Aryl hydrokarbonreseptoravhengige og -uavhengige veier medierer curcumin anti-aldringseffekter
Jun 28, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Abstrakt:Arylhydrokarbonreseptoren (AhR) er en ligandaktivert transkripsjonsfaktor hvis aktivitet kan moduleres av polyfenoler, slik som curcumin. AhR og curcumin har evolusjonært bevarte effekter på aldring. Her undersøkte vi om og hvordan AhR medierer antialdringseffektene av curcumin på tvers av arter. Ved å bruke en kombinasjon av in vivo, in vitro og silico-analyser demonstrerte vi at curcumin har AhR-avhengige eller uavhengige effekter på en kontekstspesifikk måte. Vi fant at i Caenorhabditis elegans medierer AhR curcumin-indusert levetidsforlengelse, mest sannsynlig gjennom en ligand-uavhengig hemmende mekanisme relatert til dens antioksidantaktivitet. Curcumin viste også AhR-uavhengige antialdringsaktiviteter, som beskyttelse mot aggregeringsutsatte proteiner og oksidativt stress hos C.elegans og fremme av migrasjonskapasiteten til humane primære endotelceller. Disse AhR-uavhengige effektene er i stor grad mediert av Nrf2/SKN-1-veien.
Nøkkelord:arylhydrokarbonreseptor; curcumin; oksidativt stress; Caenorhabditis elegans; mus; endotelceller; in vivo; in vitro; i silico
1. Introduksjon
Arylhydrokarbonreseptoren (AhR) er en allestedsnærværende ligandaktivert transkripsjonsfaktor identifisert som en determinant for den toksikologiske responsen på 23,7,8-tetraklordibenzo-p-dioksin (TCDD) hos pattedyr [1]. AhR-signalveier er godt beskrevet i pattedyrceller. Kort fortalt er ikke-ligandert AhR lokalisert i cytoplasmaet og stabilisert av forskjellige kofaktorer, slik som 90-kDa varmesjokkprotein (Hsp90), det AHR-interagerende proteinet (AIP) og chaperone p23. Binding til eksogene (f.eks. TCDD) eller endogene (f.eks. kynurenin) ligander fremmer translokasjonen av dette komplekset inn i kjernen, der AhR dissosierer fra dets kofaktorer og samles i en heterodimer med AHR nuclear translocator (ARNT). Det resulterende AHR/ARNT-komplekset binder seg til de xenobiotiske responsive elementene (XRE) i et batteri av responsive fase I og II avgiftningsgener, noe som til slutt fører til nedbrytning av liganden [2]. Bortsett fra dens rolle i xenobiotisk respons, fungerer for AhR i en rekke patofysiologiske prosesser, alt fra immunitet [3,4], betennelse [5,6], lipid- og glukosemetabolisme [7,8] til kardiovaskulær, lever og andre organsykdommer [9-12], har blitt oppdaget de siste tiårene. Økende bevis peker også på ulike og tilsynelatende motstridende roller til AhR i aldringsprosessen, som likevel kan forenes, tatt i betraktning vevs-, dose- og artsspesifikke effekter [13].cistanche genghis khanEn negativ rolle for AhR i aldring og aldersassosierte funksjoner har blitt beskrevet på tvers av arter [14,15]. Sammenlignet med villtypen Caenorhabditis elegans har AhR-mutantstammen,ahr-1(ju145), en utvidet levetid og helse; hos mus forbedrer AhR-mangel karfunksjonen og øker aktiviteten til nitrogenoksidsyntasen og derfor NO-biotilgjengeligheten; og til slutt ble det funnet en positiv korrelasjon mellom AhR-uttrykk og karstivhet hos middelaldrende og eldre mennesker [14]. Videre, i en epidemiologisk studie på en kinesisk befolkning, var AhR-uttrykk relatert til forekomsten av koronar arteriell sykdom [16].
Cistanche kan anti-aldring
Merk at mange forbindelser som påvirker aldring eller aldersrelaterte sykdommer [17-19] kan modulere AhR-aktivitet [20-22]. Mens aktivering av AhR av xenobiotika fører til forskjellige kreftformer hos pattedyr [23,24], ble kostholds- og miljøfaktorer vist å ha motsatte AhR-avhengige effekter på C.elegans' helsespenn [25]. Blant diett-AHR-modulatorene har polyfenoler som curcumin i stor grad blitt studert for deres helsefremmende effekter. Curcumin er et gult pigment fra Curcuma longa, med en rekke evolusjonært bevarte fordelaktige egenskaper, inkludert antioksidanter, anti-inflammatoriske og anti-aldringsaktiviteter [26]. Curcumin forhindrer proteinaggregering og øker levetiden hos C.elegans og Drosophila via modulering av proteinhomeostase [27-29].cistanche levetidsforlengelseDessuten, når den ble administrert til en transgen musemodell for Alzheimers sykdom, reduserte den den totale amyloid-beta(A)-belastningen betydelig [30]. Hos gamle mus gjenopprettet curcumin NO-biotilgjengeligheten, og reduserte dermed oksidativt stress og forbedret endotelial dysfunksjon og arteriestivhet vurdert ved aortapulsbølgehastighet (PWV) - en av de viktigste kliniske målingene eller markørene for stor elastisk arteriestivhet [31]. Flere studier på mennesker viste også en beskyttende effekt av curcumin på kardiovaskulær helse [32]. Virkningsmåten til curcumin er imidlertid fortsatt stort sett uklar, og enda viktigere, om dets gunstige helseeffekter formidles av AhR har ikke blitt undersøkt [33.34]
Modellorganismer, som nematoden C.elegans, har vært medvirkende til å identifisere de genetiske og miljømessige determinantene for aldring. Dette skyldes dens mange fordelaktige egenskaper, inkludert dens enkle laboratoriehåndtering, korte levetid og produksjon av et stort antall avkom ved selvbefruktning. C.elegans'genom er fullstendig sekvensert, og de fleste av dets gener og veier er evolusjonært bevart. Proteinsekvensen til AhR er bevart under evolusjonen, og i C.elegans er ortologene til AhR og ARNT kodet av AhR-relaterte (ahr-1) og ahr-1 assosiert(aha{{4 }}) gener, henholdsvis [35]. De korresponderende proteinene, AHR-1 og AHA-1, deler omtrent 40 prosent av sin sekvensidentitet med pattedyrene og danner en heterodimer (også med pattedyrmotpartene), som kan binde XRE-ene til målet gener in vitro [36].cistanche nzAHR-1 kommer for det meste til uttrykk i nevroncelletyper, slik som GABAergiske nevroner [37l, og det spiller en nøkkelrolle i å kontrollere nevronal utvikling [38]. I motsetning til virveldyrs AhR, binder ikke AHR-1 TCDD og andre relaterte fremmedlegemer [35,39], men den deler med pattedyrs AhR fellestrekk i reguleringen av nevronale prosesser, utvikling og fertilitet [37,38,{ {8}}], noe som til slutt antyder at den forfedres AhR ikke var direkte involvert i å kontrollere gener for nedbrytning av giftige ligander [44,45]. Vi anerkjente dermed C.elegans som et unikt og kraftig modellsystem for å identifisere og studere de forfedres funksjoner til AhR, som muligens ikke er relatert til dens xenobiotiske respons.
I denne studien undersøkte vi rollen til AhR i curcumins antialdringseffekter på tvers av arter. Gjennom en kombinasjon av in vivo-, in vitro- og silicoanalyser fant vi at curcumin viser forskjellige gunstige antialdringseffekter gjennom ukoblede ahr-1-avhengige og -uavhengige mekanismer. Vi fant at C.elegans ahr-1-utarmede dyr er langlivede, men mer følsomme for oksidativt stress. Mens curcumin ikke forlenget levetiden til C.elegans ahr-1-mutantene ytterligere, fremmet det deres motstand mot oksidativt stress. Curcumin fremmet også antioksidantresponsen og migrasjonskapasiteten til humane primære endotelceller (EC) uavhengig av AhR, en effekt som først og fremst var avhengig av Nrf2/SKN-1 på tvers av arter. SKN-1 er C.elegans-ortologen til den humane Nrt2 (kjernefaktor erytroid 2-relatert faktor 2) redokstranskripsjonsfaktor, som spiller en evolusjonært bevart rolle i celle- og organismehomeostase og respons på oksidativt stress [ 46,47]Koblingsresultater fra en cellulær reporteranalyse og i silico-modellering av AHR-1-ligandbindende domene (LBD), viste deretter at curcumin mest sannsynlig undertrykte AHR-1-aktivitet i en ligand- bindende uavhengig måte. Spesielt, og i tråd med dataene i C.elegans og EC, viste curcumin og pro-oksidanter motsatte effekter på AHR-1 aktivitet, noe som antyder at curcumin kan modulere AHR-1 aktivitet gjennom sin antioksidantkapasitet enten direkte eller indirekte via regulering av Nrf2/SKN-1 eller andre redoksregulerende proteiner.
2. Materialer og metoder
2.1. C.elegan1s
2.1.1. C. elegans Stammer og dyrking
Vi brukte følgende C.elegans-stammer: N2 [villtype], CZ2485 [ahr-1(jul45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (originalstamme AM141 [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (jul45)], NV42wt [unc-54p::alphasynuclein::YFPI (original stamme NL5901 [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS](original stamme CL2166). For vedlikehold ble ormer holdt synkronisert med egglegging ved 20 grader på Nematode Growth Media (NGM) plater og matet med E.coli OP50, i henhold til metoder beskrevet i [25]. For forsøkene ble ormer synkronisert på plater supplert med E.coli HT115(DE3) på plater supplert med 1 mM IPTG (Fisher Scientific, Geel, Belgia).
2.1.2. Gendemping ved RNA-mediert interferens (RNAi)
Gendemping ble oppnådd ved å mate E.coli HT115(DE3) uttrykkende plasmider med dsRNA mot spesifikke gener [50]. RNAi-fôring ble påført kontinuerlig fra fødsel til død. For juglone-resistensanalyse med HT115(skn-1)-bakterier ble RNAi-mating påført fra L4-ormer i 24 timer før de ble overført til ferske juglone-plater.
2.1.3. E.coli stammer og vekst
Bakterier ble dyrket i LB-medium ved 37 grader over natten. Ved bruk av E.coli-bærende vektorer ble LB-mediet supplert med 0.01 prosent ampicillin og 0,0005 prosent tetracyklin.E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{8} }),HT115(skn-1), og OP50 ble hentet fra Ahringer C. elegans RNAi-biblioteket [51].
2.1.4.Levetid
Levetidsanalysen ble startet fra en synkronisert populasjon av ormer, som ble overført til ferske NGM-plater daglig i den fertile perioden. Etter den fertile fasen ble dyrene overført annenhver dag. Døde, levende og sensurerte dyr ble skåret under overføringsprosessen. Dyr ble regnet som døde når de verken viste bevegelse, eller respons på en manuell stimulus med en platinatråd, eller svelgpumpeaktivitet. Dyr med intern klekking (poser), og eksplodert vulva, eller som døde uttørket på veggen ble sensurert. Antall døde og sensurerte dyr ble brukt til overlevelsesanalyse i OASIS[52] eller OASIS 2[53]. For beregning av gjennomsnittlig levetid og overlevelseskurve i OASIS og OASIS 2 ble Kaplan-Meier-estimatoren brukt, og p-verdiene ble beregnet ved hjelp av log-rank test mellom sammenslåtte populasjoner av dyr.
2.1.5. Bevegelse/Helsespenn
Bevegelsen ble satt som en parameter for sunn aldring, og fasen av den aktive bevegelsen omtales som helsespennet. Det ble vurdert i populasjonene som ble brukt for levetidsanalysen. Dyr, som enten krabbet spontant eller etter en manuell stimulus, ble ansett som bevegelige, mens døde dyr eller dyr uten krypende atferd ble ansett som ikke bevegelige. Statistisk analyse ble gjort som beskrevet for levetid.
2.1.6. Curcumin Behandling av C. elegans
Curcumin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) ble oppløst i DMSO (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) i en konsentrasjon på 100 mM og tilført NGM etter autoklavering. Den endelige konsentrasjonen av curcumin i media var 100 μM (0,1 prosent DMSO). Kontrollplater inneholdt 0,1 prosent DMSO. Ormer ble behandlet kontinuerlig med utgangspunkt i egg.
2.1.7. Kvantifisering av PolyQ-aggregater
PolyQ40-aggregater ble visualisert ved fluorescensmikroskopi (100x forstørrelse) i 10-daggamle ormer bedøvet med 15 mM natriumazid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). For å vurdere antall aggregater ble bilder sydd ved hjelp av Fiji parvis stitching-plugin [54] for å lage hele ormer, og antallet aggregater ble kvantifisert i Fiji [55] ved hjelp av plugin "Analyze Particles".
2.1.8. Kvantifisering av x-Synuclein-aggregater
-synukleinaggregater i hodemusklene til 7-daggamle ormer ble visualisert ved fluorescensmikroskopi (400× forstørrelse) i ormer bedøvet med 15 mM natriumazid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland, S2002 ). Bildene ble segmentert ved bruk av Plastik (versjon 1.3.0)(Laboratory of Anna Kreshuk ved European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland)(tilgjengelig på https://www.ilastik.org/, tilgjengelig 10. april 2018)[56] . De segmenterte bildene ble brukt til å analysere antall aggregater i Fiji [55] ved hjelp av plugin "Analyze Particles".
2.1.9.Microarray- og GO-termanalyse
Prøver fra fem uavhengige replikater med omtrent {0}}daggamle ormer per tilstand ble samlet, og RNA ble ekstrahert og lastet til en Affymetrix-brikke. Mikroarrayens rådata i formatet CEL ble analysert ved hjelp av programvaren R (versjon 3.4.2) (R Foundation, Wien, Østerrike) og Bioconductor (The Bioconductor Project, Bioconductor er åpen kildekode og åpen utvikling) [57]. Bakgrunnskorreksjon, normalisering og ekspresjonsberegning ble utført med oligopakken58] og RMA-metoden. For kvalitetskontroll av matrisen ble pakken arrayQualityMetrics 3.34.0 [59] brukt. På grunn av kvalitetsmålene ble prøve ahr-1C5 ekskludert fra videre analyse. De differensielt uttrykte genene ble identifisert ved hjelp av limma-pakken og en lineær modell og moderert t-statistikk med FDR for å teste for flere sammenligninger [6{{20}}]. En p-verdi på 0,1 ble brukt. De differensielt uttrykte genene ble analysert for Gene Ontology-termberikelse ved bruk av Cytoscape (versjon 3.6.0) (The Cytoscape Consortium, en uavhengig ideell organisasjon)[61] med plugin-modulen ClueGo (versjon 2.5.0) (Laboratory of Integrative) Cancer Immunology, Paris, Frankrike)[62]. Mikroarray-dataene kan nås gjennom Gene Expression Omnibus-tilgangsnr. GSE195769.
2.1.10.ROS Kvantifisering
MtROS ble påvist i levende wt og ahr-1 mutante ormer ved bruk av MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Dreieich, Tyskland). Nematoder ble synkronisert ved egglegging på IPTG-plater ved bruk av HT115(L4440) bakterier som mat. Deretter, 48 timer senere, ble 50 dyr på L4-stadiet overført til nylaget 10μM MitoSOX Red-plater frøet med UV-drept HT115 (L4440). Ormene ble inkubert i mørket ved 20 grader. Etter 16 timers inkubasjon ble de flyttet over på nye NGM-plater spredt med levende HT115(L4440) i 1 time for å fjerne gjenværende fargestoff fra tarmene. For avbildning ble nematoder montert på 2 prosent agarosepute-glass, bedøvet ved å tilsette 10 mM levamisol og fikset med ProLongTM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Tyskland). Bilder ble tatt umiddelbart med et Zeiss Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss, Inc., Köln, Tyskland) ved bruk av et 40× objektiv og et DsRed Filter. Etterpå ble ormehoderegionen valgt manuelt, og den integrerte intensiteten ble beregnet ved bruk av bildeprogramvaren Fij 55.
2.1.11. Tetramethylrhodamine Ethyl Ester (TMRE) Assay
For å vurdere mitokondriemembranpotensialet ble nematoder synkronisert ved egglegging på IPTG-plater frøet med HT115(L4440) bakterier. På dagen for eksperimentet ble TMRE (Invitrogen, Eugene, OR, USA) oppløst i DMSO til en konsentrasjon på 5 mM og deretter fortynnet til 30 μM med varmeinaktivert HT115 (L4440) (30 min, 65 grader). Totalt 150 μL av denne løsningen ble tilsatt per plate og lot tørke i mørke i omtrent 30 minutter. Seksti voksne synkrone ormer ved 1, 3 eller 5 dager i voksen alder ble plukket på TMRE-platene forberedt og overlatt til flekken for å absorbere i 2 timer i mørket ved 20 grader. Etter farging ble ormer overført til IPTG-plater sådd med varmeinaktivert HT115(L4440) og inkubert i 1 time i mørket ved 20 grader for å fjerne gjenværende fargestoff fra tarmene.cistanche penis størrelseFor avbildning ble 10 nematoder montert på 2 prosent agarosepute-glass, bedøvet ved å tilsette 10 mM levamisol og fikset med ProLongM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Tyskland). For hver eksperimentelle kjøring ble det utarbeidet 5 lysbilder per gruppe. Bilder ble tatt umiddelbart med et Zeiss Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss, Köln, Tyskland) ved bruk av et 2,5× objektiv og et DsRed-filter. Fluorescensintensiteten ble beregnet ved å bruke Fiji [55].
2.1.12. Faryngeal pumpehastighet og motilitetsanalyse
N2- og CZ2485-nematoder ble synkronisert ved bleking [63] og eggene ble overlatt til klekkeeggbuffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3) over natten, på orbital shacking. L1-larver ble oppdaget på NGM supplert med 1 mM IPTG og som inneholdt 0,1 prosent DMSO eller 100 μM curcumin. HT115 (L4440) bakterier ble brukt som mat. Unge voksne ormer ble samlet med M9-buffer, sentrifugert (300 g × 3 min) og vasket to ganger for å fjerne bakterier. Ormer ble inkubert med 0-1 mM H, O, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) (100 ormer/100 μL), i 2 timer ved orbital risting. Kontrollormer ble kun inkubert med M9-buffer. Etter 2 timer ble ormer flyttet over på NGM supplert med 1 mM IPTG og inneholdt 0,1 prosent DMSO eller 100 μM curcumin og sådd med HT115(L4440)-bakterier som mat. Svelgpumpehastigheten, scoret ved å telle antall ganger den terminale pæren i svelget trakk seg sammen over et intervall på 1 min (pumper/min), og motilitetsanalysen, skåret ved å telle antall kroppsstøt (kroppsbøyninger/min.) M9-buffer over et intervall på 1 min, ble skåret fra 2 til 20 timer senere.
2.1.13. Akutt Juglone Sensitivity Assay
N2- og CZ2485-nematoder ble synkronisert ved egglegging på NGM-plater med enten DMSO eller 100 μM curcumin. Platene ble supplert med 1 mM IPTG og sådd med HT115(L4440) eller HT115(ugt-45) bakterier som mat. For å evaluere effekten av hud-1 RNAi, ble ormene synkronisert ved å legge egg på DMSO- eller curcuminplater frøet med HT115(L4440)-bakterier. Etter hvert som nematodene nådde L4-larvestadiet, ble de overført i 24 timer til DMSO- eller curcuminplater sådd med HT115(hud-1)-bakterier. Dag 1 voksne ormer (25 ormer) ble flyttet over på ferske NGM-plater som inneholdt 200 μM Juglone (Merck, Darmstadt, Tyskland) og sådd med 25 μL 10x konsentrert bakteriekultur over natten. Ormoverlevelse under juglone-indusert oksidativt stress ble kontrollert ved berøringsprovosert bevegelse hver time, i 6 timer. Dyr ble bedømt som døde når de ikke klarte å reagere på berøring med en platinatråd. Nematoder tørket på veggen ble sensurert. Antall døde og sensurerte dyr ble målt og Online Application for Survival Analysis OASIS2 ble brukt for overlevelsesanalyse [53].
