Anti-melanogen effekt av etanolekstrakt av Sorghum Bicolor på IBMX-indusert melanogenese i B16/F10 melanomceller

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo og Ho Jin Heo

Abstrakt:For å vurdere muligheten som hudblekemiddel forSorghum bicolor(S. bicolor), sinantioksidantaktivitet, og anti-melanogen effekt på 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX)-indusertmelanogenesei B16/F10 ble melanomceller undersøkt. Resultatet av totalt fenolinnhold (TPC) indikerte at 60 prosent etanolekstrakt avS. bicolor(ESB) har det høyeste innholdet enn andre etanolekstrakter.Antioksidantaktiviteten ble evaluert ved å bruke 2,2'-azino-bis-(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) diammoniumsalt (ABTS)/1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH) radikalfjernende aktiviteter og malondialdehyd (MDA) hemmende effekt. Disse resultatene viste at ESB har signifikantantioksidantaktiviteter. Hemmende effekt mot tyrosinase ble også vurdert ved bruk av L-tyrosin (IC50-verdi=89.25 µg/mL) og 3,4-dihydroksy-L-fenylalanin (L-DOPA) som underlag. I tillegg hemmet ESB-behandling effektivt melaninproduksjonen i IBMX-induserte B16/F10 melanomceller. For å bekrefte mekanismen for den anti-melanogene effekten av ESB, undersøkte vi melanogenese-relaterte proteiner. ESB nedregulertmelanogeneseved å redusere uttrykket av mikroftalmi-assosiert transkripsjonsfaktor (MITF), tyrosinase og tyrosinase-relatert protein (TRP)-1. Til slutt ble 9-hydroksyoktadekadiensyre (9-HODE),1,3-O-dikaffeoylglyserol og tricin som hovedforbindelsene til ESB analysert ved bruk av ultraytelses væskekromatografi-ionmobilitetsseparasjon-kvadrupol flytid/tandemma-spektrometri (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Disse funnene tyder på at ESB kan ha det fysiologiske potensialet til å brukes som hudblekingsmateriale.

Nøkkelord:anti-melanogenese; B16/F10 melanomcelle; hydroksyoktadekadiensyre;Sorghumbicolor; 3-isobutyl-1-metylxantin

Cistanche hemmer melanindannelsen.

1. Introduksjon

Melanin genereres gjennom en prosess, kaltmelanogeneseinnenfor de intracellulære melanosomene til melanocytter, og produksjonen og distribusjonen av melanin bestemmer hud, øyne og hårfarge. I tillegg spiller melanin en viktig rolle i å beskytte huden mot ulike molekyler og stimuli som ultrafiolett (UV) stråling, reaktive oksygenarter (ROS), -melanocyttstimulerende hormon (-MSH) og syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) hevemidler inkludert forskolinand IBMX [1]. Spesielt skader UV-stråling, direkte og indirekte, hudceller via ROS-generasjoner som hydroksylradikaler, superoksidanioner og hydrogenperoksid [2]. Den genererte ROS forårsaker enkelt- og dobbelttrådet DNA bryter og angriper viktige cellulære strukturelle molekyler som proteiner og lipider [2]. Dermed melanin ogantioksidantenzymer som glutationperoksidase, superoksiddismutase og katalase opprettholder et konstant nivå ved å fjerne ROS produsert. Imidlertid aktiverer overdreven ROS-produksjon som et resultat av ulike faktorer melanogenese i huden, og den unormale melaninakkumuleringen induserer negative hyperpigmenteringseffekter, forårsaker alder eller leverflekker, flekker og fregner [3,4]. For tiden brukes naturlige forbindelser som kojinsyre, hydrokinon, arbutin og askorbinsyre, som er kjent som melaninsyntesehemmere, som tilsetningsstoffer til hudblekemidler. Imidlertid har disse ingrediensene ikke bare dårlig penetrasjon i huden, men forårsaker også cytotoksisitet og betennelse ved langvarig administrering [5]. I denne forbindelse er det nødvendig å utvikle et ikke-irriterende og effektivt blekemiddel for å behandle hyperpigmentering av menneskelig hud, samt å studere naturressursmaterialer for dette.

Menneskelige hudceller genererer vanligvis melanin som en fotobeskyttelsesreaksjon. Melanogenese er en kompleks prosess som reguleres via en rekke signalveier, og alle signaler oppregulerer til slutt MITF. Ettersom aktivert MITF fremmer uttrykket av tyrosinase-genfamilien (tyrosinase og TRP),melanogenesebegynner for alvor [6]. Generelt er det første trinnet i melanogenese at tyrosinase katalyserer oksidasjonen av L-tyrosin til 3,4-dihydroksy-L-fenylalanin (L-DOPA), og deretter oksiderer L-DOPA til DOPA-kinon. Og så konverterer TRP-2 DOPA-krom til 5,6-dihydroksyindol-2-karboksylsyre (DHICA) eller 5,6-dihydroksyindol (DHI). Til slutt blir DHICA og DHI oksidert av TRP-1, noe som til slutt fører til melaninproduksjon [6].

IBMX og andre metylxantiner stimulerer melanogenese ved å hemme fosfodiesterase og dermed øke nivåene av cAMP [7]. cAMP aktivert av IBMX fosforylerer ekstracellulær signalregulert kinase (ERK) og fosfoinositid 3-kinaser/proteinkinase B (PI3K/Akt) signalveier og fører til slutt til aktivering av MITF i melanogeneseprosesser [7]. Derfor kan nedreguleringen av disse proteinene betraktes som en viktig faktor for anti-blekingseffekten.

Sorghum bicolor(S. bicolor), som tilhører familien Poaceae, regnes som en viktig avling i intropiske regioner, inkludert Afrika, Mellom-Amerika og tørre områder, og er den fjerde viktigste kornavlingen i verden etter hvete, ris og mais [8 ]. Nyere studier har vist at S. bicolor er gunstig for mennesker fordi den inneholder fytokjemikalier som fenolforbindelser, tanniner og antocyaniner [9]. Disse fytokjemikaliene har fått økt oppmerksomhet på grunn av deresantioksidant, anti-fedme, anti-diabetes og anti-inflammatoriske effekter [10–14]. Selv om det er forskjellige forskningsresultater, har studier på hudblekingseffekten av S. bicolor ennå ikke blitt utført. Derfor tok denne studien sikte på å undersøke antioksidantaktiviteten og anti-melanogene effekter avS. bicolorog for å undersøke deres effekter på IBMX-indusertmelanogenesei B16/F10 melanomceller.

2. Materialer og metoder

2.1. Kjemikalier

Folin-Ciocalteus reagens, L-DOPA, L-tyrosin, L-askorbinsyre, arbutin, akarbose, dimetylsulfoksid (DMSO), bovint serumalbumin, -glukosidase, sopptyrosinase, bovint serumalbumin,3-(4,{ {6}}dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) og IBMX ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). MITF (bsm-51339M) og tyrosinase (bs-0819R) ble kjøpt fra Bioss (Beijing, Kina). TRP-1 (sc-166857) og -actin (sc-69879) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Sekundære antistoffer (anti-kanin og anti-mus) ble oppnådd fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).

2.2. Prøveforberedelse

S. bicolor(20 g) ble ekstrahert med forskjellige etanolkonsentrasjoner (0, 20, 40, 60, 80 og 95 prosent; 1 L) ved 40 grader i 2 timer ved bruk av en tilbakeløpskjøler. Ekstraktene ble filtrert ved bruk av filterpapir (WhatmanInternational Limited, Kent, Storbritannia), og konsentrert ved bruk av en vakuumfordamper (N-1000; EYELA Co., Tokyo, Japan). Etter at ekstraktene var lyofilisert ved bruk av en vakuumfrysetørker (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea), ble de tørkede ekstraktene lagret ved -20 grad inntil de ble brukt.

2.3. In vitro antioksidantaktivitet

2.3.1. Totalt fenolinnhold (TPC)

Totalt fenolinnhold ble undersøkt basert på prinsippet om at Folin-Ciocalteus reagens ble redusert til et blått reaksjonsprodukt under alkaliske forhold. En prøve (1 mL) blandet med Folin-Ciocalteus reagens og 7 prosent natriumkarbonat. Blandingen ble aktivert i 2 timer, og deretter ble absorbansen målt ved 760 nm ved bruk av et spektrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan). TPC ble beregnet fra standardkurven for gallussyre og resultatene ble uttrykt som GAE g−1.

2.3.2. Radikal scavenging aktivitet

ABTS radikalkationløsning ble produsert ved å blande 2,45 mM kaliumpersulfat og 7 mMABTS med 10{{10}} mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 150 mM og tillate de skal reagere i 24 timer ved romtemperatur. ABTS-løsningen ble deretter fortynnet med destillert vann for å oppnå en absorbans på 0,700 ± 0,020 ved 734 nm. Prøven fikk reagere med 980 µL av ABTS-løsningen i 10 minutter ved 37 grader, og deretter ble absorbansen ved 734 nm målt ved bruk av et spektrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan). DPPH-radikalløsning ble fremstilt av oppløsning av 0,1 mM DPPH i 80 prosent metanol. DPPH-løsningen ble fortynnet til en absorbans på 1,000 ± 0,020 ved 517 nm. 50 µL av prøven ble blandet med 1,45 mL av DPPH-løsningen og reagerte i 30 minutter i mørket. Etter reaksjon ble blandingen bestemt ved 517 nm.

