Tilsynelatende fravær av BMAL1-avhengig skjelettmuskel-nyrekrysssnakk hos mus

URTEFORMULERING FOR KRONISK NYRESYKDOM

Nøkkelord: døgnklokkegener; nyrefunksjon; integrerende fysiologi

1. Introduksjon

Cirkadiske rytmer er fremtredende i de fleste fysiologiske prosesser. Kontrollen av disse rytmene formidles delvis av en sentral klokke som befinner seg i den suprachiasmatiske kjernen i hjernen, men perifere døgnklokker påvirker også rytmer i fysiologisk funksjon [1]. Den molekylære klokken består av en transkripsjon-translasjons-tilbakemeldingsløkke. Kort sagt, kjerneproteinene aryl-hydrokarbon-reseptor-nukleær-translokator-lignende protein (ARNTL; eller BMAL1) og circadian lokomotor output cycles kaput (CLOCK) regulerer positivt transkripsjonen av Periode og Cryptochrome gener; Periode (PER) og Kryptokrom (CRY) proteiner gir tilbakemelding på og hemmer aktiviteten til BMAL1/CLOCK (gjennomgått i [2,3]). Forstyrrelsen av døgnkontrollerte prosesser er assosiert med mange patologier, inkludert kardiovaskulære og nyresykdommer [4,5]. Til dags dato er ikke krysssamtalen mellom ulike organsystemer etter målrettet døgnavbrudd godt forstått. Denne studien fokuserer på sletting av kjerneklokkeproteinet BMAL1 i skjelettmuskulatur og de potensielle konsekvensene denne klokkeforstyrrelsen har på nyrene.

Den skjelettmuskelspesifikke BMAL1-inducible-knockout (iMS-BMAL1 KO) musemodellen har tidligere blitt beskrevet å ha egenskaper som ligner på de man ser ved aldring. Disse musene viser en endret gangart, redusert bevegelighet, muskelsvakhet og nedsatt glukoseopptak [6,7]. Nyresykdom er synonymt med aldring ettersom forekomsten av nyresykdommer øker med alderen [8]. Et annet kjennetegn rapportert hos iMS-BMAL1 KO-musene er at de viser økt seneforkalkning [6]. Nyrenes rolle i syre-basebalansen og mineralhomeostase forbinder beinhelse direkte med nyresykdom. Følgelig antok vi at iMS-BMAL1 KO-mus potensielt kunne være en modell for nyresykdom.

Målet med denne studien var å finne ut om forstyrrelse av klokken i skjelettmuskulaturen fører til nyresvikt. Slettingen av BMAL1 i skjelettmuskulaturen forårsaker en økning i inflammatoriske markører i nyrene. Imidlertid ser verken nyrefunksjon eller nyrehistologi ut til å være påvirket av iMS-BMAL1 KO. Disse dataene tyder på at konsekvensen av klokkeforstyrrelser i skjelettmuskulaturen fører til minimale endringer i nyrene under de testede forholdene.

2. Materialer og metoder

Dyr. Musemodellen som ble brukt i denne studien ble generert ved bruk av floksede ekson 8 BMAL1-mus [9] krysset med skjelettmuskelspesifikke, Cre-rekombinase-mus (humant skjelettaktin-Cre). Cre ble aktivert ved injeksjoner av tamoxifen (laget i 15 % etanol i solsikkefrøolje) 5 uker før undersøkelse (2 mg/dag; 5 dager ip.) for å lage iMS BMAL1 KO. Vehikel- (15 % etanol i solsikkefrøolje)-injiserte Cre+-mus ble brukt som kontroller. Unge mannlige jomfrumus ble studert ved 17–19 uker, og gamle mus ble studert ved 13–14 måneder. Alle eksperimentene ble utført av National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og godkjent og overvåket av University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee og North Florida/South Georgia Veterans Administration Institutional Animal Care and Use Committee. Mus ble plassert i temperatur- (20–26 ◦C) og fuktighetskontrollerte, 12:12 timer lys-mørke syklet rom. Mus ble gitt ad libitum tilgang til vann og standard 18 % protein gnagermat (nr. 2918, Harlan Teklad/Envigo, Madison, WI, USA) med mindre annet er angitt.

Studie av metabolsk bur. En kohort av unge hannmus (5 kontroll og 5 KS-BMAL1 KO) ble holdt i metabolske bur for å samle urin og overvåke mat/vanninntak [10]. En pulverbasert geldiett (Envigo Teklad Custom Diet) inneholdende 1 % agar ble tilberedt og brukt gjennom samlingen av metabolske bur. Mus fikk 3 dager på seg til å akklimatisere seg til de metabolske burene før begynnelsen av samlingen på en kontrolldiett ({{10}},25 % NaCl; 0,6 % K; Envigo 99131). Etter én dag med registrering med en kontrolldiett, ble mus deretter behandlet med en diett med kaliummangel (0,25 % NaCl; 0,0001 % K; Envigo 99134) i fem dager. Urinprøver ble tatt hver 12. time ved slutten av dagslys- og natteperioder (Zeitgeber-tid 0 og 12). Urinproduksjon, matinntak og vanninntak ble registrert. Urinelektrolyttkonsentrasjoner ble målt med et flammefotometer (Cole-Parmer Model 2655- 00, Vernon Hills, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Mus ble avlivet, og vev ble samlet ved Zeitgeber tid 6.

