The High Content Of Ent-11 -hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic Acid in Adenostemma Lavenia (L.) O. Kuntze Leaf Extract: With Preliminary in Vivo Assay

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Akie Hamamoto, Ryosuke Isogai, Miwa Maeda, Masumi Hayazaki, Eito Horiyama, Shigeo Takashima, Mamoru Koketsu og Hiroshi Takemori *

Abstrakt:Bakgrunn: Ent-11 -hydroxy-15-oxo-Kaur-16-en-19-oic acid(11 OH-KA) er et multifunksjonelt biokjemikalium som finnes i noen bregner, Pteris semipinnata, og dens medfødte arter. Selv om en rekke terapeutiske anvendelser av 11 OH-KA har blitt foreslått (f.eks. anti-kreft, anti-inflammasjon ogbleking av huden), innholdet av 11 OH-KA i disse bregnene er ikke høyt. Adenostemma lavenia (L.)O. Kuntze, en Asteraceae, har også blitt rapportert å inneholde 11 OH-KA. Avkok (varmt vannekstrakt) av hele planter av A. Lavenia brukes som et folkemedisin for inflammatoriske lidelser, som ashepatitt og lungebetennelse, noe som tyder på at 11 OH-KA kan være ingrediensen som er ansvarlig for de medisinske egenskapene til denne planten. Metoder: De anti-melanogene aktivitetene til vannekstraktene av A. Lavenia leave og Pteris dispar Kunze (en beslektet av P. semipinnata) blader ble sammenlignet i museB16F10 melanomceller. Mengden11 OH-KAble målt ved bruk av væskekromatografispektrometri. C57BL/6J-mus ble behandlet med vannekstrakt av A. Lavenia-blad, og blodkonsentrasjonen av 11 OH-KA ble målt. In vivo-effektiviteten til vannekstraktet av A. Lavenialeaf ble evaluert i henhold til dets anti-melanogene aktivitet ved å overvåke hårfarge. Resultater:Selv om begge ekstraktene (A. Lavenia og P. dispar Kunze) viste høye anti-melanogene aktiviteter, inneholdt bare A. Lavenia en høy mengde 11 OH-KA, omtrent 2,5 prosent av vekten av tørre blader.11 OH-KA kan renses fra A. Lavenia-blader i to trinn: vannekstraksjon etterfulgt av kloroformfordeling. Behandlingen av mus med vannekstrakt av A. Lavenia blad undertrykker pigmentering i håret. Konklusjoner: Til tross for det lille antallet mus som ble undersøkt, tyder det nåværende foreløpige resultatet av den undertrykte hårpigmenteringen at vannekstraktet av A. Lavenia-blad og ingrediensen som muligens er ansvarlig for dette – 11 OH-KA – er nye materialer for oral kosmetikk. resultater kan også være nyttige i den fremtidige utviklingen av funksjonell mat og metoder for å behandle pasienter som lider av hyperpigmenteringsforstyrrelser, som melasma.

Nøkkelord: 11 -hydroksy-15-okso-kaur-16-en-19-oic acid; anti-melanogenese; bleking av huden;funksjonell mat; medisinsk plante; Adenostemma Lavenia; Pteris dispar Kunze;tyrosinase; B16F10 melanom

Cistanche hemmer tyrosinaseaktivitet

1. Introduksjon

Studier av anti-melanogene reagenser forbleking av hudenog anti-aldring har blitt hyppigere, spesielt for ingredienser i matvarer (frukt, grønnsaker og medisinske urter) [1]. En rekke polyfenoler og terpener og deres kilder er utviklet og kommersialisert som funksjonelle matvarer og kosttilskudd.

Diterpen/kaurene ent-11 -hydroksy-15-oxo-kaur-16-en-19-olsyre (11 OH-KA), funnet i bladene til bregner (Pteris semipinnata [2– 5], Pteris livida [6]) og Compositae (Gochnatia decora [7]), er også en attraktiv kandidat for anti-melanogene reagenser [5]. Til tross for dens brede fysiologiske aktiviteter (f.eks. anti-kreft og anti-inflammasjon) [8–11], er det bare noen få registreringer om in vivo-effekten av11 OH-KA, inkludert dets anti-melanogene potensial, sannsynligvis på grunn av dets sjeldenhet og begrenset antall kilder.

Studier av struktur-aktivitetsforhold, både in vitro og i dyrkede celler, har identifisert deler i 11 OH-KA som er viktige for å utøve sine funksjonelle aktiviteter (figur 1). Utskifting av karboksygruppen på 19. plass i11 OH-KAmed metyl- eller hydroksygrupper omdanner denne forbindelsen til en forbindelse med høy anti-kreftaktivitet, noe som indikerer at 19-karboksylgruppen svekker den cellulære toksisiteten til denne forbindelsen [5,10,12]. Derimot forbedrer alkengruppen i 16. posisjon, ketongruppen i 15. posisjon og hydroksygruppen i 11 posisjon de apoptotiske aktivitetene ved å aktivere Caspase-signalveien [10,12]. Imidlertid er disse delene ikke uunnværlige for celledødssignalene til kaurenes. De strukturelle kravene for anti-inflammatorisk aktivitet er lik de for anti-kreftaktivitet, noe som tyder på krysstale via vanlige cellulære mål, for eksempel nukleær faktor kappa B (NF-κB) [12].

Tyrosinaseer et hastighetsbegrensende enzym i melaninsyntese [13,14]. Enzymet katalyserer sekvensielle reaksjoner: omdannelsen av tyrosin til l-3,4-dihydroksyfenylalanin, l-Dopa og deretter til dopakinon. Vi har rapportert at 11 OH-KA hemmer ekspresjonen av tyrosinasegenet, som resulterer i undertrykkelse avmelanogenesei B16F10 musemelanomceller [5]. Delene til 11 -hydroksy,15-oxo og 16-en i 11 OH-KA er uunnværlige foranti-melanogeneseaktivitet, som er forskjellig karakteristisk for de strukturelle kravene til 11 OH-KA sammenlignet med andre aktiviteter, slik som anti-kreft eller anti-inflammatoriske aktiviteter.

Når det gjelder dens anti-melanogene aktivitet, er 11 OH-KA derfor en unik forbindelse blant kaurenes. Dessverre, Pteris dispar Kunze, vår tidligere kilde til11 OH-KA, inneholdt bare en liten mengde av denne forbindelsen [5], og denne bregnen, så vel som P. semipinnata (en beslektet) [4,15], har ingen oversikt over bruk hos mennesker. I alle tidligere eksperimenter ble dessuten organiske løsningsmidler (metyl eller etylalkohol, kloroform eller heksan) brukt for å ekstrahere 11 OH-KA, uten noen registreringer av bruken av vandig ekstraksjon.

For nesten 40 år siden oppdaget en amerikansk gruppe 11 OH-KA og dets derivater i AdenostemmaLavenia (L.) O. Kuntze (en Asteraceae) [16]. Selv om A. Lavenia ikke har blitt studert tilstrekkelig med hensyn til risikoen for mulige forurensninger (f.eks. uorganiske forurensninger [17] og sekundære metabolitter produsert av sopp [18,19]) i blader og andre deler, selges helplantepulver (kalt Ma Zhi Hu) i USA under tillatelse fra leger (produktene kan fås fra QualiHerb, Cerritos, CA, USA: Supplementary Materials Figure S1). Derfor, i denne studien, ved å måle11 OH-KAVi undersøkte potensialet til et vannekstrakt av A. Lavenia-blad for bruk i indre kosmetikk, samt en ny kategori funksjonelle matvarer [20–22] som kan brukes til å behandle og evaluere effekten av dens anti-melanogene aktiviteter. pasienter som lider av hyperpigmenteringsforstyrrelser som melasma. Til dags dato har bare tranexamsyre (et hemostatisk medikament) vært tilgjengelig som et internt legemiddel for hyperpigmenteringsforstyrrelser [23,24].

Vi rapporterer her at A. Lavenia-blader inneholder 11 OH-KA ved høye nivåer (omtrent 2,5 prosent av tørrvekten av blader). Vannekstraktet av A. Lavenia-bladet undertrykker effektivtmelanogeneseinB16F10-celler, og11 OH-KAkan være ansvarlig for 50 prosent av de anti-melanogene aktivitetene til vannekstrakten. Oral behandling av mus med vannekstrakt av A. Lavenia-blad resulterer i undertrykkelse av hårpigmentering.

2. Materialer og metoder

2.1. Formering av A. lavenia

Siden A. lavenia er oppført som en truet art i de fleste områder av Japan, dyrket vi denne planten i et felt i nærheten av laboratoriet vårt. A. lavenia ble formert ved deling fra 10 frøplanter, og nesten 100 gof tørkede blader høstet fra juni til juli 2019 ble brukt i denne studien.

2.2. Rensing av 11 OH-KA fra vannekstrakter og dets analyse

Ren 11 -OH KA (autentisk) ble kjøpt fra BioBioPha (Shanghai, Kina). Tørket bladpulver (100 mg) oppnådd fra bladene til A. lavenia eller P. dispar Kunze ble bløtlagt i 1 mL destillert vann (for en 10-volumekstraksjon) i 12 timer, og restene ble fjernet ved sentrifugering ved 12, 000 rpm i 10 min. De resulterende ekstraktene ble analysert ved høyytelses (HP) væskekromatografi (LC) ved bruk av en C18 ODS-kolonne (4,6 mm × 50 mm: RP-18 GP, Kanto Kagaku, Tokyo, Japan) med en gradient som varierer fra 40 prosent metanol/vann til 100 prosent metanol i løpet av 10 min. 11 -OHKA-deteksjonen ble utført ved å bestemme ultrafiolett (UV) absorpsjon ved 245 nm (A245). For 20-,30- og 50-volumekstraksjoner ble 50 mg, 33 mg og 20 mg tørket bladpulver ekstrahert med 1 ml destillert vann.

For å bekrefte strukturen til {{0}}OH KA i A. lavenia, ble kaurensyre renset i semi-stor skala. Totalt 100 g tørkede A. lavenia-blader ble ekstrahert to ganger fra 20 volumer vann, et ekvivalent volum CHCl3 ble tilsatt til vannekstraktet av bladene, og 11 -OH KA ble gjenvunnet fra CHCl3-fasen. Under fordampningen av den gjenvunnede CHCl3-fasen ble 11 -OH KA utfelt som hvite krystaller. Disse krystallene ble gjenvunnet med et papirfilter. De gjenvunnede krystallene ble analysert ved kjernemagnetisk resonans (NMR) (1H-NMR (CDCl3) δ 0,95 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,05–2,22 (15H, m), 2,37 (1H, d, J { {27}},9 Hz), 3,06 (1H, bred s), 4,06 (1H, d, J=4,6 Hz), 5,27 (1H, s), og 5,87 (1H, s)). 1H-NMR-spekteret til krystallen var sammenfallende med det autentiske 11 -OH KA-spekteret (se tilleggsmaterialer figur S2).

2.3. Analyse av 11 OH-KA i museserum

Metoder for ultra-ytelse LC (UPLC)-massespektrometri (MS) analyser ble hentet fra flere metoder brukt i [25,26]. Kort fortalt, for å behandle mus (C57BL/6J), ble A. lavenia-blader ekstrahert med 30 volumer vann. Etter sterilisering ved 120 ◦C i 20 minutter ble ekstraktet ytterligere fortynnet med 2 volumer vann og servert som drikkevann. For å undersøke farmakokinetikken til 11 -OHKA ble 100 mg/kg av forbindelsen suspendert i 1 prosent Tween 80 (Kanto Kagaku, Tokyo, Japan) administrert oralt. Blod ble gjenvunnet via halevenen 15–240 minutter etter administrering.

For å måle {{0}}OH KA i museblod, ble serumet (20 µL) ekstrahert med 200 µL acetonitril. For å normalisere ekstraksjonseffektiviteten ble 10 nmol 18 -glycyrrhetinsyre (Kanto Kagaku) ​​tilsatt til serumet før ekstraksjonen. Etter fjerning av acetonitril ved fordampning, ble forbindelsene oppløst i 5 µL metanol etterfulgt av tilsetning av 5 µL H2O. Deretter ble 1 µLof-løsning brukt for LC-MS-spektrometri (MS: Waters Xevo G2-XS QTof, Waters, Milford, MA). For å skille 11 -OH KA, en C18 ODS-kolonne (3,0 mm) × 150 mm (5 µm): RP-18 GP, Kanto Kagaku) ​​og en gradient fra 35 prosent acetonitril/vann til 100 prosent acetonitril over 10 minutter ble påført. MS-forholdene var som følger: kapillær (kV), 2,20; prøvetaking kjerne, 45; ekstraksjonskjegle, 4.0. Fordi vi ikke klarte å oppdage fragmenter av 11 -OH KA via MS/MS-analyser (Supplementary Materials Figure S3A), ble 11 -OH KA kvantifisert med kun MS-signaler ved å overvåke masse-til-ladning-forholdet (m/ z) av 331,1879 med 0,01 Da banen (Supplerende materialer figur S3B). En standardkurve ble utarbeidet ved tilsetning av 11 -OH KA (ved en sluttkonsentrasjon på 0,1–3 µM) til 50 prosent metanol/vann som var fremstilt fra normalt museserum ved å bruke samme prosedyre for 11 -OH KA-ekstraksjon. 18 -glycyrrhetinsyren ble målt ved bruk av LC-UV under de samme forholdene som ble brukt for 11 -OH KA-målingen. Disse dyreforsøkene ble godkjent av Animal ExperimentCommittee ved Gifu University (H30-041). Vi brukte et minimum antall mus for å overholde dyrevelferdskravene.

2.4. Melanogeneseanalyse

Muse B16F10 melanomceller fra American Type Culture Collection (RIKEN, Tsukuba, Japan) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM-High glucose (4,5 g/L d-glukose), WAKO, Kyoto, Japan) og supplert med 10 prosent føtalt bovint serum og antibiotika. Cellene ble inkubert i en fuktet atmosfære med 5 prosent CO2 ved 37 ◦C og ble overført annenhver dag viatrypsinisering til nye kulturplater.

Cellene (2 × 105) ble sådd ut på en 6-brønnplate og inkubert i 12–16 timer før induksjon avmelanogenese. Melanogenese ble indusert av 20 µM forskolin (Fsk) sammen med A. laveniawater-ekstrakt eller 11 -OH KA i 48 timer. Melaninmålinger ble utført i samsvar med litteraturen [5]. Kort fortalt ble cellene vasket to ganger med fosfatbufret saltvann og gjenvunnet i 2 ml oppsamlingsrør, etterfulgt av sentrifugering ved 8000 rpm i 1,5 min. Hver cellepellet ble suspendert i 200 µL destillert vann, og 50 µL ble brukt for måling av proteininnhold. De resterende 150 µL ble blandet med 150 µL 2 M NaOH og deretter lysert ved inkubering ved 45 ◦C i 2 timer. Melaninet ble ekstrahert med en 2:1 kloroform-metanolblanding og målt med aspektrofotometer (Glomax Multi, Promega, Madison, WI, USA) ved 405 nm. Proteinkonsentrasjonen til cellepelletene ble bestemt ved bruk av et Bradford-reagens (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og brukt for normalisering av melanininnholdet.

effekter av cistanche-ekstrakt: hemme melanin og blekende hud

2.5. Statistisk analyse

Den statistiske analysen ble utført ved å bruke Students t-test når dataene ble innhentet under samme eksperiment. Vi brukte ikke statistiske analyser hvis eksperimentene ble utført på forskjellige dager eller hvis prøvenummeret bare var to.

3. Resultater

3.1. A. Lavenia inneholder en høy mengde 11 OH-KA

Vi har tidligere rapportert at etanolekstraktet av P. disper Kunze-blader, tilberedt med 10 volumer tørrvekt (v/w) etanol, effektivt hemmetmelanogenesei B16F10-celler, selv etter en 1/1000 fortynning [5]. For å sammenligne effektiviteten til vannekstraktene av tørkede blader av A. lavenia og vannekstraktene av P. disper Kunze-bladene, forberedte vi ekstraktene (20 volumer vann (v/v tørkede blader)) og tilsatte dem i det dyrkede mediet sammen med forskolin (melanogenese-induktor-acAMP-agonist). Begge ekstraktene hemmet effektivt melaninsyntese selv ved 1/1000 fortynning, når temelanininnholdet ble visuelt evaluert (figur 2A). Melanininnholdet ble målt etter NaOHekstraksjon (Figur 2B). Ved 1/3000 fortynning reduserte A. lavenia-ekstraktet melanininnholdet med 69 prosent sammenlignet med kontrollen (kun Fsk), og P. disper Kunze-ekstraktet reduserte melanininnholdet med 41 prosent. Ved 1/1000 fortynning reduserte A. lavenia-ekstrakt melanininnholdet fullstendig, mens P. disperKunze-ekstraktene reduserte melanininnholdet med 60 prosent. Denne forskjellen ble ikke observert når ekstraktene ble fortynnet med 1/300.

LC-UV-analysene antydet det11 OH-KAvar hovedkomponenten i A. laveniawater-ekstraktet (Figur 2C, til venstre). Derimot ble ingen klar topp for 11 OH-KA påvist når P. disper Kunze-ekstrakt ble analysert (figur 2C, høyre). LC-MS-analysene antydet at toppen indikert med en pil tilsvarte 11 OH-KA (data ikke vist). Disse resultatene indikerer at 11 OH-KA kan være hovedkomponenten som er ansvarlig formelanogenesehemming i A. lavenia-ekstrakt, mens derivater som glykosylerte former [5] fortrinnsvis kan bidra til melanin-hemming i P. disper Kunze-ekstrakt.

Deretter prøvde vi å rense11 OH-KAved distribusjon. CHCl3 var i stand til å ekstrahere 11 OH-KA fra ovennevnte A. lavenia-vannekstrakt med høy renhet (mer enn 87 prosent) (Figur 2D, venstre). Spektraene til NMR-analysene av det krystalliserte stoffet i CHCl3 var identiske med de til den autentiske 11 OH-KA (se Materialer og metoder). Derimot ble et stort antall ukjente forbindelser ekstrahert fra P. disper Kunze vannekstrakt (figur 2D, til høyre). Et sammendrag av LC-analysene er angitt i figur 2E, noe som tyder på at A. lavenia er en attraktiv kilde til 11 OH-KA.

3.2. Egnet ekstraksjon av 11 OH-KA fra A. lavenia

I følge informasjon funnet på Internett, brukes alle porsjoner (blad, stilk og rot) av A. lavenia som urtemedisiner i Kina og Taiwan. For å bestemme de beste betingelsene for 11 OH-KA-ekstraksjon fra A. lavenia, undersøkte vi først hvilke deler av planten som er rike på denne forbindelsen. Vannekstrakter ble fremstilt fra blader alene eller fra luftdeler. DemelanogeneseAssay på B16F10-cellene viste at ekstraktet fremstilt fra luftdelene (stilker og blader) hadde mindre anti-melanogen aktivitet enn det fremstilt fra bladene alene (Figur 3A, venstre). Dette tyder på at stilker (som står for mer enn 90 prosent av tørrvekten) inneholder mindre11 OH-KA, som ble bekreftet av LC-UV-analysene (Figur 3A, høyre).

Deretter undersøkte vi hvor mange volumer vann som skulle brukes til utvinningen. Tilsynelatende kan et lite volum vann (10-fold) berike11 OH-KA(Figur 3B). Vi spekulerte i at den lave løseligheten til 11 OH-KA i vann kan bidra til å beholde denne forbindelsen i rester. En maksimal utvinning av 11 OH-KA i vann ble observert når mer enn 30 volumer vann ble brukt (figur 3C). Derfor, med tanke på maksimal utvinning og anrikning av 11 OH-KA i vann, brukte vi 30 volumer vann i senere eksperimenter.

I Kina og Taiwan blir A. lavenia ekstrahert i varmt vann, hvor den termiske stabiliteten til11 OH-KA ble undersøkt. Vannekstraktene ble inkubert ved 90 ◦C eller 120 ◦C i 10 eller 20 minutter, og 11 OH-KA-innholdet ble analysert med LC-UV. Disse termiske behandlingene ga en stor mengde sedimentering, sannsynligvis bestående av denaturert protein. De11 OH-KAinnholdet i den oppløselige fraksjonen ble tilsynelatende økt (figur 3D), noe som kan være et resultat av fjerning av disse dimenterte materialene.

3.2.1. OH-KA er forbindelsen i A. Lavenia-vannekstrakt som er ansvarlig for anti-melanogen aktivitet i B16F10-celler

Når 1 g av bladet ble ekstrahert i 30 volumer vann, var innholdet av 11 OH-KA ca. 0,6 mg/ml (1,8 mM). For å bestemme graden av bidraget til11 OH-KAi A. lavenia-vannekstrakten til den anti-melanogene aktiviteten ble forskjellige konsentrasjoner av autentisk 11 OH-KA testet i B16F10-celler. Visuell undersøkelse (Figur 4A) og måling av melanininnhold (Figur 4B) avslørte at vannekstraktene (Figur 4A, øvre sett) som viste samme effekt når det gjelder anti-melanogen aktivitet som autentisk 11 OH-KA alene (Figur 4A, nedre sett) inneholdt bare en halv mengde11 OH-KA. Disse resultatene tyder på at 11 OH-KA i ekstraktet bidro til nesten 50 prosent av ekstraktets anti-melanogene aktivitet. De andre 50 prosentene kan være avledet fra 11 OH-KA-derivater, for eksempel glykosidformer, som også kan forklare det lave innholdet av 11 OH-KA i P. disper Kunze-ekstrakt til tross for dets høye effektivitet når det gjelder anti-melanogen aktivitet (figur 2).

effekter av cistanche-ekstrakt: anti-aldring og blekende hud

3.2.2. OH-KA er forbindelsen i A. lavenia-ekstrakt ansvarlig for anti-melanogen aktivitet hos mus

For å få foreløpige resultater for den fremtidige utviklingen av A. lavenia som materiale for kosmetikk, utførte vi in ​​vivo-analyser med et lite antall mus. Vi undersøkte først farmakokinetikken til 11 OH-KA hos mus. Vanninntaket var ca. 4 ml daglig hos mus med ca. 25 g kroppsvekt. Den maksimale løseligheten av 11 OH-KA i vannekstraktet av A. lavenia (se figur 3C, 20–30 volumer vann: 0,6 mg/ml) kan teoretisk gi en 100 mg/kg daglig dose av thiskaurenoic acid (4 ml av 0,6 mg/ml 11 OH-KA laget 2,4 mg/dag; normalisering av 2,4 mg etter musekroppsvekt (25 g) resulterte i 96 mg/kg). Derfor bestemte vi oss for å behandle musene med 100 mg/kg11 OH-KA (suspendert i 200 µL 1 prosent Tween 80).

Oral behandling med11 OH-KAresulterte i at det raskt dukket opp (innen 15 minutter) i blodet (figur 5A). Konsentrasjonen nådde og beholdt en effektiv dose i B16F10-cellene. Dette resultatet indikerer at 11 OH-KA kan absorberes gjennom fordøyelseskanalen. Det faktum at konsentrasjonen avtok innen 60 minutter tyder imidlertid på rask utskillelse av denne forbindelsen.

Deretter undersøkte vi de kroniske effektene av 11 OH-KA hos mus. Siden til og med 0.6 mg/mL 11 OH-KA raskt utfelt i drikkevann hvis11 OH-KAvar ren, bestemte vi oss for å teste A. lavenia-vannekstrakten. A. lavenia-vannekstraktet kan imidlertid inneholde ukjente ingredienser med en bitter smak. Derfor måtte ekstraktet fortynnes ytterligere med to volumer vann (med en sluttverdi på 0.3 mg/mL for 11 OH -KA, ca. 50 mg/kg/dag). Musene ble behandlet med vannekstraktene i 1 uke, og blodprøvene deres ble deretter samlet (Figur 5B). LC-MS analyser påvist11 OH-KA i blodet ved en semi-effektiv konsentrasjon. P. dispar Kunze-vannekstraktet som var fremstilt ved samme prosedyre som A. lavenia-vannekstraktet ble også undersøkt. Innholdet av 11 OH-KA i blodet til mus behandlet med P. dispar Kunze-ekstraktet var 10 ganger lavere enn for musene behandlet med A. lavenia-ekstraktet.

Hos voksne mus stopper hårveksten under telogenstadiet i flere måneder, og ny vekst(anagen) oppstår tilfeldig i løpet av bare noen få dager i forskjellige områder [27]. Derfor, for å undersøke effekten avmelanogeneseinhibitorer, varigheten av behandlingen med forbindelser (inhibitorer) bør tilhøre (f.eks. flere måneder). Derimot erstattes dunete hår synkront med voksne hår i løpet av den 3–4-uker gamle (W) fasen. Derfor, når 3W-mus behandles med inhibitorer i 2 uker, vil effektene påmelanogenesekan evalueres fra pigmenteringen (fargen) til det nyvoksne håret (dvs. det første voksne håret) ved 5W–6W [28].

Når mus ble behandlet med A. lavenia-ekstrakt via drikkevann i to uker (3W–4W), ble deres pigmentering undertrykt i de nyvoksne hårene (Figur 5C). Derimot ble øyepigmenteringen deres ikke påvirket. Undertrykkelsen av hårpigmentering ble ikke observert hos micetreated med P. dispar Kunze-ekstraktet. Disse resultatene tyder på at A. lavenia-bladekstraktet kan inneholde anti-melanogene stoffer, muligens 11 OH-KA, som er effektive in vivo, mens P. dispar Kunze-bladekstrakt, sannsynligvis rik på11 OH-KAderivater, er kanskje ikke effektive in vivo.

cistanche fordel: antioksidasjon

4. Diskusjon

Vi fant at A. lavenia-blader inneholder en høy mengde 11 OH-KA (omtrent 2,5 prosent av tørrbladvekten). Vann ekstraherte effektivt 11 OH-KA, til tross for den hydrofobe naturen til denne forbindelsen. Ettersom 11 OH-KA i vann var stabil ved 120 ◦C i 20 minutter, steriliserte vi vannekstraktet av A. laveniablad og administrert det til mus. Resultatene bekreftet tilstedeværelsen av11 OH-KAi temaets blod og styrken til vannekstraktet som et anti-melanogent reagens in vivo.

Tilstedeværelsen av 11 OH-KA og dets derivater i A. lavenia ble rapportert i 1979 [16] og 1990 [29]. Siden den gang har bare én studie fra Indonesia rapportert en omfattende analyse av ingrediensene i A. lavenia [30]. Imidlertid ble ingen 11 OH-KA identifisert i disse materialene. Dessuten er det ikke funnet noen studier av de fysiske egenskapene til 11 OH-KA, som kan utvinnes med rent vann fra A. lavenia.

En oversiktsartikkel om folkemedisiner i India refererer til A. lavenia-vannekstrakt som en behandling for forstyrrelser i fordøyelsessystemet [31]. Et internettsøk etter "A. lavenia" eller dets kinesiske navn antydet noen fordelaktig bruk av denne planten som en anti-inflammatorisk urtemedisin via et varmtvannsekstrakt (dvs. som avkok) (f.eks. for hepatitt, lungebetennelse (allergi og kronisk obstruktiv sykdom) lungesykdom) og hudbetennelse). Imidlertid ble ingen formelle rapporter om de biologiske aktivitetene til A. laveniaekstrakter eller den økologiske statusen til denne planten funnet i PubMed. I byen vår (Gifu, Japan) er A. lavenia oppført som en truet art. Sjeldenheten til A. lavenia kan gjøre det vanskelig å analysere og utvikle potensialet som urtemedisin og funksjonell mat.

På den annen side, det fordelaktige potensialet til11 OH-KA, renset fra P. semipinnata, har blitt bestemt in vitro og in vivo [8–11]. Selv om vi ikke undersøkte innholdet av 11 OH-KA i P.semipinnata, antar vi at dette innholdet kanskje ikke er veldig høyt sammenlignet med det i A. lavenia fordi P. semipinnata er nært beslektet med P. disper Kunze. I tillegg er det ingen registreringer om bruken av disse bregnene i mennesker, selv på Internett. Denne bakgrunnen tyder på at A. lavenia kan ha større potensiale som urtemedisin enn disse bregnene dersom 11 OH-KA viser seg å ha klinisk potensial.

Studier om potensialet til11 OH-KAhar vært fokusert på dets aktiviteter som anti-kreft [2,10,11,32] og anti-inflammatorisk [11,33] middel. Imidlertid er det også sant at dosene av 11 OH-KA som kreves for disse aktivitetene er mer enn 20 µM, noe som er relativt høyt. I motsetning til dette, ved en konsentrasjon på mindre enn 1 µM, kaurene-enten-11 -hydroksy-16-Karen-15-on, som har en metylgruppe i19-posisjonen i stedet for karboksylen gruppe i 11 OH-KA, viser høy apoptotisk aktivitet mot humane HL-60 monocytter [12]. Disse forskjellene antyder at 19-posisjonen kan være en determinant for cellulær toksisitet [5].

Selv om anti-tumor og anti-inflammatoriske aktiviteter finnes i en rekke kaurens [7,34–36], er den spesifikke egenskapen til 11 OH-KA en type anti-melanogen aktivitet [5]. En rekke naturlige forbindelser, som flavonoider og terpenoider, har vist seg å moduleremelanogeneseved å endre uttrykket av mikroftalmi-transkripsjonsfaktor (MITF), som er avgjørende for melanogene programmer [13,14]. I motsetning til disse forbindelsene er det ikke funnet MITF-modulatorer i kaurens orkaurenoic syrer.

11 OH-KAundertrykker uttrykket tiltyrosinasegenet ved å nedregulere dets promotoraktivitet. Selv om 11 OH-KA ikke endrer uttrykket eller aktivitetsnivåene til MITF, undertrykker 11 OH-KA-genpromotoraktiviteten på en MITF-bindende element-avhengig måte [5]. Interessant nok resulterer overekspresjonen av MITF i B16F10-celler i en kansellering av den 11 OH-KA-medierte undertrykkelsen av tyrosinase-promoteraktivitet, noe som antyder at 11 OH-KA kan rekruttere en ukjent repressor til det MITF-bindende elementet. Dessuten mekanismen som 11 OH-KA undertrykkertyrosinasepromoteraktivitet kan være forskjellig fra den som fører til cytotoksisitet fordi den anti-melanogene aktiviteten observeres selv når B16F10-celler behandles med 1,2 µM 11 OH-KA (figur 4).

Forskning som involverer en menneskelig tredimensjonal hudmodell sammensatt av primære keratinocytter og melanocytter antyder at lokal bruk av 1 mM av11 OH-KAundertrykker hudpigmentering fullstendig [5]. Når det gjelder anti-melanogen aktivitet, tilsvarer 1 mM av 11 OH-KA omtrent 6,6 mg/ml (0,66 prosent ) tørket A. Lavenia-blad (Figur 3). I denne sammenhengen er A. Lavenia en attraktiv kilde til kosmetiske artikler forbleking av huden. I tillegg brukes A. Lavenia som folkemedisin, og 11 OH-KA har en bred margin mellom dens effektive doser (konsentrasjoner) for anti-melanogene aktivitet og cytotoksisitet.

Det er viktig at tranexamsyre (et hemostatisk legemiddel) har vist seg å undertrykke melaninavsetning i menneskelig hud og brukes som oral medisin for å behandle melasma [23,24]. Interessant nok endret pelsen til micetbehandlet med tranexamsyre farge fra svart til brun [37]. I denne studien har vi også vist at et vannekstrakt av A. Lavenia-blad effektivt kan undertrykke hårpigmentering (svart-brun) hos mus når det gis oralt, noe som tyder på at A. Lavenia-blad kan utvikles til både indre kosmetikk og funksjonell mat [20– 22] for pasienter som lider av melasma. Ytterligere studier er nødvendig angående de cellulære målene til A. Lavenia-ekstrakter og11 OH-KA, så vel som deres sikkerhet.

cistanche tablettertilbleking av huden