2.3.3. Hemmende effekt på lipidperoksidasjon

For å måle den hemmende effekten på lipidperoksidasjon i hjernevev, ble metoden med tiobarbitursyre (TBA)-reaktivt stoff brukt. Hjernevev ble homogenisert i 20 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,4) og sentrifugert ved 6000 x g i 20 minutter. Supernatanten ble tilsatt til 0,1 mM L-askorbinsyre og 10 uM jern(II)sulfat 37 grader i 1 times inkubering. Deretter ble 30 prosent trikloreddiksyre og 1 prosent TBA tilsatt til blandingen, som deretter ble inkubert i et vannbad ved 80 grader i 20 minutter. Deretter ble TBA-MDA-komplekset målt ved hjelp av et spektrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) ved 532 nm.

2.4. Tyrosinaseinhiberende effekt

Den tyrosinaseinhiberende effekten ble bestemt ved å bruke L-tyrosin som et substrat. En prøve ble tilsatt til en 96-brønnplate og blandet med 0.1 M natriumfosfatbuffer, tyrosinase og 0.1 mML-tyrosinsubstrat for å reagere ved 37 grader. Etter inkubering ble enzymaktiviteten målt ved å bruke en mikroplateleser (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) ved 490 nm. L-DOPA ble også brukt som et substrat for å måle tyrosinaseinhiberende aktivitet. 67 mM natriumfosfatbuffer, tyrosinase og 10 mML-DOPA-substrat ble tilsatt til prøven for å reagere ved 37 grader i 10 minutter. Tyrosinaseaktivitet ble målt ved 415 nm.

Cistanche hemmer melanindannelsen

2.5. -Glukosidasehemmende effekt

Den -glukosidasehemmende effekten ble målt ved å blande 0.1 M natriumfosfatbuffer og -glukosidase ved 37 grader i 10 min. Etter aktivering ble blandingen tilsatt 5 mM 4-nitrofenyl- -D-glukopyranosid i buffer ved 37 grader i 5 minutter, og deretter ble absorbansen målt til 405 nm ved bruk av en mikroplateleser (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA).

2.6. Cellelevedyktighetsanalyse

Cytotoksisiteten til prøven ble estimert ved å bruke en MTT-analyse. B16/F10 melanomceller ble dyrket med 1 × 104 celler/brønn i en 96-brønnplate i 24 timer. Deretter ble prøvene behandlet til konsentrasjoner på 1, 2, 5 og 10 µg/ml. Prøver ble behandlet i 48 timer, hvoretter cellene ble behandlet med 10 µg/ml MTT-stamløsning i 3 timer. Til slutt ble media fjernet, og DMSO ble tilsatt for å oppløse formazan. Mengden formazan ble kvantifisert ved bruk av en mikroplate-leser (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) ved 570 nm (eksitasjonsbølgelengde) og 655 nm (emisjonsbølgelengde).

2.7. Måling av cellulært melanininnhold

For å måle mengden melanin ble B16/F10 melanomceller dyrket i en 24-brønnplate med en tetthet på 4×104 celler/brønn over i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet med 100 mM IBMX og ESB eller positiv kontroll (arbutin) i ytterligere 48 timer. Etter behandling ble cellene vasket og høstet ved bruk av fosfatbuffer saltvann (PBS). De høstede cellene ble deretter sentrifugert ved 16, 000 x g i 10 minutter, og den oppnådde pelleten ble oppløst med 1 N natriumhydroksid inneholdende 10 prosent DMSO ved 90 grader i 20 minutter. Melanininnholdet ble målt ved 490 nm ved bruk av en mikroplateleser (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA).

2.8. Western blot-analyse

Forbehandlede B16/F10 melanomceller ble vasket med PBS og lysert ved bruk av RIPA-buffer som inneholdt 1 prosent proteasehemmere på is. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bradford-proteinanalyse, og de like proteiner ble denaturert med en Laemmli-buffer i 10 minutter ved 95 grader. De denaturerte proteinene ble separert med 10 prosent natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og ble deretter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Deretter ble membraner blokkert med 5 prosent skummet melk i Tris-bufret saltvann med 0,1 prosent Tween20 (TBST) i 1 time, og deretter reagert med primære antistoffer over natten ved 4 grader. Membranene ble reagert med de sekundære antistoffene i 1 time og immunkompleksene ble visualisert ved bruk av forbedret kjemiluminescensreagens (Bionote, Hwaseong, Korea). Båndbildene ble oppdaget og analysert av Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

2.9. UPLC-IMS-QTOF/MS2 Analyse

Hovedforbindelsene i de 60 prosent etanoliske ekstraktene avS. bicolorble analysert med UPLC-IMS QTOF/MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, USA). Kromatografisk separasjon ble utført ved bruk av en Acquity UPLC BEH C18-kolonne (2,1 × 10{{10}} mm, 1,7 µm partikkelstørrelse; Waters Corp.) ved en strømningshastighet på 0,35 ml/min. De mobile fasene besto av løsemiddel A (0,1 prosent maursyre i destillert vann) og B (acetonitril), og analysebetingelsene inkluderte følgende tidsgradient: 1 prosent B etter 0–1 min, 1–100 prosent B etter 1–7 minutter, 100 prosent B etter 7–8 minutter, 100–1 prosent B etter 8–8,2 minutter, 1 prosent B etter 8,2–10 minutter. Massespektrometri ble utført i negativ modus for elektrosprayionisering (ESI) under følgende forhold: kildetemperatur, 100 ◦C; desolvasjonslinjetemperatur, 400 ◦C; rampekollisjonsenergi, 10–30 V; kapillærspenning, 2,5 kV. Fenoliske forbindelser ble oppdaget ved en full skanning fra m/z 50 til 1500.

2.10. Statistisk analyse

Alle resultater ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Den statistiske forskjellen mellom grupper ble bestemt ved en enveis variansanalyse (ANOVA) ved bruk av Duncans nye multiple range-test (p < 0.05)="" med="" sas-programvareversjon="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" usa)="" .og="" det="" innbyrdes="" forholdet="">antioksidanteffekter (ABTS/DPPH radikalfjernende aktivitet og MDA-hemmende effekt) og den hemmende effekten avmelanogenese-mediert enzymer (tyrosinase og -glukosidase) ble evaluert Pearson korrelasjonsanalyse.

3. Resultater

3.1. Totalt fenolinnhold

For å sammenligneantioksidantaktiviteten til hvert etanolisk ekstrakt fraS. bicolor, ble TPC undersøkt. Som vist i figur 1 var TPC forskjellige blant de etanoliske ekstraktene; 60 prosent etanolekstrakt (150,08 ± 1,13 mg GAE/g) var signifikant høyere enn de andre ekstraksjonene (0 prosent ; 70,83 ± 1,18, 20 prosent ; 100,42 ± 0,72, 40 prosent 114,67 ± 1,46, 80 prosent, 118,33 ± 3,17 og 95 prosent, 73,67 ± 1,46 mg GAE/g). Derfor ble det 60 prosent etanoliske ekstraktet brukt til videre eksperimentelle analyser.

3.2. Radikal scavenging aktivitet

Deantioksidantaktiviteten til det 60 prosent etanoliske ekstraktet fraS. bicolor(ESB) ble målt ved bruk av ABTS/DPPH-analysen og MDA-analysen, og resultatene ble vist i figur 2. ABTS-radikalfjernende aktiviteten til ESB ble utvist ved 97,98 prosent ved 1000 ug/ml konsentrasjon, og vitamin C (99,82 prosent). , som brukes som positiv kontroll og også hadde lignende radikalfjernende aktivitet ved samme konsentrasjon (figur 2A). Og ESB viste en 50 prosent hemmingseffekt (IC50-verdi) av ABTS-radikalet ved 409,71 ug/ml konsentrasjon. Som vist i figur 2B ble DPPH-radikalfangende aktiviteten til ESB vist 79,44 prosent ved 1000 ug/mL konsentrasjon, og IC50-verdien ble indikert til 612,53 ug/mL. Den hemmende effekten av MDA-produksjon av ESB viste en hemmende effekt på 89,54 prosent ved 50 ug/mL konsentrasjon og viste en høyere hemmende effekt enn katekinet (71,03 prosent), som er den positive kontrollen, ved samme konsentrasjon (Figur 2C). I tillegg ble IC50-verdien til MDA observert ved 16,56 ug/ml konsentrasjoner av ESB.

3.3. Hemmende effekt av melanogenese-medierte enzymer

Den hemmende effekten avmelanogenese-medierte enzymer ble evaluert ved bruk av tyrosinase og -glukosidase (figur 3). For å måle den hemmende aktiviteten til tyrosinase mot melaninsyntese ble det utført eksperimenter med L-tyrosin og L-DOPA som et substrat under cellefrie forhold. Som et resultat var IC50-verdien 89,25 µg/mL når L -tyrosin ble brukt som et substrat (Figur 3A), men L-DOPA kunne ikke at mer enn 5 0 prosent av den hemmende effekten ble observert (Figur 3B). På dette tidspunktet var IC50-verdien for den positive kontrollen (arbutin) for L-tyrosin 74,35 µg/ml, som var høyere enn ESB. ESB ble funnet å ha en bedre hemmende effekt på tyrosinase ved bruk av L-tyrosin enn ved bruk av L-DOPA som substrat. Derfor, basert på resultatene av analysen ved bruk av to substrater, anses den tyrosinaseinhiberende effekten av ESB å være relatert til oksidasjonen av L-tyrosin til L-DOPA i stedet for oksidasjonen av L-DOPA til DOPA kinon i melanogenese. Tyrosinaseinhiberende effekt ved bruk av L-DOPA som substrat og radikalfjernende aktivitet (ABTS; 0.943, p < 0.05,="" dpph;="" 0.952,="" p="">< 0.05)="" indikerte="" de="" positive="" sterke="" korrelasjonene="" i="" tabell="">

For å måle den hemmende effekten avmelanogenese-mediert enzym, ble den hemmende aktiviteten mot -glukosidase av ESB målt. Som vist i figur 3C, hemmet ESB -glukosidase med 33,72 prosent ved 200 µg/ml konsentrasjon. Og IC50 for ESB var 46,29 µg/ml, som er omtrent fem ganger høyere enn akarbose (216,05 µg/ml). Disse resultatene indikerer at ESB har bedre -glukosidasehemmende aktivitet enn akarbose som en positiv kontroll. Og -glukosidasehemmende effekt avslørte sterke positive korrelasjoner med MDA-hemmende effekt (0,966, p < 0,05)="" i="" tabell="">

3.4. Cellelevedyktighet og cellulær melaninsyntese

For å bekrefte cytotoksisiteten til ESB ble B16/F10 melanomceller behandlet med ESB i 24 timer ved 1, 2, 5, 10 og 20 µg/ml konsentrasjoner. Resultatene viste at ESB ikke påvirket cellelevedyktighet ved de angitte konsentrasjonene sammenlignet med kontrollen (figur 4A). Derfor ble eksperimenter utført ved å velge konsentrasjoner på 2, 5 og 10 µg/ml. Deretter ble B16/F10 melanomceller behandlet med IBMX for å analysere effekten av ESB på melaninproduksjonen. Som vist i figur 4B, økte nivået av melanininnhold til 316,85 prosent når det ble behandlet med IBMX. På den annen side viste den ESB-behandlede gruppen (108,60 prosent) ved 10 µg/ml konsentrasjon signifikant redusert melanininnhold sammenlignet med den IBMX-behandlede gruppen, og lignende melanininnhold sammenlignet med arbutingruppen (101,79 prosent) som en positiv kontroll.

3.5. Melanogenesevei i B16/F10 melanomceller

Melanogeneseer en viktig prosess for å beskytte menneskelig hud mot ytre stimuli, og denne prosessen reguleres av ulike mekanismer. I denne studien målte vi ekspresjonsnivået til melanogenese-regulerende molekyler for å bekrefte den potensielle hemmende mekanismen til ESB på IBMX-indusert melaninproduksjon i B16/F10 melanomceller (figur 5). Resultatene viste at ESB effektivt reduserte IBMX-indusert MITF-ekspresjon (figur 5A, B). Dermed ble uttrykket av tyrosinase (Figur 5A, C) og TRP -1 (Figur 5A, D) nedregulert av redusert MITF med ESB-behandling. Som et resultat nedregulerte ESB-behandling uttrykket av beslektede proteiner i IBMX-induserte melanogenesisin B16/F10 melanomceller.

3.6. UPLC-IMS-QTOF/MS2 Analyse

En profil av hovedforbindelsene til ESB ble skannet med LC/MS i et område på m/z 50–1500, og basetoppkromatogrammene er vist i figur 6. Ytterligere identifikasjon og karakterisering av forbindelsene ble utført i sammenligning med litteraturdata ved å bruke MS2fragmenteringsdata (tabell 2). Basert på fragmentene i tidligere litteratur var topp 2 1-O-caffeoylglycerol(m/z 253.07, 179.03, 161.02 og 135.04) [15]; topp 3, dicaffeoylglycerides (m/z 415,10, 253,07, 179,03 og 135,04) [16]; topp 4, 1,3-O-dikaffeoylglycerol (m/z 415,10, 253,07, 179,03, 161,02 og 135,04) [16]; topp 5, p-kumaroyl-kaffeoylglycerol (m/z . og 135,04) [17]; topp 6,feruloyl-kaffeoylglycerol (m/z 429,12, 253,07, 193,05, 161,02 og 134,03) [18]; topp 7, tricin (m/z 329,23, 314,04, 299,01 og 271,02) [19]; og topp 9, henholdsvis 9-hydroksyoktadekadiensyre (9-HODE) (m/z 295.22, 277.21 og 171.10) [20]. Blant dem ble 1,3-O-dicaffeoylglycerol (Figur 6B), tricin (Figur 6C) og 9-HODE (Figur 6D) identifisert som hovedforbindelser.

effekter av cistanche:antioksidasjon

4. Diskusjon

Melanogeneseer rapportert å være forårsaket av økt oksidativt stress fra ytre stimuli. Oksidativt stress forårsaker oksidasjon av DNA og proteiner, lipidperoksidasjon og økte umettede fettsyrer. Dette stresset fører også til en unødvendig økning av melaninsyntesen i melanocytter på huden. Dermed kan overdreven melanin generert forårsake pigmentering, og det kan føre til hudkreft. IBMX stimulerer melanogenese ved å hemme fosfodiesterase og derved øke nivåene av cAMP [7]. Når nivået av cAMP i cellene øker, forårsaker det aktivering av ERK og PI3K/Akt signalveier som fremmer dannelsen av proteiner assosiert med melanogenese. Derfor undersøkte vi blekingseffekten av ESB på IBMX-indusert melanogenese i B16/F10 melanomceller.

Fenoliske forbindelser som sekundære metabolitter av planter har egenskapen til å bli stabilisert av en resonansstruktur når de reagerer med radikaler [21]. Fenolforbindelser fungerer også som viktige faktorer for antioksidantaktiviteten, slik som ABTS/DPPH radikalfjernende aktivitet, og virker som hemmere av pigmentdannelse fordi de har en kjemisk struktur som L-tyrosin [22,23]. En ABTS/DPPH-analyse er den vanligste og enkleste metoden for å estimere in vitroantioksidantaktivitet. I denne studien har ESB vist en høy TPC (Figur 1) og ABTS/DPPH radikalfjernende aktivitet (Figur 2A, B). Spesielt ESB var høyere i ABTS-radikalfjerningsaktiviteten enn DPPHradikalfjerningsaktiviteten. DPPH-analysen brukes til å måle den radikalfjernende aktiviteten til hydrofobe forbindelser, mens ABTS-analysen gjør det mulig å måle radikalfjerningsaktiviteten mot hydrofobe så vel som hydrofile forbindelser [24]. Derfor ble det bekreftet at den radikalfjernende aktiviteten til ESB ble mer påvirket av den hydrofile forbindelsen.

UV-stråling forårsaker ROS-produksjon og har direkte og indirekte effekter på huden. Spesielt induserer ROS lipidperoksidasjon ved å angripe umettede fettsyrer, som er komponenter i cellemembraner [2]. Akkumulering av lipidperoksider fører til ødeleggelse av antioksidantsystemet i huden, forårsaker pigmentering, betennelse og aldring [25]. I denne studien viste ESB en utmerket hemming av lipidperoksidasjon (figur 2C). Fenolforbindelsene inneholdt i naturlige planter ble rapportert å være assosiert med radikalrensende aktivitet [26]. Også Maresca et al. [27] rapporterte at fjerning av ROS med antioksidanter er effektiv for å hemme melaninbiosyntesen. En fersk studie rapporterte at etylacetat- og aglykonfraksjonene av Dendropanax morbifera-bladet kan fungere som hudcellebeskyttende midler og naturlige antioksidanter ved å beskytte HaCaT-celler mot oksidativt stress [28]. Dessuten viste behandling med de samme fraksjonene en bedre anti-melanogen effekt enn arbutin, brukt som en positiv kontroll, mot -MSH-indusert overdreven melaningenerering i B16/F10 melanomceller [28].

Flere mekanismer er forbundet medmelanogenese, og det felles målet for hudblekemidler er reguleringen av tyrosinase, som er et viktig enzym i melanogenese. Tyrosinase, et kobberholdig enzym, katalyserer to reaksjoner i denne veien: hydroksyleringen av L-tyrosin til L-DOPA og oksidasjonen av L-DOPA til DOPA kinon [6]. Ved eksponering for store mengder UV ellerROS økes aktiviteten til tyrosinase og melaninsyntesen økes også. Derfor viste resultatene av å måle den hemmende effekten av tyrosinase i forhold til melaninsyntese at ESB ble funnet å ha en bedre hemmende effekt på tyrosinase ved bruk av L-tyrosin enn å bruke L-DOPA som et substrat (Figur 3A,B). En fersk studie rapporterte sammenhengen mellom TPC og tyrosinaseinhibering fordi fenoliske forbindelser har en kjemisk struktur som ligner på L-tyrosin, et substrat for tyrosinase. I følge Choi et al. [29] ble det observert at effektiviteten til frie radikaler-fjernende aktivitet og tyrosinaseinhiberende effekt økte proporsjonalt med gjæringstiden til Cheonggukjang, noe som skyldtes at mengden TPC økte med gjæringstiden. Im & Lee [30] observerte at etylacetatfraksjonen av 75 prosent etanolekstrakt fra Taraxacum core num hadde rikelig TPC og antioksidantaktivitet, og den tyrosinaseinhiberende effekten var overlegen andre fraksjoner (heksan, kloroform, butanol og vandig).

Tyrosinase, et av glykoproteinene, glykosyleres når polypeptidkjeder translokerer til det endoplasmatiske retikulum. Ulike enzymer er involvert i denne prosessen, og blant dem kan hemming av -glukosidase hemme foldingen av tyrosinase for å danne en inaktiv struktur uten kobber. Som et resultat kan tyrosinase ikke transporteres til melanosomet og hemmer melaninproduksjonen. Polyfenolen som er tilstede. i planter er ikke bare i stand til å redusere oksidativt stress, men også hemmer karbohydrathydrolyserende enzymer som -glukosidase ved å binde seg til proteiner [31]. En tidligere studie indikerte at B16/F10 melanomceller i nærvær av glykosyleringshemmere resulterer i reduksjon av melanogenese ved å redusere det totale innholdet av tyrosinase [32]. Og Choi et al. [33] rapporterte at deoksynojirimycin, en av -glukosidase-hemmere, blokkerte glykosylering av tyrosinase og hemmet tyrosinase-migrering til melanosomer. Ando et al. [34] har vist at det er mulig å hemme melaninsyntesen i melanomceller ved å kontrollere glykosyleringen av tyrosinase av -glukosidasehemmere som glutation, ferritin og geldanamycin. Kim et al. [35] rapporterte de gode korrelasjonene for bipollen som en naturligantioksidantmellom TPC og tyrosinaseinhiberende effekt ({{0}}.973,p < 0.05),="" og="" også="" tpc="" ga="" den="" positive="" korrelasjonen="" med="" dpph="" radikalfjernende="" aktivitet="" (0,897,="" p="">< 0,05).="" og="" resultatene="" tyder="" på="" at="" polyfenoler="" som="" naturlige="" antioksidanter="" kan="" være="" potensielt="" effektive="" for="" hudbleking="" basert="" på="" deres="" utmerkede="" antioksidantaktivitet.="" i="" vår="" studie="" ble="" antioksidanteffekten="" av="" esb="" i="" prosessen="" med="" å="" hemme="" virkningen="" av="" tyrosinase="" indikert="" å="" være="" sterkt="" korrelert="" gjennom="" hemming="" av="" oksidasjonen="" av="" l-dopa="" til="" dopa="" kinon="" og="" glykosyleringen="" av="" tyrosinase="" (tabell="" 1).="" av="" denne="" grunn="" er="" antioksidanten="" effekten="" av="" esb="" har="" en="" effekt="" på="" hudens="" blekende="" effekt="" ved="" å="" påvirke="" hemningen="">melanogenese-medierte enzymer.

naturlig antioksidant: cistanche tubulosa

PKA-signalveien er hovedprosessen involvert i melanogenese, og denne aktiveres av IBMX, som er et cAMP-løftende middel. PKA-signalveien kan regulere transkripsjonsfaktorer som MITF og cAMP-responsivt elementbindende protein, som er involvert i ekspresjonen avmelanogeneseregulatorer som tyrosinase, TRP-1 og TRP-2. Følgelig øker IBMX-behandling uttrykket av MITF og tyrosinase-genfamilien (tyrosinase og TRP-1) gjennomcAMP-aktivering [7]. Park et al. [36] viste at mengden melaninsyntese fra PapenfusiellaCuomo etanolisk ekstrakt (65,17 ± 13,40 prosent) ved en konsentrasjon på 40 µg/mL var lik kojinsyre (72,30 ± 3,92 prosent) som en positiv kontroll, og rapporterte at den viste potensial som et naturlig blekemateriale. I denne studien viste ESB en effektiv hemmende effekt på melaninsyntesen som ligner på den positive kontrollen ved lave konsentrasjoner (Figur 4). Etter det, for å vurdere den detaljerte anti-melanogene effekten av ESB, ble western blot-analyse utført på melanogenese-mediert protein ved bruk av B16/F10-melanomceller.

Akt, som er involvert i ulike mekanismer, spiller en nøkkelrolle i flere cellulære prosesser som apoptose, glukose og hudmetabolisme. Spesielt reduserer økningen av cAMP ved IBMX-behandling Akt-fosforylering og dens aktivering. Inaktivert Akt induserer også aktiveringen av GSK-3, noe som betyr at fosforylering ikke oppnås, det vil si at nivået av p-GSK-3 reduseres [7]. I følge tidligere litteratur nedgraderer luftdelen av Pueraria thunbergia MITF ved å aktivere Akt/GSK-3-signalveien i B16/F10 melanomceller [37]. Også Huang et al. [38] viste at [6]-skole fremmet p-Akt-ekspresjon og hemmet melanogenesesignalering i B16/F10-melanomceller. Aktivert GSK-3 oppregulerer tyrosinase-genfamilien ved å fosforylere Ser289 av MITF, og fremmer følgelig melanogenese. MITF er en viktig transkripsjonsfaktor som binder seg til en tyrosinasegenpromoter, og den øker deretter ekspresjonen av enzymer relatert til melanocyttproliferasjon ogmelanogenese[7]. Når uttrykket av tyrosinase fremmes av MITF, fører det deretter til en økning i nivåene av TRP-1 og TRP-2, og som et resultat produserer disse melanogene enzymene melanin [6]. Oksidativt stress forårsaket av UV-lys stimulerer melaninpigmentering i huden. Derfor er den rensende aktiviteten til radikaler eller ROS effektiv for å undertrykke melaninproduksjonen, og polyfenoler med antioksidantaktivitet kan ha utmerket blekingseffekt [38]. Choi et al. [39] viste at koreanske bambusstengler (Phyllostachys nigra varietet henosis) nedregulerte PKA/CREB-mediert MITF via fjerning av ABTS/DPPH-radikaler. Og et 70 prosent etanolisk ekstrakt av Nelumbo nucifera G. Leaf hemmet uttrykket av MITF, tyrosinase og TRP med antioksidantaktiviteter som elektrondonasjonsevne og hemming av xanthinoksidase [40]. I dette eksperimentet ble det vist at ESB-behandling reduserte uttrykket av MITF- og tyrosinase-genfamilien (tyrosinase og TRP-1), som fremmer oksidasjonen av DHICA til DHI i melanogenese-veien (Figur 5). Basert på disse resultatene har ESB vist seg å nedregulere IBMX-mediert melanogenese basert på dens overlegneantioksidanteffekter.

Basert på tidligere litteratur, ble de viktigste fenolforbindelsene i ESB identifisert som1,3-O-di-kaffeoylglyserol (Figur 6B), tricin (Figur 6C) og 9-HODE (Figur 6D) [16 ,19,20]. Blant dem er 9-HODE, som er den vanligste forbindelsen i ESB, en av metabolittene til linolsyre og viser en blekende effekt på irritert hud ved å hemme tyrosinase [41]. I motsetning til andre alifatiske forbindelser er 9-HODE også rapportert å være stabil i alle oksidasjonseksperimenter og å ha en blekende effekt på ROS-skader [41]. I mellomtiden tricin (5,7-dihydroksy- 2-(4-hydroksy-3,5-di-metoksyfenyl)-4H-kromen{{24 }}one) har lenge vært anerkjent for sine gunstige helseeffekter, som antioksidanter, antivirale og antitumor/antikreftaktiviteter [42–44]. Mu et al. [45] rapporterte at tricin viste en bedre hemmende effekt på tyrosinaseaktivitet sammenlignet med arbutin som en positiv kontroll. Dessuten har Meng et al. [46] rapporterte at tricin isolert fra metanolekstraktet av unggrønn bygg (Hordeum vulgare L.) hemmet melaninbiosyntese og tyrosinaseaktivitet i B16/F10melanomceller gjennom hydroksylgruppen i C-4'-posisjonen og metoksygrupper ved C-3',5'posisjoner av tricinskjelettet. Fenylpropanoider som 1-O-caffeoylglycerol, dicaffeoylglycerides og 1,3-O-dicaffeoylglycerol er organiske forbindelser som syntetiseres av planter fra fenylalanin og tyrosin. Fenylpropanoid og deres glykosylerte former ble rapportert å være potente antioksidanter, enten ved å fjerne ROS direkte eller ved å virke som kjedebrytende peroksylradikalfjernere [47].

p-kumarsyre, som har en kjemisk struktur som ligner på L-tyrosin, konkurrerer med L-tyrosin om aktive steder på tyrosinase [48]. Det er kjent som en sterk tyrosinasehemmer, og det ble rapportert at dens anti-melanogenese-effekt er sterkere enn strukturelt lignende forbindelser som kanelsyre [48]. I tillegg har An et al. [48] ​​rapporterte at p-kumarsyre, en bestanddel av Sasa quelpaertensis Nakai, hemmet tyrosinaseaktivitet ved å bruke L-DOPA som et substrat, og reduserte melaninproduksjonen i B16/F10 melanomceller. Derfor kan ESB anses å ha en utmerket blekende effekt gjennom p-kumarsyre. Videre viste MS-spektrene til 1-O-caffeoylglycerol og 1-3-O-dicaffeoylglycerol lignende fragmenteringsmønstre ved m/z 179, 161 og 135, og disse fragmentene ble rapportert som koffeinsyrerester. De har et UV-spektrum som ligner på et koffeinsyrederivat med en λmax ved omtrent 326 nm, og anses derfor for å være et koffeinsyrederivat [48]. Det ble rapportert at koffeinsyre, et derivat av forskjellige forbindelser, er en potent antioksidant in vitro/in vivo, og reduserer styrosinaseaktivitet ogmelanogenesei B16/F10 melanomceller. Følgelig kan den anti-melanogene effekten av ESB anses å skyldesantioksidanterog hudblekende stoffer som alifatiske og fenoliske forbindelser.

effekter av cistanche: antioksidasjon

5. Konklusjoner

For å vurdere muligheten som hudblekingsmiddel avSorghum bicolor, antioksidant og anti-melanogene effekter av ESB på IBMX-indusert melanogenese ble evaluert i B16/F10 melanomceller. ESB viste betydeligantioksidantaktiviteter i ABTS/DPPH radikal rensende aktivitet og MDA-hemmende effekt. ESB forhindret det første trinnet avmelanogeneseved å hemme -glukosidase og tyrosinase ved å bruke L-tyrosin og L-DOPA som substrater. De anti-melanogene effektene av ESB på IBMX-indusertmelanogeneseble evaluert i B16/F10 melanomceller, og resultatene viste at ESB hemmet IBMX-indusert melanomceller i B16/F10 melanomceller. Melaninakkumulering ble hemmet ved nedregulering av uttrykket av MITF og tyrosinase-genfamilien (tyrosinase og TRP-1) i IBMX-indusert melanogenese. Hovedforbindelsene av ESB ble analysert som 1,3-O-di-kaffeoylglyserol, tricin og 9-HODE. Følgelig viste ESB in vitroantioksidantaktivitet og en anti-melanogen effekt i B16/F10 melanomceller, og kan derfor brukes som et hudblekemiddel i kosmetikkmarkedet.

antioksidasjoncistanche tabletter