinasjonsbehandling. Vår nyere forskning har vist at aldri har immunmodulerende funksjon og barriere-reparasjonsevne. Derfor er et viktig referansetrekk ved AD-behandling i fremtiden vedlikehold av hudfunksjon og forbedring av hudhydrering og barriere-reparasjon. Referanse kan også redusere skrapeadferd indusert av allergener og irritanter. Dessuten er den atopiske marsj en fenomenrelatert sykdom som oppstår og utvikler seg trinnvis. Atopisk dermatitt ses ofte i spedbarnsalderen. Matallergi oppstår ofte etter 1-2års alder. Allergisk rhinitt kan ofte starte før og etter skoletid. Astmasymptomer dukker opp til forskjellige tider, men de fleste er etter allergisk rhinitt. Etter barndommen kan atopisk dermatitt og visse matallergier bli bedre eller forsvinne. Allergisk rhinitt og astma er ikke lett å kurere[45,46]. Derfor er de komorbide fenomener i sykdommer. Naturlige produkter inkludert referanser har det terapeutiske potensialet til komorbiditet, og deres effektivitet i relaterte sykdommer er verdt å studere i fremtiden.

4. Materialer og metoder

4.1. Basofile rotte-leukemiceller

Basofile leukemiceller fra rotter (RBL-2H3) var en gave fra TLHwang, Chang Gung University, Taoyuan, Taiwan. RBL-2H3-celler er mukosale mastceller som brukes til å studere antigen- eller kalsiumionofor-indusert degranulering, intracellulær Ca4t og signaltransduksjon [29]. Cellene ble dyrket i EMEM inneholdende 10 prosent FBS, med penicillin og streptomycin ved 37 grader, 5 prosent CO2. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IM) og føtalt bovint serum (FBS) ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, USA).

4.2.MTT-analyse

3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT)-analyse brukes til å måle den metabolske aktiviteten til cellene. RBL-2H3-celler ble sådd i en 24-brønnkulturplate ved 5 × 10 pluss/brønn. Etter 24 timers medikamentbehandling ble 30 μL MTI per brønn tilsatt og plassert i en 37 graders celleinkubator i 2-4 timer, deretter ble lilla formazan-krystaller oppløst med DMSO. En ELISA-leser ble brukt for å måle absorbansintensiteten ved en bølgelengde på 550 nm som en cellelevedyktighetstest.

4.3. Måling av intracellulært Ca2 pluss nivå

[Ca2t] Jeg ble målt med fura-2 som beskrevet tidligere[47].RBL-2H3-celler ble resuspendert i IMDM som inneholdt 5 uM Fura 2-AM og 1,2 mM CaClz ved 37 grader for 30 min. Etter Fura{11}}-lasting ble keratinocytter pelletert og resuspendert i fersk DMEM. En alikvot (2 mL) ble overført til en omrørt kyvette som inneholdt 1,2 mM CaClz.Fura-2-Ca-fluorescens ble analysert ved eksitasjonsbølgelengdene 340 og 380 nm (emisjonsbølgelengde, 505 nm) i en Perkin{19 LS }} spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Data ble registrert med 5s intervaller[47].

4.4. Kvantitativ polymerkjedereaksjon (qPCR)

RBL{{0}}H3-celler ble plantet i en 3,5 cm kulturskål. Etter at cellene vokste til 90 prosent fulle, ble cellene dyrket i statisk tilstand i 24 timer. Etter at cellene var forbehandlet med referanse i 20 minutter, ble de stimulert med TNF-a/IFN-y i henholdsvis 1 eller 24 timer. Cellene ble skrapet av, sentrifugert (16,000×g,10 min,4 grader), og supernatanten ble ekstrahert. RNA ble renset ved å bruke et totalt RNA-isolasjonssett (GeneDirex@, Vegas, NV, USA). I henhold til operasjonsprosedyren til script cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD), ble reagenser tilsatt i rekkefølge og operert i henhold til de angitte betingelsene for å konvertere RNA til cDNA. Videre ble PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM) brukt. Totalt 7,5 µl ddH20, 2 µl cDNA, 0,25 µl forover- og reversprimere og 10 µl SYBR GREEN ble tilsatt og blandet jevnt. Primersekvensene er vist i tabell 1 og 2. Deretter ble RNA kvantifisert ved å bruke ABI StepOnePlusTM Real-time PCR System.