Kroppssammensetning. Kroppssammensetningen ble kvantifisert i bevisste unge hannmus før og fem dager etter administrering av en kaliumfattig diett. Målinger ble utført ved Zeitgeber-tid 4–6 ved bruk av en EchoMRI Quantitative Magnetic Resonance Body Composition Analyzer (Echo Medical Systems, Houston, TX, USA) [11].

Fase Advance Protocol. En egen kohort av gamle hannmus ble holdt enkeltvis i bur utstyrt med et løpehjul med ad libitum tilgang til chow (nr. 2918, Harlan Teklad) og vann. Burene ble oppbevart i en lyskontrollert boks med konstant luftskifte (Actimetrics, Wilmette, IL, USA). Lysplanen ble opprettholdt på en 12:12 timer lys-mørke-syklus ved bruk av en grønn LED (~200 lux) lyskilde. Etter en uke med baseline ble mørkesyklusen fremmet med 7 timer, og musene ble opprettholdt på denne nye 12:12 timers lys-mørke syklusplanen i en uke. Denne prosessen ble gjentatt en gang til for å produsere en 14-t fasefremgang. Mus ble avlivet ved Zeitbeger-tid 2 i grupper på 2–3, og vev ble samlet 7–10 dager etter den andre uken med fasefremgang.

Rekombinasjonsspesifisitet. For å bekrefte spesifisiteten til Bmal1-rekombinasjon, fullførte vi PCR ved å bruke 40 ng av skjelettmuskelgenomisk DNA og primere for de rekombinerte og ikke-rekombinerte allelene. (fwd primer: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, rev primer: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, rekombinasjonsprimer: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). Forover- og reversprimerne for den floksede Bmal1-allelen gir et 431-bp-produkt. Den andre fremoverprimeren 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30 ble inkludert for å oppdage det rekombinerte produktet, som viser et bånd på 572 bp. PCR-reaksjonsprodukter ble kjørt på en 1,7 % agarosegel, og identifikasjon av et genomisk bånd og et rekombinasjonsspesifikt bånd bekreftet at alle tamoxifen-behandlede dyr var vevsspesifikk KO som tidligere beskrevet [7,12].

Immunhistokjemi. Ved bedøvelse med inhalerende isofluran ble høyre nyrer samlet og umiddelbart kuttet i to på tvers og deretter lagret i perjodat-lysin-2% paraformaldehyd i ca. 48 timer ved 4 ◦C. Væske ble deretter endret til PBS for å forberede for prosessering. Nyreprøver fra hvert dyr ble innebygd i parafin, og 4-mikrometertykke seksjoner ble kuttet og montert på objektglass. Snitt ble enten farget med hematoxylin og eosin eller farget med et 3,30 -diaminobenzidin-kromogent substrat (Vector) for å målrette BMAL1 (D2L7G Cell Signaling; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, USA). Snitt ble observert ved lysmikroskopi (Nikon E600 utstyrt med et Nikon DXM1200F digitalkamera, Melville, New York, NY, USA). Gruppeidentifikatorerble fjernet fra hvert objektglass, og BMAL1-ekspresjon ble undersøkt eller objektglass ble skåret for tubulær skade ved å bruke følgende kriterier: prosentandel av tubuli som viste tegn på tubulær nekrose, mangel på børstekant, tubulær dilatasjon og dannelse av proteingips.

inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin sekundært antistoff. Etter en ekstra vask med TBS-T i 30 minutter, ble deteksjonen utført ved bruk av SignalFire ECL-reagens (Cell Signaling Technology) med en eksponeringstid på 30 sekunder for bildebehandling. Densitometri ble utført ved bruk av Fiji, og proteinoverflod ble normalisert til Ponceau-farging.

Multiplex immunoassays. Kortikale og medullære områder ble dissekert fra en halv nyre hos gamle hannmus. Vev ble homogenisert i enten 300 µL (cortex) eller 250 µL (medulla) buffer (1 % protease-fosfatase-inhibitorcocktail (Thermo Scientific) 1 % 1 M etylendiamintetraeddiksyre, 0,1 % Tween 20 i fosfat bufret saltvann). Proteinkonsentrasjonen for hver prøve ble bestemt ved BCA (Pierce, Thermo Scientific). Homogenater ble målt i duplikat for utvalgte analytter ved bruk av kommersielle multipleks immunoassaysett (cat#s MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K og MKI1MAG-94K; EMD MilliporeSigma) på en MILLIPLEX® Analyzer 3.1 xPONENT System (Luminex 200, Austin, TX, USA) med dataanalyse via MILLIPLEX Analyst-programvare. Gjennomsnittlig intraassay CV var<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

Renal mitokondrier isolasjon og respirometri. Ferskt nyrekortikalt vev ble dissekert fra mus etter fasefremgang. Mitokondrier ble isolert ved å bruke Mitochondria Isolation Kit for Tissue (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, USA) etter produsentens instruksjoner. Proteinkonsentrasjonen til mitokondriepreparatet ble bestemt ved å bruke et BCA Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific). Mitokondriell respirasjon av isolatet ble bestemt i duplikat i et tidligere kalibrert xylografkammer holdt ved 37 ◦C (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Østerrike) inneholdende respirasjonsbuffer (MiR05; 0.5 mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM laktobionsyre, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sukrose og 1 g/L BSA i hovedsak fettsyrefri, pH 7,1) [13]. Oksygenkonsentrasjonen til respirasjonsbufferen ble holdt mellom luftmetning (~200 µM) og 50 µM. Oksygenforbrukshastighet (OCR; ρmol O2/s/mg mitokondrielt protein) ble målt ved å bruke følgende protokoll for substrat-uncoupler-inhibitor-titrering (SUIT) (konsentrasjonen av reagenser notert i parentes er endelig i kamrene): (1) LEKKASJON (L) ) respirasjon ble vurdert etter TCA-syklusstimulering med NADH-koblede substrater pyruvat (5 mM), malat (2 mM) og glutamat (10 mM) for å støtte elektronstrøm gjennom kompleks I (CI) i elektrontransportsystemet (ETS; E ); (2) oksidativ fosforylering (OXPHOS; P) ble stimulert med adenosindifosfat (ADP; 2,5 mM) og registrert som PCI; (3) tilsetning av succinat (10 mM) støttet konvergent elektronstrøm gjennom komplekser I og II av ETS (PCI+II); (4) kvaliteten på mitokondriepreparatet ble vurdert gjennom testing av mitokondriell ytre membranintegritet ved å tilsette cytokrom c (10 µM); (5) avkopleren karbonylcyanid 4-(trifluormetoksy) fenylhydrazon (FCCP; 0,5 µL-trinn av en 0,1 mM stamløsning) ble titrert trinnvis inntil maksimal ukoblet respirasjon ble nådd og registrert som maksimal ETS-kapasitet (ECI+) II); (6) tilsetning av rotenon (0,5 µM) hemmet kompleks I av ETS, og den gjenværende OCR ble registrert som maksimal ETS-kapasitet støttet av kompleks II-substrat (ECII); (7) tilsetning av antimycin A (2,5 µM) hemmet kompleks III av ETS og derved all elektrontransport til kompleks IV, og den gjenværende OCR ble registrert som gjenværende, ikke-mitokondrielt oksygenforbruk (ROX) og trukket fra alle foregående OCR. ; (8) oksygenforbruket ble deretter stimulert igjen med tilsetning av N,N,NO,N0 -Tetrametyl-p-fenylendiamin-dihydroklorid (TMPD; 0,5 mM; i nærvær av askorbat (2 mM) for å unngå ukontrollert autooksidasjon av TMPD) som et kunstig substrat for å redusere cytokrom c; (9) den kjemiske bakgrunnsoksidasjonshastigheten i nærvær av TMPD/askorbat ble vurdert ved å tilsette den komplekse IV-hemmeren natriumazid (100 mM), og ble trukket fra den foregående fluksen, noe som resulterte i maksimal kapasitet for cytokrom c-oksidaseaktivitet (ECIV). Oksygenforbruksdata ble innhentet og analysert ved bruk av DatLab vs. 7.4 (Oroboros Instruments). Flukskontrollforhold (FCR) ble beregnet som oksygenforbruk ved en gitt respirasjonstilstand i forhold til maksimal ETS-kapasitet (ECI+II).

Flowcytometri. Lungevev ble fordøyd, og flowcytometrisk analyse ble utført som tidligere beskrevet [14].

Statistiske analyser. Grafiske data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Toveis ANOVA, med gjentatte mål når det var mulig, ble brukt for å analysere forskjeller mellom fire grupper. Sidaks multiple sammenligningstest ble brukt til å sammenligne musegrupper med behandlingsgrupper. Elevens t-test ble brukt til å sammenligne de to gruppene. Analyse ble utført ved å bruke GraphPad Prism versjon 9.2 programvare (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Statistisk signifikans ble definert som p < 0.05.

Støttetjeneste fra Wecistanche:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950