2.1.14. Kvantifisering av GST-4:GFP-intensiteten
NV35wt og NV35a ble synkronisert ved egglegging på NGM-plater supplert med 1 mM IPTG og inneholdende 0,1 prosent DMSO eller 100 μMcurcumin. HT115(L4440), HT115(ugt-45) og HT115(hud-7)bakterier ble brukt som mat. For å visualisere GFP-fluorescens, ble dag1 voksne ormer bedøvet med 10 mM levamisolhydrokloridløsning og montert på 2 prosent agaroseputer. Bildene ble umiddelbart tatt med et Zeiss Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss, Köln, Tyskland), 2,5× forstørrelse) og deretter analysert ved hjelp av programvaren CellProfiler (The CellProfiler-prosjektteamet, Cimini Lab ved Broad Institute of MIT og Harvard, MA, USA). Kort fortalt ble bilder behandlet ved hjelp av en rørledning for å segmentere ormer i hvert bilde fra lysfeltmikroskopi og skille dem fra bakgrunnen. Deretter ble den integrerte GFP-intensiteten målt per orm.
2.1.15.Semi-kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) i C. elegans
Prøver fra 3 uavhengige replikater med ca. 1000 3-daggamle ormer per tilstand ble samlet og RNA ble ekstrahert. Etter vasking og eluering ble RNA-innholdet kvantifisert ved spektrofotometri, og 1-2 ug RNA ble brukt til cDNA-syntesen (Omniscript RT Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).cistanche pulverPrimerpar er oppført i tabell S1. For sanntids qPCR ble cDNA fortynnet ved 1:2 0 i 10 mM TRIS (pH8,0). For reaksjonen ble qPCR Green Core-settet (Jena Biosciences, Jena, Tyskland)) eller GoTaq⑧ qPCR-settet (Promega, Walldorf, Tyskland) brukt. Prøvene ble kjørt i en MyiQ2 cycler (BioRad, Feldkirchen, Tyskland), og ekspresjonen av hver prøve ble målt i duplikat på samme multi-brønn plate. Uttrykket ble beregnet i forhold til referansegenene act-1 og CDC-42 ved hjelp av iO5-programvaren. Alle data som ble samlet inn ble aktivert for genstudie i henhold til BioRad-brukerinstruksjonene, og uttrykket ble beregnet ved å bruke det normaliserte uttrykket (ddCr). Effektiviteten til hver primerparreaksjon ble tilsatt for korrekt kvantifisering av det normaliserte uttrykket. Effektiviteten ble vurdert med 1:20, 1:100, 1:500 og 1:2500 fortynninger av cDNA. Fra normaliserte ekspresjonsverdier ble fold-endringen sammenlignet med villtype beregnet for hvert replikat.
2.2. Pattedyrceller
2.2.1. Dyrking av Cos7-celler
Cos7-celler (ATTC, #CRL-1651) ble dyrket ved 37 grader og 5 prosent CO, i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, Tyskland) med 1 prosent pyruvat, 1 prosent Glutamax og 1 0 prosent Fetal Bovint Serum (FBS)(Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Tyskland) og ytterligere penicillin (10.000 enheter/mL)/Streptomycin (10.000 ug/ mL） Så snart cellene bygde en sammenflytende celleplen, ble de løsnet fra basen ved å bruke 0,05 prosent Trypsin/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, Tyskland).
2.2.2. Transfeksjonsplasmider
Vi brukte følgende plasmider for transfeksjonen av Cos7-cellene: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16,pcDNA3-AhA-1-VP16,pcDNA3-AhR -1(jul45)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. Plasmidene er beskrevet av Larigot et al. (innlevert sammen med denne studien). p1A1-FL-plasmidet bærer en XRE-induserbar luciferase, Perl-TK bærer en renilla-luciferase, og pcDNA3-Ahr-1-VP16 og pcDNA3-AhA{{24 }}VP16 bærer sekvenser for uttrykket av henholdsvis C.elegans AHR-1 og AHA-1. For denne studien opprettet vi pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16 ved stedsrettet mutagenese av pcDNA3-Ahr-1-VP16-plasmidet med QuikChange II Site-Directed Mutagenesesett (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Følgende primerpar ble brukt til å lage en L til A-substitusjon ved L363, og en H til Q-substitusjon ved H365 av AHR-1:LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3'andLBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCCGTTGGCTCTCG{401} '.Superkompetent XL1-Blå celler ble transformert med det oppnådde plasmidet for amplifikasjon. Plasmidsekvensen ble verifisert ved Sanger-sekvensering.