4.5. Western Blot Assay

Western blotting brukes til å analysere endringene av ulike proteiner i celler. RBL{{0}}H3-celler ble sådd i en 3,5 cm kulturskål. Etter at cellene vokste til 90 prosent fulle og ble sultet i 24 timer, ble de forbehandlet med referanse i 20 minutter, og deretter stimulert med TNF-a eller IFN-y i henholdsvis 30 minutter eller 1 time. Etter skraping ble de pulverisert ved ultralyd og sentrifugert (13 200 rpm, 10 min, 4 grader). Etter sentrifugering ble supernatanten tatt og proteinet ble kvantifisert med et Pierce-proteinanalysesett (Pierce, Rockford, IL, USA). Det ble elektroforert på 10 prosent SDS-polyakrylamidgel og deretter elektroporert med PVDF-membran. Etter at overføringen var fullført, ble PVDF-membranen satt inn i TBS-T (Tris-bufret saltvann/0,05 prosent tween 20)-løsning inneholdende 5 prosent skummetmelkpulver og ristet i 1 time for å unngå uspesifikk binding. Deretter ble TBS-T brukt til å vaske 3 ganger, 10 minutter hver gang. Deretter ble primære antistoffer (1:1000 fortynning) tilsatt og plassert ved 4 grader over natten og ble deretter vasket 3 ganger med TBS-T hvert 10. minutt. Etter tilsetning av sekundære antistoffer (fortynnet 1:1000) i 1 time, ble PVDF-membranen vasket 3 ganger med TBS-T i 10 minutter hver gang. Til slutt ble fremkalleren tilsatt, og membranen ble plassert i et kjemisk luminescensekstraksjonssystem (BIOSTEP Celvin") for skyting.

4.6.Dinitroklorbenzen(2,4-Dinitroklorben2en, DNCB)Indusert atopisk dermatittlignende hudbetennelse hos mus

Først ble musene delt inn i fire grupper: kontrollgruppe, DNCB-gruppe (negativ gruppe), referanse (3 mg/kg og 10 mg/kg) med DNCB-gruppe, og deksametason (0,2 mg/kg) med DNCB gruppe (positiv gruppe). Deksametason er et kortikosteroidhormon som kan redusere hevelse og allergiske reaksjoner. I dette in vivo-eksperimentet ble både referanse og deksametason oppløst i DMSO, mens DNCB ble oppløst i 75 prosent etanol ved ultralydsjokk. Førstnevnte ble gitt ved intraperitoneal injeksjon, og for sistnevnte ble det påført 100 ul på rygghuden og 20 μL på høyre øre. Tre dager før forsøket ble musene bedøvet og bakhåret ble fjernet, og en liten målemagnet (SCT-MAG-TF) ble innebygd på baksiden av musens bakføtter.cistanche genghis khanEtter tre dagers hvile ble det bekreftet at musene var i god fysisk form og at huden på dorsal depileringsområdet var normal, og forsøket ble startet. Under eksperimentet ble det tatt bilder for å registrere endringer i hudens utseende. Det første stadiet ({{0}} dager) var perioden med allergisk atopisk dermatitt. Etter å ha målt de grunnleggende verdiene for mus i DNCB-gruppen, referansegruppen (3 og 10 mg/kg) og DNCB-eksperimentgruppen, og deksametason 0,2 mg/kg og DNCB-eksperimentgruppen, ble 1 prosent DNCB jevnt påført på rygghuden og høyre øre. På den femte dagen ble legemiddelreferansen og deksametason injisert intraperitonealt. Den andre fasen (dag 5 til dag 14) var re-induksjon av atopisk dermatitt.cistanche levetidsforlengelseI de 3 eksperimentelle gruppene ble0,5 prosent DNCB jevnt smurt ut på baksiden og høyre øre på musene. Dagen etter ble hudens fysiologiske verdier og bilder tatt og registrert. Etter at musene ble avlivet med for mye karbondioksid (CO2) på den 15. dagen, ble rygghudsvevet fjernet for påfølgende eksperimentell analyse.

4.7. Forbindelse 48/80-Indusert skrapeatferd hos BALB/c-mus

Håret på huden på baksiden av musen ble kuttet, og 20 μL av forbindelse 48/80-løsning ble injisert intrakutant. Kontrollmusene fikk saltvannsinjeksjoner i stedet. Umiddelbart etter injeksjonen ble dyret plassert i et observasjonsbur (diameter 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Japan), og musens skrapeadferd ble automatisk og objektivt oppdaget og evaluert. Ripeoppførselen ble målt i 60 min. MicroAct bruker følgende analyseparametere for å oppdage bølger som tilsvarer den kontinuerlige skrapeatferden til mus: terskel,0,05 V; hendelsesgap,0,05 s; minimum varighet,0,25 s; maksimal frekvens,30 Hz; minimumsfrekvens, 5Hz. 4.8.Statistisk analyse

Sigma-Plot-programvare (versjon 10.0) ble brukt for den statistiske analysen.cistanche nzData er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, med(*) og(#) som noter. Den statistiske signifikansen til dataene ble analysert ved uparrede, to-halede Student t-tests.p-verdier mindre enn 0.05 og 0,01 ble ansett som signifikante.

5. Konklusjoner

I denne studien fant vi ut at referanse effektivt hemmer degranuleringen av mastceller og reduserer uttrykket av pro-inflammatoriske cytokiner, som kan redusere atopisk dermatitt-lignende symptomer, gjenopprette hudbarrieren og redusere riper i huden. Vi har videre bevist at referanse ikke bare kan virke på keratinocyttene i huden, men også påvirke aktiveringen av mastceller. Det har mer potensial for bruk ved allergiske og inflammatoriske hudsykdommer.

Denne artikkelen er hentet fra Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms