Aristolochic Acid induserer nyrefibrose og senescens hos mus
Mar 23, 2022
Abstrakt:Nyren er et av de mest utsatte organene for aldersrelaterte svekkelser. Generelt er aldring av nyrene ledsaget av nyrefifibrose, som er den siste vanlige veien for kroniskenyresykdommer. Aristolochic acid (AA), et nefrotoksisk middel, forårsaker AA nefropati (AAN), som er preget av progressiv nyrefifibrose og funksjonsnedgang. Selv om nyrefifibrose er assosiert med nyrealdring, er det fortsatt uklart om AA induserer nyrealdring. Målet med denne studien er å undersøke potensiell bruk av AAN som en modell for aldring av nyrene. Her undersøkte vi senescensrelaterte faktorer i AAN-modeller ved kronisk å administrere AA til C57BL/6-mus. Sammenlignet med kontroller viste AA-gruppen aldringnyrefenotyper, slik som nyreatrofi, nedsatt nyrefunksjon og tubulointerstitiell fifibrose. I tillegg fremmet AA cellulær senescens spesifikt inyrerog økt renal p16 mRNA-ekspresjon og senescensassosiert -galaktosidaseaktivitet. Videre viste AA-behandlede mus proksimale tubulære mitokondrielle abnormiteter, samt reaktive oksygenarter. Klotho, et antialdringsgen, ble også betydelig redusert inyrerav AA-behandlede mus. Samlet indikerer resultatene av denne studien at AA endrer senescensrelaterte faktorer, og at nyrefifibrose er nært knyttet til nyrealdring.
Nøkkelord:Kronisk nyre sykdom; nyre fifibrose; aristolochic syre; aldring; cellulær senescens
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESYKDOM
IntroduksjonMed den stadig økende levetiden hos mennesker, lider flere individer av aldersrelaterte svekkelser.Nyrerer vanligvis påvirket av aldersrelatert vevsskade, og forekomsten av kroniskenyresykdomøker med alderen [1]. Nyrealdring akselererer generell aldring, noe som resulterer i kortere levetid. Derfor er forskning på nyrealdring nødvendig, selv om passende dyremodeller ikke er fullt utviklet. Nyrealdring er ledsaget av forskjellige patologiske endringer, inkludert nyreatrofi, glomerulosklerose og tubulointerstitiell fifibrose [2]. Renal tubulointerstitiell fifibrose er den siste vanlige veien i de fleste former for progressiv nyresykdom, noe som tyder på at nyrefifibrose er nært assosiert med eldrenyre. I aldringsforskning er mus et pålitelig verktøy på grunn av deres genetiske nærhet til mennesker, evnen til genetisk å manipulere genomet og det faktum at de presenterer lignende aldringsrelaterte fenotyper for mennesker i løpet av deres levetid [3]. Langsgående observasjoner ved bruk av innavlede mus er ideelle som en modell for aldring, selv om det er tidkrevende å følge mus i hele deres levetid. I tillegg er det flere genetisk modifiserte musemodeller for aldring. Den Klotho-mangelfulle musen er en modell av for tidlig aldring som brukes i aldringsforskning. Men i denne modellen er nyrefunksjonen upåvirket, og flere andre organer enn nyrene er svekket [4]. Dermed kan denne musemodellen være upassende for forskning på nyrealdring.Administrering av aristolochic syre (AA) forårsaker en spesifikk type nyreskade kjent som AA nefropati (AAN), som er preget av omfattende interstitiell fibrose [5,6]. AA er giftig for det renale tubulære epitelet fordi det fremmer dannelsen av DNA-addukter i nyrevev [7]. AA påvirker neppe andre organer enn urinsystemet og kan være nyttig for evaluering avnyre-spesifikke endringer. Derfor er AA ofte brukt til å etablere modeller for nyrefifibrose hos mus [8,9]. Imidlertid er det fortsatt uklart om AA-induserte endringer er relatert til aldring inyrer. I denne studien undersøkte vi aldersrelaterte fenotyper og molekylære faktorer i AAN hos mus
Resultater 2.1. AA-administrasjon induserte betydelig vekttap, nyreatrofi og en nedgang i nyrefunksjonenBaseline kroppsvekt (BW) og systolisk blodtrykk (BP) var identiske mellom vehikelkontroll- og AA-gruppene. BW i vehikel-kontrollgruppen økte konsekvent over 8 uker. Imidlertid ble vektøkning hemmet av AA-administrasjon, og AA-gruppen hadde signifikant lavere BW 4 og 8 uker etter oppstart av AA-administrasjon (Figur 1A). Det var ingen signifikant forskjell i systolisk BP eller hjertefrekvens mellom kjøretøykontroll- og AA-gruppene (figur 1B, C). Hjertevekt/BW-forholdet viste ingen forskjell mellom gruppene 8 uker etter oppstart av AA-administrasjon (Figur 1D), mensnyrevekt/BW-forhold var signifikant lavere i AA-gruppen 8 uker etter oppstart av AA-administrasjon (figur 1E). Vi undersøkte deretter nyrefunksjonen i vehikelkontroll- og AA-gruppene. Konsentrasjoner av plasmakreatinin og urea-nitrogen (UN) var signifikant høyere i AA-gruppen enn vehikelkontrollgruppen 8 uker etter oppstart av AA-administrasjon. I tillegg reduserte AA-behandling signifikant kreatininclearance sammenlignet med vehikelkontrollgruppen 8 uker etter oppstart av AA-administrasjon (figur 1F–H).
2.2. AA-administrasjon indusert åpenbar tubulointerstitiell fibrose og betydelig oppregulering av fibroserelatert genuttrykk i nyreneHistologisk undersøkelse ved bruk av periodisk syre-Schiff (PAS)-farging viste at det glomerulære området var signifikant redusert i AA-gruppen sammenlignet med vehikelkontrollgruppen (Figur 2A). Omfattende tubulointerstitiell fifibrose, vurdert ved bruk av Massons trikrom (MT)-farging, ble observert i AA-gruppen (Figur 2B), så vel som med oppregulering av mRNA-nivåene av renal fifibrose-relaterte gener, kollagen I og III, og transformerende vekstfaktor ( TGF)- (Figur 2C–E).
2.3.AA-administrasjon Akselerert cellulær senescens, mitokondriell dysfunksjon og akkumulering av reaksjonsoksy/gen-arter (ROS) i nyreneFor å evaluere cellulær senescens undersøkte vi nyre-mRNA-ekspresjon av p53, p21, p16 og glutaminase (GLS), AA-gruppen viste betydelig høyere mRNA-nivåer av disse senescensrelaterte genene inyrer(Figur 3A-D). Videre er den senescensassosierte -galactosidase(SA- -gal)-fargingsintensiteten inyrervar økt i AA-gruppen og nesten fraværende i vehikelkontrollgruppen (Figur 3E). I AA-gruppen avslørte elektronmikroskopi forsvinningen av mitokondrielle cristae, mitokondriell fragmentering, cytoplasmatisk vakuolisering og autolysosomer i de proksimale tubulære cellene, samtidig med nedregulering av BCL2/adenovirus E1B 19-kDa interagerende protein 3(Bnip3), et mitokondrierelatert gen (figur 3FG). Nyre-mRNA-uttrykk av Nox2. en komponent av nikotinamidadenindinukleotidfosfat (NADPH) oksidase, ble signifikant økt i AA-gruppen sammenlignet med vehikelkontrollgruppen (figur 3H). Western blot-analyse avslørte dessuten at det renale 4-hydroksy-2-nominelle (4-HNE)-nivået var signifikant økt i AA-gruppen (figur 3I). Disse resultatene indikerte at AA-administrasjon induserte cellulær senescens, mitokondriell dysfunksjon og ROS-akkumulering inyrer.
2.4. AA Redusert renal Klotho-proteinuttrykkVi undersøkte nyreekspresjonen av antialdringsproteiner i vehikelkontroll- og AA-gruppene. Klotho-ekspresjon ble signifikant redusert i AA-gruppen sammenlignet med vehikelkontrollgruppen (Figur 4A), mens nyreuttrykkene av nikotinamidfosforibosyltransferase (NAMPT) og sirtuin1 (SIRT1) var like mellom gruppene (Figur 4B, C).
3. DiskusjonSå vidt vi vet, er denne studien den første som fokuserer på evaluering av nyrealdringsassosierte endringer i AAN ved å bruke markører for senescens, slik som p16 og SA- -gal aktivitet. AA-behandling fremmet nyreatrofi, tubulointerstitiell fibrose og nedsatt nyrefunksjon, som ble ledsaget av oppregulering av renal p16 mRNA og SA- -gal-positiv farging. Videre demonstrerte AA-gruppen trekk ved nyrealdringsrelaterte mekanismer som mitokondrielle abnormiteter, økt oksidativt stress og nedregulering av antialdringsgenet Klotho. Samlet antyder våre observasjoner at kronisk AA-administrasjon delvis etterligner nyrealdring.
Cellulær senescens er den permanente arrestasjonen av celleproliferasjon som respons på ulike stressfaktorer, som DNA-skade, og bidrar til aldring og aldringsrelaterte sykdommer. Uttrykket av p16, en cyklinavhengig kinasehemmer, er korrelert med aldring i forskjellige organer, inkludert nyrene. Kalorirestriksjon øker levetiden ved å hemme pl6-uttrykk [10]. I tillegg forårsaker eliminering av p16-uttrykkende senescentceller i INK-ATTAC-mus via injeksjon av AP20187, en FK506-bindende proteindimerisator [11], svekkelse av nyrealdringsfenotyper, som glomerulær sklerose og nyre. funksjonell nedgang. Derfor er p16 en av de viktigste aldringsrelaterte faktorene. Aldrende celler kan påvises ved å bruke SA- -gal-farging, som viser økt -galaktosidaseaktivitet ved pH 6,0 [12], og er en mye brukt biomarkør for senescente og gamle celler. Nyre-mRNA-ekspresjon av pl16 øker hos eldre rotternyrerog er ledsaget av økt SA- -galaktivitet i nyreepitelet [13I. I denne studien demonstrerte vi økt renal p16-mRNA-ekspresjon og SA- -gal-farging, noe som indikerer at AA induserer nyrealder. GLS ble nylig rapportert å være essensielt for overlevelsen av senescentceller via forbedret glutaminolyse og intracellulær pH-nøytralisering [14]. Hemming av GLS-avhengig glutaminolyse hos gamle mus ble vist å eliminere senescentceller og forbedre aldersrelatert organdysfunksjon. I denne studien indikerte oppregulering av nyre-GLS-mRNA nyreakkumulering av senescentceller i gruppen. Dermed forårsaket kronisk AA-administrasjon cellulær senescens i nyrene.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKSJONEN
I tillegg til cellulær senescens, er mitokondriell dysfunksjon en viktig mekanisme som ligger til grunn for aldersrelatert vevsskade og er ledsaget av ROS-akkumulering [15,16. Mitokondriell dysfunksjon driver og opprettholder cellulær senescens [17] mens cellulær senescens bidrar direkte til mitokondriell dysfunksjon [18]. Bnip3, lokalisert primært i den ytre mitokondriemembranen, kan spille en rolle i reguleringen av mitofagi i dyrkede nyreproksimale tubulære celler som respons på oksidativt stress og hypoksi. Hos gamle mus øker kalorirestriksjon autofagi i tubulære celler, via oppregulering av Bnip3, og forbedrer aldersindusert degenerasjon av nyrefunksjonen [19]. I denne studien avslørte elektronmikroskopi egenskapene til mitokondrielle abnormiteter som kan være påvirket av redusert nyre-Bnip3-uttrykk eller cellulær senescens. Mitokondrier er den viktigste intracellulære kilden til ROS. For å vurdere effekten av mitokondrielle abnormiteter på renal ROS, undersøkte vi nyreakkumuleringen av 4-HINE og påviste AA-indusert ROS-akkumulering inyrer.NADPH-oksidaser er en viktig kilde til ROS. Under den akutte fasen av AAN hos mus var nyre-mRNA-ekspresjonen av Nox2 forhøyet, og nitrogenoksidtilgjengeligheten ble redusert, noe som førte til vedvarende hypoksi og iskemi [20. Hos gammel rottenyrerakkumulering av ROS er ledsaget av økt ekspresjon av Nox2 [21]. Disse funnene tyder på at AA kan indusere aldersrelaterte fenotyper via ROS-akkumulering forårsaket av mitokondriell dysfunksjon og oppregulering av NADPH-oksidaser.
Renal Klotho-genekspresjon ble redusert i AA-gruppen, mens uttrykket av NAMPT og SIRTl var likt mellom gruppene. Klotho er et antialdringsgen som koder for et enkeltpasset transmembranprotein som fungerer som en aldringsdemper. Aldringsprosessen hos mus med Klotho-mangel lignet den hos mennesker, inkludert kortere levetid, infertilitet, arteriosklerose, hudatrofi, osteoporose og emfysem [22]. Hypomorfe mutante Klotho-mus viste også en fenotype av akselerert aldring, som ble gjenopprettet ved p16-ablasjon [23]. Siden Klotho er en viktig faktor i aldring, har Klotho genmodifiserte mus blitt mye brukt i forskning på aldring. Klotho-genmodifiserte mus kan imidlertid være upassende for forskning på nyrealdring på grunn av de systemiske aldringsassosierte svekkelsene til disse musene og det faktum at nyrefunksjonen er upåvist (dvs. kreatininnivåer). I motsetning til dette kan AAN-musemodellen brukes som en medikamentindusert modell for nyrealdring for forskningsformål, siden den har flere fordeler, for eksempel den relative enkle implementeringen og evnen til å estimere effektene av intervensjoner på nyrefunksjonen. .
Denne studien hadde noen begrensninger. Vi evaluerte nyrealdring, med fokus hovedsakelig på cellulær senescens, mitokondriell morfologi og aldringsrelatert genuttrykk. Mekanismene for aldring er imidlertid komplekse og forblir dårlig forstått. I tillegg, selv om Klotho-genekspresjonen ble redusert som respons på AA, kunne vi ikke demonstrere en årsakssammenheng med de patologiske endringene i AAN. Ytterligere studier er nødvendig for å bestemme rollene til de ulike molekylene som er involvert i utviklingen av AAN. Ikke desto mindre gir denne studien ny innsikt i bruken av Avan som en modell for aldring av nyrene. Det er viktig å merke seg at fenotypiske endringer inyreer sterkt assosiert med levetid. Selv omnyreer lett påvirket av aldringsassosierte endringer, kan hemming av nyrealdring forlenge den totale levetiden. Derfor kan videre forskning på nyrealdring ved bruk av modeller av AAN føre til økt levetid i fremtiden.
4. Materialer og metoder4.1. DyrDenne studien ble utført i samsvar med National Institutes of Healths retningslinjer for bruk av forsøksdyr. Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Studies Committee ved Yokohama City University (godkjenningsnummer: FA20-027) og ble utført i samsvar med ARRIVE-retningslinjene. Det ble gjort anstrengelser for å minimere antallet dyr som ble brukt og deres lidelse. Musene ble holdt i et kontrollert miljø under en {{1}t lys/12-t mørk syklus ved en temperatur på 25 grader C. Mus hadde fri tilgang til mat og vann.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREINFEKSJON
Åtte uker gamle C57BL/6 hannmus ble kjøpt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) og tildelt vehikelkontroll- eller AA-gruppene etter 1 ukes akklimatisering, mus ble administrert intraperitonealt med vehikel eller AA (Sigma) -Aldrich, St.Louis, MO, USA), som ble oppløst i en liten mengde dimetylsulfoksid. Før denne studien gjennomførte vi en foreløpig studie ved å bruke flere protokoller. Den første protokollen inkluderte administrering av AA (3 mg/kg) til C57BL/6-mus intraperitonealt to ganger i uken i 4 uker uten remodelleringstid; i denne protokollen forårsaket AA åpenbare akutte nyrelesjoner, for eksempel utvidede proksimale tubuli med tap av børstekant (tilleggsfigur S1). I den andre protokollen ble C57BL/6-mus administrert med AA (2,5 mg/kg) intraperitonealt en gang i uken i 4 uker etterfulgt av remodelleringstid i 4 uker; plasmakreatinin i disse musene var 0.19 ± {{20}}.080 mg/dL versus 0.18 ± 0.010 mg/dL (henholdsvis kjøretøykontroll versus AA; gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM), p=0.86, uparet Students t-test, n=4 per gruppe) og plasma UN var 31,3 ± 5,95 mg/dL versus 30,4 ± 3,87 mg/dL (henholdsvis kjøretøykontroll versus AA; gjennomsnitt ± SEM, p=0.90, uparet Students t-test, n=4 per gruppe). Derfor bestemte vi at denne protokollen ikke var egnet for en nyreskademodell fordi AA ikke induserte signifikant nedsatt nyrefunksjon. I den tredje protokollen ble C57BL/6-mus administrert med AA (3 mg/kg) intraperitonealt to ganger i uken i 10 uker uten remodelleringstid; i disse musene var dødeligheten i AA-gruppen 83 prosent (n=6), mens ingen av musene i vehikelkontrollgruppen døde (n=4). I denne protokollen kunne vi ikke statistisk evaluere nyrefenotypen indusert av AA på grunn av den høye dødeligheten. I den fjerde protokollen ble C57BL/6-mus administrert med AA (3 mg/kg) intraperitonealt to ganger i uken i 4 uker etterfulgt av remodelleringstid i 4 uker; kroniske nyreskader, som tubulointerstitiell fifibrose, og nedsatt nyrefunksjon ble observert hos disse musene [9]. Derfor, basert på resultatene av disse foreløpige undersøkelsene, vedtok vi den fjerde protokollen for å utføre eksperimentene i denne studien.
4.2.BP-målingSystolisk BP og hjertefrekvens ble målt ved å bruke den tidligere beskrevne halemansjettmetoden (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Japan)[24,25]. Alle målinger ble utført mellom 9:00 og 14:00. Minst 10 målinger ble utført i hver mus, og middelverdien ble brukt til analyse.
4.3. Sanntids kvantitativ PCR-analyse for omvendt transkripsjon Totalt RNA ble ekstrahert fra nyrevev ved bruk av ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan), og komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert ved bruk av SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Kvantitativ PCR-analyse for revers transkripsjon i sanntid ble utført ved bruk av CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), og revers transkripsjonsproduktene ble inkubert med TaqMan PCR Master Mix og en tilpasset TaqMan probe (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), som tidligere beskrevet [26]. TaqMan-prober mot følgende gener ble brukt: kollagen I(Mm00801666_g1), kollagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) og Nox2 (Mm00627011_m1).mRNA-nivåer ble normalisert til de for 18S ribosomalt RNA.
4.4. Western blot-analyse Proteinekspresjon ble analysert ved western blot-analyse av vevshomogenatene ved bruk av en tidligere beskrevet metode [27,28]. Totale proteinekstrakter ble fremstilt fra vevene ved å bruke natriumdodecylsulfatholdig prøvebuffer. Proteinkonsentrasjonen i hver prøve ble målt ved bruk av detergent-kompatible proteinanalysesettet (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) og NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), med bovint serumalbumin som standard. Like mengder proteinekstrakter fra vevsprøvene ble fraksjonert på 5-20 prosent polyakrylamidgeler (ATTO Corp., Tokyo, Japan). Separerte proteiner ble deretter overført til polyvinylidendifluoridmembraner ved bruk av Semi-Dry Transfer System (ATTO Corp., Tokyo, Japan). Membraner ble blokkert i 1 time ved romtemperatur med fosfatbufret saltvann inneholdende 5 prosent skummetmelkpulver. Membraner ble inkubert med primære antistoffer mot Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, Storbritannia), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, USA), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japan), og glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Membraner ble vasket og inkubert med sekundære antistoffer i 60 minutter ved romtemperatur. Stedene for antistoff-antigen-reaksjoner ble visualisert ved bruk av forbedret kjemiluminescenssubstrat (Merck, Kenilworth, NJ, USA). GAPDH ble brukt som belastningskontroll. Bildene ble analysert kvantitativt ved bruk av ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
4.5. Histologisk analyse ble utført som tidligere beskrevet [29]. Nyrevev fra mus ble fiksert med 4 prosent paraformaldehyd og deretter innebygd i parafin. Seksjoner (4 um tykke) ble farget med PAS- og MT-flekker. For å evaluere det glomerulære området ble 50 glomeruli per mus målt og gjennomsnittsberegnet. Alle bildene ble tatt med BZ-9000-mikroskopet (Keyence Corp., Osaka, Japan).
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRE DIALYSEN
4.6. SA- -al-farging Nyrevev fra mus ble raskt frosset og montert i en Optimal Cutting Temperature-forbindelse (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokyo, Japan). Seksjoner (4 μm tykke) ble forberedt ved bruk av en kryostat (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) og montert på glassplater. SA- -galaktivitet ble målt ved å bruke et senescensdeteksjonssett (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) i henhold til produsentens protokoller. Prøver ble sett under lyst felt ved ×100 forstørrelse ved bruk av BZ-9000mikroskopet (Keyence Corp.. 4.7.Electron MicroscopyElektronmikroskopianalyse ble utført som tidligere beskrevet [30]. Musene ble bedøvet med isofluran og perfusert gjennom høyre aortabue med heparinisert (5 U/mL) fysiologisk saltvann og 2,5 prosent glutaraldehyd i 0,1 mol/L fosfatbuffer ved pH 7,4. Prøver for transmisjonselektronmikroskopi ble nedsenket i 1 prosent osmiumtetroksid i 2 timer, serielt dehydrert i etanol og innebygd i en Epon-blanding. UlItrathin-seksjoner ble farget med uranylacetat og blysitrat og undersøkt ved hjelp av Hitachi H{10}}-transmisjonselektronmikroskopet operert ved 80 kV (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan). Snitt ble observert ved × 5000 forstørrelse og fotografert ved bruk av et ladekoblet enhetskamera.
4.8.Biokjemisk analyseBlodprøver ble tatt ved hjertepunktur i matet tilstand. Fullblodprøver ble sentrifugert ved 3000 rpm (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Japan) i 10 minutter ved 4 grader for å skille plasmaet. De resulterende plasmaprøvene ble lagret ved -80 grad. Kreatininnivåer i plasma, FN og urin ble målt ved bruk av Hitachi 7180 autoanalyzer (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan).
4.9. Statistisk analyse Statistiske analyser ble utført ved bruk av GraphPad Prism-programvare (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Den uparrede studentens f-test ble brukt til å sammenligne forskjellene mellom kjøretøykontroll- og AA-gruppene.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. KonklusjonerAA-administrasjon årsakernyresenescens, sammen med tubulointerstitiell fibrose og nyreatrofi. Resultatene tyder på at nyrefibrose er nært knyttet til nyrealdring og at AAN kan være nyttig som ennyre-spesifikk aldringsmodell.