2.2.3.Forbigående transfeksjon av Cos7-celler
24 timer før transfeksjon ble 20,{2}} celler/brønn sådd i en 48-brønnplate i 400 uL DMEM (pluss 10 prosent FBS pluss antibiotika) og inkubert ved 37 grader. Celler ble deretter transfektert med følgende plasmidkonsentrasjoner ved bruk av lipofectamine 200 (Invitrogen, Eugene, OR, USA): p1A1-FL(244ng/brønn), Phil-TK(36ng/brønn),pcDNA3- AhA-1-VP16(5ng/brønn), og enten pcDNA3-VP16(10 ng/brønn), pcDNA3-Ahr-1-VP16(5 ng/brønn) eller pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16(5 ng/brønn) som beskrevet av Larigot et al. (innlevert sammen med denne studien). Lipofectamine 2000 ble brukt i en konsentrasjon på 1 uL/brønn og pre-inkubert med de respektive plasmidene i DMEM i 20 minutter før bruk. For den forbigående transfeksjonen ble Cos7-celler inkubert med lipofektamin/plasmidblandingen for 3hin DMEM (pluss 10 prosent FBS) uten antibiotika for å unngå antibiotika-indusert toksisitet. Deretter ble transfeksjonsmediet fjernet og erstattet med 400 μL/brønn DMEM (pluss 10 prosent FBS pluss antibiotika). De transfekterte cellene ble inkubert ved 37 grader. På hver plate ble 2 brønner med celler ikke transfektert og dermed brukt for normaliseringsformål. 2.2.4.Behandling av Cos7-celler
Stamløsninger i konsentrasjoner 1000- ganger høyere enn ønsket behandlingskonsentrasjon ble fremstilt for alle forbindelsene. Curcumin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland), Benzo(a)pyren (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland), leflunomid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland), og lutein (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland), ble oppløst i DMSO ( Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland), mens resveratrol (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) og rotenon (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) ble oppløst i etanol (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland). 24 timer etter transfeksjon ble cellekulturmediet til cellene erstattet med et cellekulturmedium som inneholdt en 1:100 fortynning av den respektive forbindelsen. Cellene ble behandlet i 24 timer før luciferaseaktiviteten ble vurdert.
2.2.5. Luciferase-analyse (AhR-aktivitet)
AhR-transkripsjonsaktiviteten ble vurdert ved å måle aktiviteten til en XRE-drevet luciferase [64]. For dette ble et Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Wall Dorf, Tyskland) brukt. Etter en 24 timers behandling ble Cos7-celler vasket to ganger med PBS og deretter lysert i 15 minutter ved romtemperatur ved bruk av den passive lyseringsbufferen inkludert i Dual-Luciferase Reporter Assay-settet. Totalt 20 μL av de lyserte cellene ble plassert i en hvit 96-brønnplate og brukt til luminescensmålinger. Substratene for luciferin (LARII) og vanilje (Stop&cGlo) ble fremstilt i henhold til produsentens beskrivelse. Prøvene ble lastet på et luminometer (EG&G Berthold mikroplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland), og substratene ble festet til rørsystemet til luminometeret. Først ble 65 uL LARII tilsatt hver brønn av prøven, og luminescensen produsert av ildflue-luciferasen ble målt, deretter ble 65 μL Stop&clo-reagens tilsatt og luminescensen produsert av Renilla-luciferasen ble målt. For å vurdere AhR-aktivitet fra luminescensmålingene, utførte vi følgende etterbehandling trinn: Først ble luminescensen til ikke-transfekterte celler trukket fra luminescensen til hver prøve for bakgrunnskorreksjon. I neste trinn normaliserte vi luciferase-luminescensen til renilla-luminescensen til samme prøve for å eliminere forskjeller i transfeksjonshastigheten og cellen Et annet normaliseringstrinn til de pcDNA-VP16-transfekterte cellene ble utført for hver behandlingsgruppe for å fjerne AhR-indep endelige effekter på den XRE-drevne luciferasen.
Denne artikkelen er hentet fra Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants