Aryl hydrokarbonreseptoravhengige og uavhengige veier medierer antialdringseffekter av curcumin del 2
Jun 29, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
2.2.6. Dyrking av primær menneskelig EC
Human primær EC (Lonza, Köln, Tyskland) ble dyrket i komplett endotelbasalt medium (EBM) (Lonza, Köln, Tyskland) supplert med 1 ug/mL hydrokortison, 12 ug/mL bovint hjerneekstrakt, 5 0 ug/ ml gentamicin, 10 ng/ml human epidermal vekstfaktor og 10 prosent (o/v) føtalt kalveserum ved 37 grader og 5 prosent CO, inntil tredje passasje. Etter løsgjøring med 0,05 prosent (o/o) Trypsin/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Tyskland), ble cellene dyrket i 6 cm kulturskåler eller 6-brønns kulturplater i minst 18 timer før transfeksjon eller behandling.
2.2.7. Forbigående transfeksjon av EC
Celler ble transfektert som beskrevet tidligere [65]. Kort fortalt ble EC transfektert ved å bruke SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Overuttrykket eller knockdown av AhR ble oppnådd etter henholdsvis 24 eller 48 timer. Transfeksjonseffektiviteten ved overekspresjon var omtrent 40 prosent.
2.2.8. Scratch Wound Assay av EC
For undersøkelse av migrasjonskapasiteten til EC, ble skrapesåranalyser utført som beskrevet tidligere [66]. I detalj ble sår satt inn i et cellemonolag med en celleskraper langs en sporlinje. Etter skaden ble ikke-festede celler fjernet ved skånsom vasking.cistanche salsa ekstraktCurcuminbehandlingen ble utført rett etter at såret var satt. Cur-cumin ble oppløst i DMSO og brukt i sluttkonsentrasjonen på 7,5 uM. EC-migrering ble kvantifisert ved å farge cellene med 5 ug/mL 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) i PBS i 5 minutter etter at cellene var fiksert med 4 prosent (v/v) paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur. Bildene ble tatt med et Zeiss AxioVision Observer D1 fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland)) med en 200-forstørrelse. Celler migrert inn i såret fra sporlinjen ble automatisk talt ved bruk av partikkelanalysefunksjonen til Image]1.52a]67I etter at overlappende kjerner ble separert.
Cistanche kan anti-aldring
2.2.9. Immunfarging av EC
EC ble fikset med 4 prosent (o/v) paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur. Etter permeabilisering og blokkering i 0.3 prosent (o/o)Triton-X 100 og 3 prosent (o/u)normalt geiteserum i PBS, ble cellene inkubert med et kaninantistoff mot AhR(1:100, Abcam, Cambridge, Storbritannia) eller Nrf2 (klon D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Tyskland) fortynnet i 1 prosent (o/v) normalt geiteserum i PBS over natten ved 4 C. Deretter ble cellene vasket med PBS og inkubert med en Alexa 594-koblet geit-anti-kanin-IgG (1:500, Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i 1 time ved romtemperatur.cistanche stammeFor aktinfarging ble cellene inkubert med Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i 20 minutter ved romtemperatur. Kjerner ble motfarget med 0,5 ug/mL DAPI i PBS i 5 minutter ved romtemperatur og cellene ble montert med ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). Fluorescerende bilder ble tatt med et Zeiss AxioVision Observer D1 fluorescerende mikroskop, med 400× eller 200× forstørrelse.
2.2.10. qPCR i celler
Det totale cellulære RNA ble isolert ved å kombinere lysis i TRIzolTM med nedstrøms prosessering ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden, Tyskland)) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA-syntese ble utført ved bruk av QuantiTect9 omvendt transkripsjonssett （Qiagen （Hilden, Tyskland）） med 1 ug RNA i henhold til produsentens instruksjoner. Relative transkripsjonsnivåer ble bestemt ved PCR ved bruk av 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix og en Rotor-Gene Q termisk syklus (Qiagen (Hilden, Tyskland)). Transkriptet for det ribosomale proteinet L32 (rpl32) ble brukt som referanse, og det relative uttrykket ble beregnet ved AC-metoden [68]. Følgende Intron-spennende primerpar ble brukt:kapital (genaksessnummer NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gen tilgangsnummer NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(genaksessnummer NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(genaksessnummer NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}'.
2.3.Mus
2.3.1. Muselinjer og avl
Kvinne 8-12-uke gammel ("ung") og 18-måned gammel ("gammel") AHR-mangel B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al.,1996; referert til hit som AHR-KO)-mus ble avlet fram som heterozy-gotes i IULs dyreanlegg. Villtype kullkamerater ble brukt til kontroll. Mus ble avlet og holdt under spesifikke patogenfrie forhold på en 12/12 timer lys-mørke syklus og mottok standard chow(ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Tyskland) ad libitum. 2.3.2.qPCR i mus
Totalt RNA ble isolert fra organvev fra tre WT- og tre AHR-mangelfulle mus med TriZol[. Deretter ble 400 ng RNA revers transkribert ved å bruke revers transkriptase M-MLV (Promega, Madison, WI, USA) og tilfeldige heksamerprimere. Genekspresjonsnivåer ble målt i duplikat for hvert musevev på en Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Tyskland), i 15 μL sluttvolum, inneholdende 7,5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, Tyskland), 1 uM av hver primer ,1,5 μL cDNA og RNase-fritt vann. Primereffektiviteten var mellom 90 prosent og 146 prosent. Se tabell S2 for primersekvenser og effektiviteter. Ekspresjonsnivåer ble kalibrert til uttrykket av RPS6 som et husholdningsgen i samme prøve ved å bruke {{ 14}}CT-metode [69].
2.4.I Silico-analyser
Homologimodellering av CeAhR LBD
Den strukturelle modellen til C. elegans AhR LBD (rester 267-372) ble generert ved homologimodellering. Røntgenstrukturene til PASB-domenene til homologe bHLH-PAS-familiemedlemmer som deler den høyeste sekvensidentiteten (omtrent 20 prosent) med CeAhR PASB ble brukt som maler: de cirkadiske lokomotoriske utgangssyklusene kaput (KLOKKE, PDB: 4F3L), neuronalt PAS-domene-inneholdende protein 3(NPAS3, PDB:5SY7), de hypoksi-induserbare faktorene 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) og lo(HIFlo, PDB:4H6J). Modellen ble oppnådd med MODELLER[70-72].cistanche tubulosa fordeler og bivirkningerDen optimale modellen ble valgt blant de 10 genererte, basert på den beste DOPE SCORE [73]. Kvaliteten på modellene ble evaluert ved hjelp av PROCHECK [74]. Sekundære strukturer ble tilskrevet av DSSPcont [75]. Bindingshulen i de modellerte LBD-ene ble karakterisert ved å bruke CASTp-serveren [76]. Visualisering av modellene ble utført ved bruk av PYMOL[77].
2.5.Statistisk analyse
Med mindre annet er oppgitt, ble statistiske analyser utført i GraphPad Prism (versjon 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). For livs-/helsespennassays ble statistisk analyse utført ved bruk av OASIS[53]. Statistisk analyse av mikroarray-dataene ble utført i R (R Foundation (Wien, Østerrike)). Boksplott ble opprettet i GraphPad Prism (versjon 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) og viser medianen (linje), 25-75 persentil (boks) og 10-90 persentil (hårhår).
3. Resultater
3.1. Curcumin fremmer helsespenn på en AhR-avhengig og uavhengig måte
Tap av ahr-1 fremmer C.elegans' helse og levetid under basale tilstander[14] og det påvirker aldersrelaterte egenskaper negativt som respons på pattedyrs AhR-modulatorer, slik som benzo[a]pyren (BaP), UVB lys og mikrobiota [25]. Kostholdspolyfenoler, som curcumin, utgjør en viktig gruppe AhR-modulatorer fra pattedyr med langtidseffekter i C. elegans [78,79] og vi undersøkte derfor den levetidsforlengende effekten av curcumin for dets ahr-1 avhengighet. Curcumin forlenget reproduserbart og betydelig levetiden til C. elegans på en ahr{12}}avhengig måte (Figur 1A,B). Tidligere har vi vist at tap av ahr-1 også forlenger levetiden i modellene for Huntingtons sykdom og Parkinsons sykdom, med muskeloverekspresjon av henholdsvis aggregasjonsutsatt polyglutamin (polyQ40) og -synuklein ( -syn), mens kl. samtidig øke innholdet av proteinaggregater [25]. Interessant nok økte curcuminbehandling antallet polyQ40- og -syn-aggregater i samme grad som ahr-7 funksjonstap (figur 1C). Curcumin fremmet også levetid og bevegelsesevne i disse sykdomsmodellene (Figur 1DE), men effekten av ahr-1-tap og curcumin-tilskudd var additive i PolyQbackground (Figur 1D), og avslørte AHR-1-uavhengige beskyttelsesfunksjoner av curcumin i det minste i denne kompromitterte bakgrunnen.
Figur 1. Curcumin fremmer helse på en AHR-1-avhengig og uavhengig måte. Levetid (A) og helsespenn (B) kurver for DMSO- eller curcuminbehandlede wt og ahr-1 nematoder. Overlevelseskurver viser sammenslåtte data for 290-300 ormer/tilstand i 5 eksperimenter. Statistisk test:log-rank test, # signifikans vs. DMSO,*signifikans vs.wt, Bonferronip-verdi<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>
3.2.ugt-45 medierer antialdringseffektene av curcumin og ahr-1 uttømming
På jakt etter mulige nedstrøms ahr-1-avhengige effektorer av curcumin, tok vi målrettede og objektive tilnærminger. Vi undersøkte uttrykket av klassiske AhR-målgener fra pattedyr og fokuserte på Cyp-genene siden curcumin endrer uttrykket CyplA1 og CyplB1 i pattedyrceller [80,81]. Kvantifiseringen av 47 forskjellige cyps i C.elegans ved semi-kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) avslørte imidlertid at bare cyp-13B1 ble signifikant oppregulert enten av ahr-1-utarming eller av curcumin på en ahr-1-avhengig måte (figur S1A-B), mens de tre andre cypsene (dvs. cyp-13A5, cyp-13A8 og cyp-42A1) var økt med curcumin bare i fravær av ahr-1(Figur S1). Disse dataene, sammen med andre arbeider [25,82], tyder på at cyps sannsynligvis ikke er hovedmålene for CeAhR. Dette støttes også av vår transkriptomiske analyse i villtype- og ahr-1-mutanter. Faktisk, i samsvar med rollen til AHR-1 i nevronal bestemmelse [37,38,40,41], viste genekspresjonsendringene mellom villtype- og ahr-1-mutanter anrikning i prosesser knyttet til nevronal utvikling og differensiering og ingen store endringer i klassiske avgiftningsgener (Figur 2A).qPCR-analyse av noen av de mest opp- og nedregulerte genene mellom ahr-1(jul45) og villtype (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3) bekreftet deres ahr-1-avhengighet under basale forhold (Figur 2B), men verken UVB [25] eller curcumin (Figur 2C) påvirket uttrykket av disse genene signifikant. Vi lurte på om ekspresjonsendringene i disse genene er evolusjonært bevart og vurderte deres uttrykk i forskjellige vev (dvs. hjerne, lever, tarm og blod) av 8- og 18-måned gammel villtype og AhR KO mus. Noen gener viste en tendens til økt uttrykk hos unge(atf-2 homolog) eller gamle(lpr-4/5 homologer) mus på en vevsspesifikk måte, men verken et åpenbart mønster eller bevarte endringer var observert (Figur S2). Disse resultatene gjenspeiler mulige artsspesifikke forskjeller eller vevsavhengig AhR-transkripsjonsaktivitet hos pattedyr oversett av transkriptomisk analyse av hele dyr i C. elegans. En grundig undersøkelse av de mest differensielt uttrykte genene mellom C. elegans villtype og ahr-1(jul45) avslørte at uttrykket av mange av disse genene påvirkes i C.elegans under aldring og av diett-pattedyrs AhR-modulatorer ( f.eks. quercetin og resveratrol)[25], og antyder dermed en rolle for AHR-1 i polyfenolmodulert genuttrykk. I tråd med dette scenariet viste mikroarray-dataene at de fleste genene differensielt uttrykt ved curcuminbehandling faktisk ble regulert på en ahr-1--avhengig måte (Figur 2D; Tabell 1).cistanche tubulosa ekstraktAv 47 gener endret av curcumin i villtypen (43 opp- og 4 nedregulerte), ble bare 5 også indusert av curcumin i ahr-1(ju145). Blant genene regulert av curcumin på en AHR-1-avhengig måte var fase Il-enzymer, og interessant nok ble noen av dem (ugt-9 og ugt-29) regulert i samme retning av curcumin eller ved tap av ahr-1 (tabell 1). Derfor sjekket vi uttrykket deres og uttrykket til ytterligere ugts(ugt-45 og ugt-57) som ble differensielt uttrykt ved bruk av en mindre restriktiv statistisk analyse som ikke ble korrigert for flere sammenligninger. Av de undersøkte genene ble ugt-45 økt i ahr-1(ijul45) og ved curcuminbehandling (Figur 3A,B). Vi observerte også endringer i uttrykket av noen avgiftningsgener mellom villtype og AhR KO mus på en vevsavhengig måte. Det differensielle uttrykket av disse genene var høyest i hjernen, der Ugt2a3 (ugt-9 og ugt-29 i C.elegans) var ned- og Hpgds (gst-4 i C. elegans) ble oppregulert (Figur S3A). Det var ingen endring i ekspresjonen av noen av de testede genene i leverprøvene hos mus (figur S3B). I tråd med C,elegans-dataene viste den murine ugt-45-homologen Ugt3a2 en tendens til overekspresjon i tarmer fra Ahr KO-mus (figur S3C). Spesielt forhindret ugt-45 RNAi de gunstige effektene på livs- og helsespenn som ble fremmet av curcumin (figur 3C,D) eller ahr-1 uttømming (figur 3E,F), noe som indikerer at de to intervensjonene kan stole på felles modulert nedstrøms signalering for å fremkalle deres anti-aldringsaktivitet.
Figur 2. Gener differensielt regulert av curcumin er primært regulert på en ahr-1-avhengig måte.(A)Genontologi(GO)berikelse for biologiske prosesser etter GO-termfusjon i ahr-1 vs. wt. (B, C) Uttrykket av de sterkeste ned- og oppregulerte genene mellom wt og ahr-1 [25] ble vurdert ved qPCR i wt vs.ahr-1(B) og DMSO-vs . curcuminbehandlede nematoder (C). Boksplott viser data fra 3 eksperimenter. Uttrykket er vist i forhold til DMSO-behandlet vekt (stiplet linje). Statistisk test:1-vei ANOVA med Tukeys test for flere sammenligninger,*p-verdi<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">
Figur 3.ugt-45 er nødvendig for forlengelse av levetiden til curcumin og ahr-1-mutanter. (A, B) Genuttrykk ble vurdert ved qPCR i wt vs.ahr-1(A) og DMSO- vs. curcumin-behandlede wt nematoder (B). Boksplott viser data fra 3 eksperimenter. Uttrykket er vist i forhold til DMSO-behandlet vekt (angitt som en stiplet linje). Statistisk test: 2-Vei ANOVA med Sidaks test for flere sammenligninger, *p-verdi<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>
3.3. AHR-1 og curcumin beskytter uavhengig mot oksidativt stress
De fordelaktige egenskapene til polyfenoler tilskrives ofte deres evne til å beskytte mot reaktive oksygenarter (ROS)|83,84]. Siden AhR er involvert i oksidativt stress-medierte prosesser [85-87], lurte vi på om curcumin kan påvirke dyrs fysiologi via AhR-regulerte antioksidantresponser. Vi observerte at ahr-1-mutanter produserer mer mitokondriell(mt)ROS og har et redusert mitokondrielt membranpotensial (Figur 4A,B), to parametere som korrelerer med levetid [88,89]. Selv om de er i samsvar med mitohormesis-paradigmet ahr-1(jul45) produserer litt mer mtROS og lever lenger, var disse dyrene mer følsomme for oksidativt stress enn villtypen. Spesifikt var de skadelige effektene indusert av juglone og H2O2 på dyrenes hopping, motilitet og overlevelse signifikant sterkere i ahr-1(jul45) sammenlignet med villtypen (Figur 4C-F). Disse dataene tyder på at AHR-1-utarming har gunstige motoriske metiske effekter under basale forhold, mens dens tilstedeværelse er nødvendig for beskyttelse mot oksidativt stress, og dermed kobles fra to ofte korrelerende aldersrelaterte parametere, nemlig levetid og stressmotstand. I stedet forbedret curcumin betydelig H,O- og jugloneresistens i både villtype- og ahr-1-mutanter (Figur 4E,F), noe som tyder på at curcumin fremkaller en ahr-1-uavhengig antioksidantrespons. I samsvar med den ukoblede reguleringen av levetid og motstand mot oksidativt stress, påvirket ikke ugt-45-demping følsomheten for oksidativt stress verken for ahr-1-mutanter eller curcumin-behandlede dyr (Figur 4G).cistanche tubulosa anmeldelserCurcumin har således pro-longevity-effekter via ahr-1 og ugt-45, men beskytter mot oksidativt stress gjennom ahr-1-uavhengige mekanismer.
3.4. Nrf2/SKN-1 medierer de AhR-uavhengige effektene av curcumin
For ytterligere å evaluere AhR-curcumin-krysstale i ytterligere aldersrelaterte funksjoner, målte vi migrasjonskapasiteten i menneskelig primær EC - et kjennetegn for karfunksjonalitet, som avtar med alderen [90] og reduseres ved AhR-aktivering [14]. I tråd med antialdringsaktiviteten til ahr-1-undertrykkelse og curcumin, ble AhR-overekspresjon betydelig hemmet, mens curcumin økte, migrasjonskapasiteten til primær human EC (Figur 5A). Merk at induksjonen av migrasjonsevne av curcumin var sammenlignbar i tomme vektor- eller AhR-ekspresjonsvektortransfekterte celler (figur 5A). Imidlertid ble migrasjonen av curcumin-behandlede celler betydelig redusert av AhR-overekspresjon: curcumin induserer i tomme vektortransfekterte celler opptil 60 migrerte celler per høyeffektfelt, mens i AhR-overuttrykkende celler bare opptil 25 celler per høyeffektfelt (figur 5A). Disse dataene antyder at den pro-migrerende effekten av curcumin er modulert av AhR-uavhengige mekanismer, men muligens også av en reduksjon i AhR-aktivitet. Vi bestemte deretter intracellulær AhR-distribusjon og uttrykket av cVplal i curcumin-behandlet humant EC, Curcumin påvirket ikke AhR-nukleær translokasjon (Figur 5B) eller cyplal uttrykk (Figur 5C). På jakt etter veier modulert av curcumin på en AhR-uavhengig måte, vendte vi tilbake til nematode transkriptomiske profiler for å finne transkripsjonsfaktorer som regulerer gener signifikant modulert av tap av ahr-1 eller ved curcuminbehandling i villtype dyr (tabell 1 ). Dette i silico-søk identifiserte redoks-transkripsjonsfaktoren SKN-1, ortologen til human Nrf2 (kjernefaktor erytroid 2-relatert faktor 2), hvis aktivering av curcumin [91] ofte rapporteres som en mulig mediator av dens antioksidantaktivitet [92,93]. Følgelig er prototypen C.elegans Nrf2/SKN-1-avhengig genet, gst-4, overuttrykt i alhr-1-mutanten [25] og indusert av curcumin i villtype og enda mer i ahr-1 mutanter (figur 5D). Dessuten økte curcumin stabilisering og kjernefysisk translokasjon av Nrf2 i primær human EC (Figur 5E) og induserte ekspresjonen av mangansuperoksiddismutase (Sod2) - et klassisk Nrf2 målgen - i cellene transfektert med en tom vektor eller i celler der AhR dempes av shRNA (Figur 5F). Mangelen på Sod2-induksjon av AhR shRNA i EC kan skyldes en delvis reduksjon (50 prosent) i uttrykket (figur S3D), som kanskje ikke er tilstrekkelig til å utløse aktiveringen av Nrf2 eller av ytterligere transkripsjonsfaktor (TF), som , i C.elegans, kan stemme overens med induksjonen av gst-4 [94]ved fullstendig AhR-utarming. Interessant nok ble Hpgds, en homolog av C.elegans gst-4, betydelig økt i hjernen til AhR KO-mus (Figur S3A), men det er ikke et mål for Nrf2. Ytterligere bevis for mulig Nrf2/SKN-1 uavhengig signalering aktivert av ahr-1 uttømming er at aktiveringen av gst-4 av curcumin blir fullstendig undertrykt av hud-7 RNAi i C.elegans villtype, mens ahr-1-mutanter fortsatt induserer gst-4 til tross for hud-1-utarming (Figur 5G, H). Imidlertid reduserte hud-1 RNAi motstand mot oksidativt stress i både villtype og ahr-1(ju145)(Figur 5I). Uventet påvirket ikke demping av hud-1 juglonemotstanden til curcuminbehandlede dyr (figur 5I). Dataene våre avslører et komplekst scenario der curcumin fremmer forskjellige antialdringsfunksjoner, enten avhengig av AhR-avhengig eller AhR-uavhengig, men Nrf2/SKN-1-avhengig (og ekstra) signalering.
Figur 4. AHR-1 og curcumin beskytter uavhengig mot oksidativt stress. (A) Representative bilder (venstre) og DSRed intensitetskvantifisering (høyre) i MitoSOX-fargede wt eller ahr-1 nematoder. Boksplott viser sammenslåtte data fra 129-135 ormer/forhold i 3 eksperimenter. (B) Mitokondriemembranpotensialet ble vurdert ved TRME-farging i nematoder i angitte aldre. Representative bilder (til venstre) og kvantifiseringen av TMRE-fluorescensen (til høyre) presenteres. Boksplott viser sammenslåtte data fra 3 eksperimenter.(C,D) Pharyngeal pumpeaktivitet(C) og motilitet(D) av wt og ahr-1 mutanter etter H2O2-behandling. Boksplott viser sammenslåtte data fra 39-54(C) eller 35-36 ormer/tilstand (D)i 3-4eksperimenter.*p-verdi<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">
Figur 5. Curcumin aktiverer Nrf2/SKN-1 uavhengig av AhR.(A) Skrapesåranalyse i curcumin (cur)- eller DMSO-behandlet human primær EC transfektert med en tom vektor(EV) eller en ekspresjonsvektor for menneskelig AhR. Øvre panel: representative bilder; den stiplede linjen representerer migreringsstart. Målestokk: 100 um. Nedre panel: kvantifisering; boksplott viser data fra 4-6eksperimenter. Statistisk test:1-måte ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>
3.5. Curcumin og pro-oksidanter viser motsatte effekter på AHR-1 aktivitet
I samsvar med antialdringseffekten av redusert AhRekspresjon/aktivitet, tyder våre data på at curcumin kan forlenge levetiden til C.elegans ved å undertrykke AHR-1-regulerte veier gjennom reduksjon av AHR-1 uttrykk/aktivitet eller handling på vanlige nedstrøms signalveier. Derfor prøvde vi å kvantifisere AHR-1-aktivitet i C.elegans, men mange forsøk på å evaluere AHR-1-ekspresjon og subcellulær lokalisering ved å bruke antistoffer (mot pattedyrs AhR eller tilpassede antistoffer mot CeAhR) eller fluorescensmerkede reportere (OP562, UL1709, ZG93) ga ikke meningsfulle bevis. Med tanke på at AHR-1 binder seg til XRE in vitro [35], tenkte vi å bruke XRE-drevet genuttrykk som en avlesning for AHR-1-aktivitet. Derfor vendte vi oss til apeavledede Cos7-celler, som ikke uttrykker endogen AhR og dermed ikke viser noen endogen AhR-aktivitet [95,96] og kan utnyttes til å overvåke XRE-drevet Luciferase-induksjon som en avlesning for AHR-1 aktivitet (Larigot et al.; sendt inn sammen med denne studien). Når Cos7-celler ble co-transfektert med vektorer som uttrykker C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 og en luciferasekoblet XRE-holdig promoter av det humane CYPIA1-genet [64] AHR{ {27}} viste lav aktivitet under basale (kjøretøybehandlede) tilstander. Det er verdt å merke seg at behandling med curcumin eller andre næringsmidler som fremmer sunn aldring hos C.elegans, som lutein [97] og resveratrol [98,99], undertrykte AHR-1-aktiviteten betydelig (Figur 6A-C). I stedet påvirket ikke BaP og leflunomid, kjente AhR-aktivatorer hos pattedyr, AHR-1-aktivitet (Figur 6A,B) ved konsentrasjonene vi brukte. Spesielt ble AHR-1-aktivitet opphevet i Cos7-celler transfektert med en vektor som uttrykker ahr-1(jul45)-allelen i stedet for villtype-allelen (Figur 6A-C), noe som tyder på at jul45 er en sann tap av funksjon allel og at den målte luciferaseintensiteten skyldes funksjonell AHR-1.
Vi forsøkte deretter å undersøke om curcumin reduserer aktiviteten til AHR-1 ved direkte binding eller indirekte modulering. Til dags dato har ingen ligander av C.elegans AHR-1 blitt identifisert, og siden det ikke er tilgjengelig informasjon om dens LBD, utførte vi en in silico-analyse for å karakterisere den. De to AHR-1-isoformene, la og 1b, ble justert og selv om de var forskjellige i lengde, er deres PASB-domenesekvens identisk. Denne sekvensen ble deretter justert til PASB-domenet til Drosophila melanogaster, og til de til to AhR-er fra virveldyr som det tidligere ble generert strukturelle modeller for, nemlig mus (Mus musculus)[100] og sebrafisk (Danio rerio)[101](Figur) 6D). Justeringen viste klare forskjeller mellom arter med den viktigste særegenheten til virvelløse dyr med sekvensdelesjoner i den mest variable regionen i PAS-domenet, tilsvarende den fleksible regionen, inkludert spiralbunten (C , D , E-helikser) og de korte løkkene som forbinder disse elementene (Figur 6D,E). Disse slettingene kan redusere den tilgjengelige plassen i bindingshulen til disse AhR-ene. Vi genererte deretter en 3D-modell av AHR-1 PASB ved homologimodellering. Denne modellen presenterer den typiske PAS-folden, men med en kortere Do-helix sammenlignet med andre AhR-er. Imidlertid har det indre hulrommet noen særegenheter; den inneholder flere hydrofobe rester og er avkortet i to av noen indre sidekjeder. Spesielt er H365 og H274 dekket og kan danne en hydrogenbinding i midten av hulrommet; Y332-, L363- og L302-sidekjedene kan dessuten blokkere hulrommet, og redusere det indre rommet som er tilgjengelig for ligander (Figur 6E). Dette lille og avkortede hulrommet tillater mest sannsynlig ikke binding av store ligander (f.eks. TCDDor curcumin). I likhet med AHR-1-strukturmodellen viste en modell av sebrafisken zfAhRla at LBD-hulen er avkortet sammenlignet med de TCDD-bindende paralogene zfAhR1b og zfAhR2 [101]. Små og fleksible ligander, som leflunomid, binder og aktiverer zfAhRla, men leflunomidkonsentrasjonen vi testet aktiverte ikke AHR-1 i Cos7-cellesystemet vårt (Figur 6B). Vi lurte så på om mutasjoner i aminosyrer som er ansvarlige for det lille hulrommet i LBD kan tillate klassiske ligander å aktivere CeAhR. CeAhR L363-resten (Figur 6D) tilsvarer A375 i mAhRb-I og V375 i Madrid, og denne resten har stor innvirkning på ligandbinding [102]. På samme måte bidrar T386 av zfAhRla (Figur 6D), matchende til A375 i mAhRb-1 og A386 i zfAhR1b og zfAhR2, til mangelen på TCDD-binding av zfAhRla og, når mutert til alanin, gjenoppretter sensitiviteten når YTCDD også er 6H9. introdusert [101]. Aminosyren Y296 er allerede et histidin i C.elegans(H274). Dermed muterte vi bare leucinet i posisjonen L363 i CeAhR-vektoren til en alanin (L363A) (Figur 6D, E indikert med en pil). Dessuten muterte vi det nærliggende histidinet i posisjon H365 til glutamin (H365Q), som er Q377 i mus (Figur 6D, E indikert med en pil) siden det sannsynligvis danner en hydrogenbinding med H274 og kan bidra til det lille hulrommet til AHR { {49}} (Figur 6E). Vi testet deretter om pattedyrs AhR-ligander påvirker AHR-1-aktiviteten når L363 og H365 er mutert. Imidlertid opphevet disse endringene, i stedet for å gjenopprette respons på xenobiotiske ligander som i sebrafisk [101], til og med den basale AHR-1-aktiviteten, lik ju145-allelen (Figur 6F). Disse resultatene viser klare forskjeller mellom LBD-ene til C.elegans og sebrafisk, men viser at LBD er grunnleggende for basal AHR-1-aktivitet. Sammen med tidligere studier [35,38,82] antyder resultatene våre at AHR-1 sannsynligvis ikke er involvert i den klassiske xenobiotika-induserte transaktiveringsresponsen, som derfor kanskje ikke er relevant for ahr-1-regulert fysiologisk aldring. I stedet kan planteavledede forbindelser utøve konserverte effekter, i det minste delvis via undertrykkelse av AHR-1-modulerte veier. 3D-modellen vår antyder at curcumin ikke modulerer AHR-1-aktivitet ved å binde LBD. Derfor kan undertrykkelsen av AHR-1-aktivitet av curcumin skyldes dets antioksidanteffekt. I samsvar med denne muligheten, og den økte følsomheten til C.elegans ahr-1-mutantene for oksidativt stress, fant vi ut at AHR-1-aktiviteten faktisk økes av ROS-induserende midler. Cos7-celler behandlet med pro-oksidanten rotenon viste nemlig økt AhR-aktivitet når de ble transfektert med enten C.elegans eller murin AhR, men ikke når de ble transfektert med jul45-allelen eller allelet med LBD-mutasjoner (Figur 6G,H).
Totalt sett, mens CeAhR-aktivering beskytter mot oksidativt stress tidlig i livet, motvirker dets reduserte uttrykk aldring og medierer den gunstige antialdringseffekten av curcumin (figur 7). Curcumin kan dermed bidra til å balansere redoks-TF-aktivering på en kontekst- og tidsavhengig måte og favorisere AhR-undertrykkelse direkte gjennom sin antioksidanteffekt og/eller gjennom aktivering av Nrf2/SKN-1 (eller annen TF), som kan samtidig mediere anti-aldringsaktiviteten til curcumin.
Figur 6. Curcumin og pro-oksidanter har motsatt effekt på AHR-1 aktivitet. (AC)Evaluering av AHR-1-aktivitet etter behandling med de angitte forbindelsene i Cos7-celler transfektert med enten wt AHR-1(wt) eller AHR-1 som bærer ju145-punktmutasjonen(ju145) og AHA-1 samt en XRE-induserbar luciferase. Boksplott viser data for 3-5eksperimenter.* p-verdi<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">
Figur 7. Foreslått modell av AHR-1-signalveien i C.elegans respons på pro- og antioksidanter. Under "normale" forhold (midtpanel) aktiveres AHR-1 av intracellulær ROS. Dette fører til utskillelse av chaperonene fra cytosolisk AHR-1 og den påfølgende nukleære translokasjonen av AHR-1. I kjernen danner AHR-1 en heterodimer med AHR-kjernetranslokatoren (AHA{ {7}}) og binder seg til XREs av målgener, noe som igjen fører til reduksjon i intracellulære ROS-nivåer. Under disse forholdene fører tap av ahr-1-funksjon til økt levetid. I nærvær av antioksidanter (venstre panel), er de intracellulære ROS-konsentrasjonene lave, noe som fører til at AHR-1 befinner seg i cytoplasmaet, bundet av dets kofaktorer. Hemming av den basale AHR{10}}-aktiviteten fører til økt levetid. I nærvær av prooksidanter (høyre panel) aktiveres AHR-1 av overdreven ROS, noe som resulterer i kjernefysisk translokasjon, AHR-1-AHA-1-heterodimerdannelse og initiering av målgentranskripsjon. I ahr-1 KO fører den reduserte avgiftningen av ROS gjennom AHR-1-induserte målgener til en akkumulering av ROS og gjør ahr-1 KO mottakelig.
4. Diskusjon
AhR ble opprinnelig oppdaget hos pattedyr for sin xenobiotiske responsaktivitet indusert ved binding av miljøgifter eller endogene ligander, men modulatorer som ikke er avhengig av ligandbinding eksisterer også, men er mye mindre undersøkt. C.elegans representerer en unik modellorganisme for å undersøke AhR-aktiviteter uavhengig av dens klassiske xenobiotiske respons siden CeAhR ikke binder prototype AhR-ligander [35,39]. Ved å bruke denne modellen identifiserte vi en evolusjonært bevart funksjon for AhR i aldringsprosessen [14] og viste at noen av pattedyrs AhR-modulatorer (dvs. bakterier, Bal og UVB) påvirker aldringsparametere gjennom AHR-1 i en kontekstavhengig måte [25]. Her fulgte vi opp våre tidligere funn med en mer mekanistisk undersøkelse av AhR-regulerte aldringsfunksjoner på tvers av arter av kosttilskuddet polyfenol curcumin. Våre kombinerte in vivo-, in vitro- og silico-analyser avslørte et nytt og komplekst scenario: mens curcumin fremmer antialdringsfunksjoner i nematoder og menneskelig primær EC, i det minste delvis på en AhR-avhengig måte, er antioksidanteffektene i begge arter avhengige av på AhR-uavhengige, men først og fremst Nrf2/SKN-1-avhengige mekanismer.
Vi viste for første gang at curcumin forsinket C.elegans' fysiologiske aldring på en AHR-1-avhengig måte. På leting etter mulige nedstrøms ahr-1-avhengige effektorer av curcumin, brukte vi målrettede og objektive tilnærminger og fant at flertallet av differensielt regulerte gener ved curcuminbehandling er regulert på en AHR-1-avhengig måte. Dessuten viste mange av disse genene et lignende uttrykksmønster i AHR-1-utarmede og curcuminbehandlede dyr, noe som tyder på at curcumin fremmer levetidsforlengelse via undertrykkelse av AHR-1-aktivitet. Overraskende nok indikerte verken den målrettede eller den transkriptomiske analysen en viktig rolle for klassiske AhR-målgener som kopper, som i stedet i stor grad ble funnet å være underuttrykt i nevroner (Larigot et al.; sendt inn sammen med denne studien). Interessant nok kan disse funnene indikere at transkriptomikk fra hele dyr kan maskere de nevronspesifikke effektene av AhR, i dette spesifikke tilfellet gjennom cps-gener. Vi fant at blant de differensielt uttrykte genene, tilhører mange fase II-avgiftningsenzymer, som tarm-45, som ble økt ved både ahr-1-utarming (og i hjernen til AhR KO-mus) og curcuminbehandling for å formidle deres levetidsforlengelse. I stedet økte curcuminbehandling og ahr-1-utarming uttrykket av et annet fase-II-avgiftningsenzym, GST-4, gjennom forskjellige mekanismer: førstnevnte er avhengig av, mens sistnevnte hovedsakelig er uavhengig av, Nrf2/ SKN-1, en klassisk redoks-TF som induserer GST-4 ved oksidativt stress i C.elegans [103]. Dessuten, mens curcumin induserer Nrf2/SKN-1-avhengige responser i C.elegans (GST-4-uttrykk) og menneskelig primær EC (Sod2-uttrykk og migrasjonskapasitet), beskytter det også C.eleans mot oksidativt stress i en SKN-1-uavhengig måte. Hos C.elegans kan ikke curcumin forlenge levetiden i svært syke hud-1(zu67) mutanter [104], mens GST-4 kan induseres på en SKN-1-uavhengig måte ved EGF-signalering [94] og krysstale mellom EGF-banen og AhR ble rapportert hos pattedyr [105].
Interessant nok, og i motsetning til villtype-stammen, observerte vi en AHR-1-uavhengig effekt av curcumin på helsespennet i nematodemodeller for henholdsvis Huntingtons og Parkinsons sykdom. Hos disse stammene økte curcuminbehandling antallet proteinaggregater i samme grad som AHR-1-mangel, noe som indikerer enten en beskyttende effekt av selve proteinaggregeringen og/eller curcuminaktivering av veier som beskytter mot proteinaggregering uavhengig av en/ hr-1 uttømming. Påvirkningen av curcumin på proteinaggregering er kontroversiell: det ble vist å hemme fibrilldannelse, men også å binde pre-fibrillære/oligomere arter av amyloidogene proteiner, og dermed akselerere deres aggregering og redusere den generelle nevrotoksisiteten [106]. Merk at koffein, som også beskytter mot trekk ved kardiovaskulær aldring [66,107], forhindrer også A-indusert lammelse uten å redusere A-aggregater, men gjennom aktivering av den beskyttende Nrf2/SKN-1-avhengige banen [108]. Det vil være viktig å vurdere om den beskyttende effekten indusert av curcumin eller all-1 uttømming i C.elegans sykdomsmodeller er mediert av mekanismer som fremmer fjerning av oligomere/pre-fibrillære arter til mindre giftige aggregater og/eller av aktivering av andre mekanismer, som Nrf2/SKN-1, som samtidig kan beskytte mot proteotoksisitet. Merk at avgiftningsenzymer kan inneholde både XRE og ARE (antioksidantresponsive elementer), og et samspill mellom Nrf2/ARE og AhR/XRE regulert signalering er beskrevet [109]. Det vil derfor være interessant å avklare hvordan curcumin fremmer sine forskjellige gunstige anti-aldringseffekter gjennom balansen mellom Nrf2 og AhR-regulert signalering.
Våre kombinerte tilnærminger viste at curcumin hemmer AHR-1-aktivitet. Hos pattedyr ble det antydet at den AhR-hemmende effekten av curcumin er mediert av direkte LBD-binding [110] eller hemming av proteinkinase C som fosforylerer AhR [79]. En annen studie indikerte at transkripsjonsaktiviteten til AhR er avhengig av den cellulære redoksstatusen og kromatinstrukturen, som begge er påvirket av curcumin [111]. Mens AHR-1 ikke binder TCDD, binder det XRE in vitro[36], men systematiske studier, som tar for seg potensialet til polyaromatiske hydrokarboner, eller andre pattedyrs AhR-ligander til å modulere AHR-1, mangler først og fremst pga. mangelen på egnede verktøy for å vurdere det. Våre studier forsøker å fylle dette gapet og utnytte Cos7-celler som uttrykker AHR-1 koblet til luciferaseanalyser (Larigot et al.; sendt inn sammen med denne studien) og i silicomodellering av C. elegans LBD, avslørte at curcumin undertrykker AHR -1 aktivitet, men sannsynligvis ikke ved direkte LBD-binding. In vitro-analysen som ble brukt i vår studie bekreftet at CeAhR ikke aktiveres gjennom den klassiske xenobiotika-signaleringen. Likevel ville det ikke avsløre aktiviteter på grunn av AhR-binding til andre DNA-sekvenser enn den "klassiske" XRE funnet i CYP1A1, slik som polyfenol(quercetin)-responsiv XRE funnet i PON1 [112,113]. Immunfarging i human primær EC argumenterer også mot curcumin-induserende AhR-kjernetranslokasjon, som sammen med den fremmende effekten av migrasjonskapasiteten i AhR-overuttrykkende celler, også kan indikere at curcumin undertrykker AhR-aktivitet.
Vi foreslår at den hemmende effekten av curcumin, snarere enn å stole på AhR-binding, involverer dets antioksidantevne, som faktisk kan være assosiert med, eller til og med avhenge av, aktiveringen av Nrf2/SKN-1. Pattedyr AhR aktiveres av ROS via LBD-uavhengig oksidativ modifikasjon [85], men våre data viser at induksjonen av AHR-1-aktivitet av pro-oksidanten rotenon krever LBD. En indirekte mekanisme for ROS-mediert AhR-aktivering er dannelsen av den potente AhR-liganden FICZ [114]. Likevel er FICZ et stort plant molekyl som, i henhold til vår in silico-modell, ikke ville passe til AHR-1 LBD. Selv om den nøyaktige mekanismen som AHR-1-aktivitet fremmes av ROS og hemmes av curcumin (enten via direkte ROS-slukking eller indirekte via aktivering av Nrf2 eller andre antioksidantregulerende gener) gjenstår å fastslå, støttes dette sterkt av vår funn: AHR-1 aktiveres av rotenon, og ahr-1-mutanter viser mer mtROS, redusert mitokondriemembranpotensial og er mer følsomme for H, O og juglone samt for UVB og BaP [25] , som begge produserer ROS[115,116]. I denne sammenhengen er det interessant å merke seg at ahr-1-mutanter viser mild endring av mitokondrielle funksjoner, som ligner på mitohormesis [117. Dette antyder at all-1 uttømming (og mulig curcumin ved å hemme AHR-1) kan fremme helsespenning gjennom mild mitokondrielt stress, som er kjent for å forlenge C.elegans levetid gjennom avgiftningsgener som moduleres på samme måte i den andre-1 {20}} mutanter [118,119]. Om Nrf2/SKN-1 og mitokondrier spiller en rolle i modulering av AHR-1-aktivitet ved curcuminbehandling er dessuten en interessant mulighet som gjenstår å validere.
Totalt sett, ved å dra nytte av de mange funksjonene som tilbys av nematoden C.elegans for in vivo-studier, foreslår vi at den forfedres funksjonen til AhR kan være i reguleringen av fase-ll-enzymer relatert til antioksidant i stedet for fremmedfrekvente responser. I motsetning til de skadelige effektene indusert av høye nivåer av ROS, kan de gunstige effektene fremmet av AhR-mangel være mediert av mild mitokondrie-stress og/eller mild ROS-produksjon (mitohormesis), som også er avhengig av Nrf2/SKN-1. Vi gir også sterke bevis for interaksjonen mellom curcumin og AhR. Curcumin-hemming av AhR-signalering er evolusjonært bevart og er sannsynligvis ikke mediert av binding til AhR LBD, men snarere gjennom curcumins ROS-fjernende egenskaper eller aktivering av Nrf2/SKN-1. Nrf2-signalveien kan faktisk aktiveres av curcumin på forskjellige måter [91]. Til slutt viste dataene våre at curcumin fremmer antialdringseffekter også på en uavhengig måte i både C.elegans (økt GST-4-uttrykk og motstand mot oksidativt stress) og menneskelig primær EC (økt Sod2-uttrykk og migrasjonskapasitet) ), som også kan forklare de additive effektene av curcumin og tap av AHR-1-funksjon på helsespennet til dyr som uttrykker polyQ.
5. Konklusjoner
Avslutningsvis, gjennom en original kombinasjon av in silico-, vitro- og in vivo-tilnærminger, viste vi at mens CeAhR-aktivering beskytter mot oksidativt stress tidlig i livet, motvirker dets reduserte uttrykk aldring og medierer den gunstige antialdringseffekten av curcumin (Figur 7) . Curcumin kan dermed bidra til å balansere aktiviteten til forskjellige transkripsjonsfaktorer involvert i avgiftning/antioksidantresponser (undertrykke AhR og aktivere Nrf2) under forhold der disse endres (øke AhR og redusere Nrf2/SKN-1), som aldring eller aldersrelaterte lidelser. Arbeidet vårt tilfører et ytterligere nivå av kompleksitet til de allerede enorme multifunksjonelle og kontekstspesifikke aktivitetene til AhR, med viktige konsekvenser for organismens helse og levetid. Dessuten åpner det døren for ytterligere studier, ved å bruke nematodesystemet til å oppdage og undersøke forfedres funksjoner til AhR, som er mindre sannsynlig å bli identifisert hos pattedyr.
Denne artikkelen er hentet fra Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants