Beta Vulgaris Rubra L. (Beetroot) Peel Metanol-ekstrakt reduserer oksidativt stress og stimulerer celleproliferasjon via økende VEGF-ekspresjon i H2O2-indusert oksidativt stresset humane navleveienendotelceller
Feb 22, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comå vite mer
Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 og Amna Abdullah Alotiby 2
Abstrakt:Antioksidantkapasiteten til polyfenoler ogflavonoidertilstede i kostholdsmidler hjelper til med å stoppe utviklingen av reaktive oksygenarter (ROS) og beskytte endoteliale glatte muskelceller fra oksidativt stress/indusert nekrose. Rødbeter (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) er en vanlig konsumert grønnsak som representerer en rik kilde tilantioksidanter. Rødbeteskallets bioaktive forbindelser og deres rolle i humane navlevene-endotelceller (HUVEC) er fortsatt lite undersøkt. I denne studien ble metanolekstrakt (BPME) tilberedt, og dets effekt på bioeffektivitet, kjernefysisk integritet, mitokondriell membranpotensial, vaskulær cellevekst og immunreguleringsrelaterte genuttrykksnivåer i HUVEC-er med indusertoksidativtstress ble analysert. Gasskromatografi-massespektroskopi (GC-MS)-resultater bekreftet at BPME inneholder 5-hydroksymetylfurfural (32,6 prosent), metylpyruvat (15,13 prosent), furfural (9,98 prosent) og 2,3-dihydro{{11} },5-dihydroksy-6-metyl-4H-Pyran-4-on (12,4 prosent). BPM-ekstrakt forbedret effektivt celleproliferasjon og ble bekreftet ved MTT-analyse; den nukleære integriteten ble bekreftet ved propidiumjodid (PI)-fargingsanalyse; mitokondriemembranpotensialet (∆ψm) ble bekreftet ved JC-1fargingsanalyse. Annexin V-analyse bekreftet at BPME-behandlede HUVEC-er viste 99 prosent levedyktige celler, men bare 39,8 prosent levedyktighet ble vist i HUVEC-er behandlet med H2O2 alene. I tillegg reduserte BPME-behandling av HUVEC-er i 48 timer mRNA-ekspresjon av lipidperoksid (LPO) og økte NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotel nitrogenoksidsyntase (eNOS) ), og vaskulær cellevekstfaktor (VEGF) mRNA-ekspresjonsnivåer. Vi fant at BPME-behandling reduserte proinflammatorisk (kjernefaktor-κ (F-κ), vevsnekrosefaktor- (TNF- ), tolllignende reseptor-4 (TLR-4), interleukin{{37} } (IL-1 )) og vaskulærbetennelse(intracellulært adhesjonsmolekyl (ICAM), vaskulært celleadhesjonsmolekyl (VCAM), EDN1, IL-1 )-relaterte mRNA-uttrykk. Som konklusjon, økte rødbeteskallbehandling effektivt vaskulære glatte cellevekstfaktorer og utvikling av mikrotubuli, mens den reduserte vaskulære inflammatoriske regulatorer. BPM kan være gunstig for vaskulær glattcelle-regenerering, vevsreparasjon og antialdringspotensial.
Nøkkelord:rødbet; oksidativt stress; mitokondrier; angiogenese; betennelse
1. Introduksjon
Angiogenese er den fysiologiske prosessen med vaskulogenese fra kroppens eksisterende vaskulatur [1]. Det er viktig ikke bare for embryonal utvikling og reproduksjon, men også for cellesyklus og vevsreparasjon [2,3]. Imidlertid er det assosiert med patogenesen av ulike sykdommer, som tumorvekst, revmatoid artritt og ulike iskemiske og inflammatoriske sykdommer [3–5]. Det vaskulære endotelet spiller en viktig rolle i å opprettholde vaskulær hemostase ved å regulere blodkartonen og immun- og inflammatoriske reaksjoner [6,7]. Endotelceller (ECs) er tynne monocellulære lag som kler alle indre overflater av blodkar og produserer en rekke molekyler som virker lokalt eller på fjerne steder [7]. Endotelet er grunnleggende for kroppens homeostase, og enhver endring i endotelcelleresponsen fører til de primære hendelsene av inflammatoriske og vaskulære sykdomsprosesser, som aterosklerose og hypertensjon [6,8,9]. Disse sykdommene forårsaker oksidativt stress, som endrer EC-strukturen og funksjonsintegriteten og fører til endotelial dysfunksjon [9]. Human umbilical vene ECs (HUVECs) har blitt mye brukt som en modell for human vaskulær endotel-relaterte studier. Dessuten representerer de en nyttig modell for å studere de viktigste biologiske veiene involvert i endotelfunksjon [10]. Bioaktive forbindelser og fytokjemikalier finnes rikelig i frukt, grønnsaker, grønne urter og mange planter, som viser en rekke helsemessige fordeler, som anti-inflammatoriske, antioksidant, anti-kreftfremkallende og angiogene egenskaper [11–13]. I denne forbindelse hører rødbeter (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) til Amaranthaceae-familien og er klassifisert som en av de beste kildene til høye nivåer av antioksidanter [14,15]. Nærmere bestemt inneholder den flere fytokjemikalier som er biologisk aktive, inkludertbetalains, flavonoider,polyfenoler, terapeutiske enzymer, askorbinsyre, dehydroaskorbinsyre (DHAA) og uorganisk nitrat (NO3) [16–18]. Dessuten gir det verdifulle essensielle næringsstoffer, som kalium, kalsium, magnesium, natrium, jern, sink, fosfor, kobber og mangan [19]. Flere studier har rapportert at rødbetekstrakt (rot) har mange gunstige effekter på grunn av dets hypoglykemiske, lipidsenkende, antiinflammatoriske, antihypertensive og antiproliferative egenskaper [20–22]. Disse fordelaktige egenskapene kan alle være knyttet til de bioaktive forbindelsenes evne til å fjerne frie radikaler. Dermed har forbruket av rødbeter vært knyttet til en rekke ernæringsmessige og helsemessige fordeler. På grunn av dens ernæringsmessige verdi, kan den brukes som en funksjonell matkilde mot oksidativt stress som induserer kroniske metabolske sykdommer, som diabetes type 2 og kardiovaskulær sykdom [23]. Basert på litteraturgjennomgangen har Beta vulgaris potente antioksidanter, immunregulerende og angiogene egenskaper. Apigenin er funnet i beteblader; det har antiproliferative effekter i lever- og tarmceller, og det kan forbedre kostholdsindusert fedme-komorbiditet med høyt fettinnhold via AMPK-aktivering [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] identifiserte at Beta vulgaris beskytter vaskulære EC-er fra eksternt indusert oksidativt stress, som kan skyldes den kombinerte effekten av flere bioaktive forbindelser som er tilstede i denne planten. Inntil nå har den mekanistiske virkningen for EC-spredning og angiogeneseeffekt av Beta vulgaris rotskall vært lite undersøkt. Derfor hadde vi som mål å gjennomføre denne studien for å undersøke vaskulær celleproliferasjon, mikrotubuliutvikling, oksidativt stress og angiogenesekapasitet relatert til Beta vulgaris rotpeeling ved bruk av cellulær morfologi og genekspresjonsanalyse i HUVECs. De angiogene effektene av rødbeteskall metanolekstrakt assosiert med kjernefysisk integritet, utvikling av mikrotubuli, mitokondriell effektivitet og cellesyklusstimulering i menneskelige vaskulære EC-er utforskes.
2. Materialer og metoder
2.1. Tilberedning av rødbeter(Beta vulgaris rubra L.) Metanolekstrakt Prøver av fersk rødbeter (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) ble opprinnelig hentet fra grønnsaksbutikker, Riyadh, Kongeriket Saudi-Arabia (KSA). De ferske rødbetene ble vasket med destillert vann for å eliminere stilkene og forurensningene. Den ytre huden ble skrellet for å fjernes og kuttet i små biter. Prøver ble tørket i en varmluftsovn ved 40 ◦Kan deretter malt til pulver ved hjelp av en elektronisk blender. Deretter ble 5{{10}}0 g av pulveret ekstrahert i en steril flaske inneholdende 1 L metanol (Sigma, St. Louis, MO, USA) i 24 timer ved romtemperatur på en shaker og gjentas tre ganger. Etterpå ble et Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, USA) brukt for å filtrere ekstraktet. Til slutt, ved å redusere trykket, ble løsningsmidlet separert fra ekstraktet, og ekstraktet ble samlet som et fast tørt stoff etter fordampning av metanol. Den ekstraherte prøven ble lagret i kjøleskap ved 4 ◦C inntil videre bruk. 2.2. Gasskromatografi og massespektroskopianalyse. Metanolekstraktet (BPME) av rødbeteskall ble injisert i en silikakapillærkolonne (30 m × {{60}},25 mm ID × 0 0,25 µm filmtykkelse) av GC-MS-instrument (Agilent 6890N/5973I, California, CA, USA) med en masseselektiv detektor for å oppdage de kjemiske sammensetningene. Instrumentets temperatur ble innstilt som initial 7{{90}} ◦C, holdt i 2 min, til 305 ◦C ved 20 ◦C/min, etterfulgt av å holde i 1 min. Den totale GC-driftstiden ble satt til 45 minutter med heliumgassen (99,999 prosent) som bæregass (en konstant medhastighet på 1,2 mL/min), 250 ◦C som injektortemperatur og 230 ◦C som ionekilde temperatur. Basert på GC-MS-spekteret ble den relative prosentandelen av den tilsvarende komponenten beregnet, og massespektrene til den ukjente komponenten ble identifisert ved sammenligning med de kjente 62,000-mønstrene tilgjengelig i National Institute of Standard and Technology databibliotek (NIST08). 2.3. Cellekulturmaterialer og -kjemikalier HUVEC-er ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellekulturmaterialer som Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, trypsin og andre ble oppnådd fra Gibco (Paisley, UK). Penicillin-streptomycin (PS) og føtalt bovint serum (FBS) ble kjøpt fra Hyclone Laboratories, USA. Kjemikalier som ble brukt i det molekylærbiologiske eksperimentet ble hentet fra Sigma-Aldrich, spesielt MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid], PI og JC-1-farging. SYBR Green PCR Master Mix og cDNA-syntesesettet ble hentet fra Qiagen (Hilden, Tyskland). 2.4. HUVEC-er HUVEC-er ble dyrket i DMEM og supplert med 1 prosent PS og 10 prosent FBS-kompleks. Celler ble inkubert i en fuktet atmosfære ved 37 ◦C, 5 prosent CO2, og sub-dyrket omtrent hver tredje dag. 2.5. Cellelevedyktighet og celleproliferasjon ved MTT-analyse HUVEC-er (1 × 104 celler/brønn) ble dyrket med et vedlikeholdsmedium og fikk feste over natten i en 96-brønnkulturplate. Deretter ble mediet erstattet med et nytt kulturmedium som inneholdt økende konsentrasjoner av BPME (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 og 3,2 µg/mL) i henhold til MTT-analyseplatekartet og inkubert i 24 og 48 h; ubehandlede celler ble brukt som kontroller. Etter inkubasjonsperioden ble de eksperimentelle cellene behandlet med 20 µL/brønn av 5 mg/mL MTT (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2, 5-difenyltetrazoliumbromid som ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO)) og i tillegg inkubert i 4 timer ved 37 ◦C. Deretter ble mediet kastet, og det produserte lilla formazan ble oppløst i 100 ul 100 prosent DMSO. Absorbansen til løsningen ble målt ved bruk av en mikroplate-leser (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ved 570 nm bølgelengde. Prosentandelen (prosent) av celleproliferasjon ble beregnet ved følgende ligning: (absorbans av prøven/gjennomsnittlig absorbans for kontrollen) × 100. 2.6. Eksperimentell design I henhold til den nåværende celleproliferasjonsanalysen viste testet lavere konsentrasjon av BPME (0,1 og 0,2 µg/ml) prolifererende HUVEC-er og mikrotubulusmorfologi uten toksisitet. Volumer på 0,1 og 0,2 µg/ml dose av BPME ble valgt og behandlet med normale HUVEC-er og 10 mM H2O2--indusert oksidativt stressede HUVEC-er i 48 timer for å bestemme celleproliferasjon, antiinflammatoriske, angiogene og apoptotiske potensialer (Figur 1). Kjøretøyskontrollen ble også opprettholdt i 48 timer i begge gruppene. Quercetin (10 µM) ble brukt som referansekontroll i begge forsøksgruppene. Etter inkubering ble de ubehandlede og eksperimentelle cellene analysert for celle- og kjernemorfologi og mitokondriell membranpotensial ved bruk av et BDTM MitoScreen (JC-1)-sett; apoptose ble bestemt ved hjelp av Annexin V/apoptose-basert cellesorteringsmetode i andre cytometri. Nivåene for oksidativt stress, proinflammatorisk og angiogenese-relatert genuttrykk ble undersøkt.
2.7. Propidiumjodidfargingsanalyse for kjernefysisk skade Cellulære morfologier for karakteristiske kjernefysiske skader, pyknose eller apoptotiske morfologiske endringer etter behandling med 0.1 og 0,2 µg/mL BPME (med eller uten H2O2) i HUVEC-er ble bestemt ved bruk av PI-fargingsanalyse under invertert fluorescensmikroskopi, som beskrevet av Leite et al. [27].
2.8. Analyse av mitokondriell membranpotensial (∆ψm) ved JC-1 Fargefarging Potensialet til mitokondriell membran (∆ψm) ble bestemt ved JC-1-analyse for å vurdere mitokondriell effektivitet i kjøretøykontroll og {{4} }.1 og 0.2 µg/mL BPME-behandlede HUVEC-er (med og uten H2O2). Kort fortalt ble JC-1-fargeløsningen blandet med et lignende volum kulturmedium og deretter tilsatt de eksperimentelle HUVEC-ene og inkubert i mørket i 20 minutter ved 37 ◦C. Deretter ble det ubundne JC-1-fargestoffet forsiktig vasket to ganger med 200 µL JC-1-fargebuffer ved 4 ◦C. Etterpå ble akkumuleringen av j-aggregert mot JC-1-farging observert under fluorescensmikroskopi ved bruk av et fluorescensmikroskop, og bilder ble tatt. I tillegg ble potensialet til mitokondriemembranen målt i flowcytometri ved bruk av BDTM MitoScreen (JC-1) Kit.
2.9. Annexin V/apoptose-analyse ved bruk av strømningscytometri Det andre cytometribaserte Annexin V/PI-deteksjonssettet (Sigma Chemicals, USA) ble brukt for å kvantifisere levedyktige, proapoptotiske, tidlige apoptotiske og nekrotiske celler. Oksidativt stress-indusert HUVEC-er (1 × 105/brønn) ble sådd ut i 24-brønnplater og inkubert med BPME (0.1 og 0.2 µg/mL) eller vehikelkontroll for 48 t. Etter inkubering ble cellene inkubert i 400 µL 5 µL Annexin V-fluorescein isothiocyanat (FITC) og 5 µL PI-holdig bindingsbuffer; etter dette ble cellene holdt i 15 minutter ved romtemperatur (RT) i mørket. Cellene ble analysert ved hjelp av andre cytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) for å identifisere apoptotiske (PI-negative og Annexin V-positive) og sene apoptotiske (PI-positive og Annexin V-positive) celler [28].
2.10. Kvantitativ sanntids PCR-analyse Fastlane® celle til cDNA-sett (Qiagen, Hilden, Tyskland) ble brukt til å ekstrahere totalt RNA og syntese cDNA fra kjøretøykontroll, BPME-behandlede HUVEC-er (med og uten H2O2) ved bruk av en kvantitativ PCR (qPCR) semiautomatisert instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Uttrykksnivåer av oksidativt stress inkludert (lipidperoksid, NOS-3), antioksidant (Nrf-2, GSK-3 og GPx), proinflammatorisk (kjernefaktor-k (NF- κ ), tumornekrosefaktor- (TNF- ), interleukin-1 (IL-1), vaskulær cellevekstfaktor (VEGF), tolllignende reseptor-4 (TLR-4)) , og vaskulær betennelse (intracellulært adhesjonsmolekyl (ICAM), vaskulært celleadhesjonsmolekyl (VCAM), EDN1 og endotel nitrogenoksidsyntase (eNOS))-relaterte gener og referansegenet, -aktin, ble analysert i HUVEC-er og kvantifisert med metoden av Yuan et al. [29]. Amplifikasjonsverdiene (∆Ct) ble beregnet ved forskjellen mellom Ct (behandlet) og Ct (kontroll). Genuttrykk ble plottet ved å bruke uttrykket av 2−∆∆Ct-verdi.
2.11. Statistisk analyse Alle forsøkene ble tredoblet, og de resulterende dataene ble uttrykt som gjennomsnittsverdier ± standardavvik (SD). Den statistiske analysen av forskjeller mellom gruppene ble utført ved enveis variansanalyse (ANOVA) ved bruk av SPSS-programvare (versjon 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Deretter ble Tukeys multiple sammenligningstest utført hvis det ble funnet signifikante forskjeller. Alle resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD for seks replikasjoner i hver gruppe. En p-verdi < 0.05="" ble="" ansett="" som="" signifikant="">
Cistanche for å forbedre immuniteten
3. Resultater
3.1. Bioaktive molekyler i BPME De kjemiske komponentene i BPME ble bekreftet ved bruk av GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). Den kjemiske sammensetningen av rødbeteskallekstrakt ble bestemt ved å sammenligne massespektrene tilgjengelig med National Institute of Standard and Technology (NIST) Spectral database. GC-MS-resultatene bekreftet at BPME inneholdt hydroksyaceton (8,18 prosent), 5-hydroksymetylfurfural (32,6 prosent), metylpyruvat (15,13 prosent), beta-d-allopyranose (1,48 prosent), furfural (9,98 prosent), 2-hydroksy-gamma-butyrolakton (1,32 prosent) og 2,3-dihydro-3,5-dihydroksy- 6-metyl-4H-Pyran -4-én (12,4 prosent ; figur 2a, tabell 1). 3.2. Celleproliferasjon In vitro-celleproliferasjonspotensialet til BPME mot HUVEC-er er presentert i figur 2b. Ingen signifikant cellevekstinhibering ble observert i forsøksgruppene sammenlignet med bærerkontrollen. Det ble bekreftet av denne studien at økning av konsentrasjonen av BPME behandlet med HUVEC resulterte i økt celleproliferasjon og levedyktighet etter 48 timer (112 prosent) sammenlignet med 24 timer (103 prosent) av behandlingen. I tillegg bekreftet de lysmikroskopiske bildene av BPME-behandlede HUVEC-er etter 48 timer de normale cellene med ensartet form av adherent cellemorfologi, økt antall prolifererende (replikasjons-) celler uten skade var tydelig (Figur 2c). 3.3. Analyse av celle- og kjernemorfologi, mikrotubulidannelse og JC-1-farging i HUVEC-er. Figur 3 viser morfologien til mikrotubulusutvikling i FL-fluorescensmikroskopiske bilder. H2O2-indusert oksidativt stressede HUVEC-er viste dårlig spredning og uregelmessig morfologi av adherente celler sammenlignet med kontroll-HUVEC-er. Normale HUVEC-er behandlet med 0,2 µg/mL BPME viste prolifererende celler via replikasjon eller neogenese med mikrotubulusmorfologi. I mellomtiden viste 0.1 µg/mL dose av BPME-behandlede celler 100 prosent adherente celler med tidlige stadier av mikrotubuli. Oksidativstressede HUVEC-er behandlet med 0,2 µg/ml BPME identifiserte prolifererende nye celler med mikrotubulusmorfologi og redusert oksidativ cellulær skade. I tillegg økte 0,1 µg/ml BPME også den normale vaskulære cellemorfologien med prolifererende celler.
Figur 4a viser den normale morfologien til kjernestrukturen, med en sfærisk form, i kontroll- og BPME (0.1 eller 0.2 µg/mL)-behandlede HUVEC-er. Figur 4b viser bildene for PI-farging av normale og HUVEC-er med oksidativt stress indusert av H2O2. H2O{{10}}behandlede HUVEC-er viser kjerner med uregelmessige former, som viser kondensering og pyknose etter 30 min. Imidlertid viste 0,2 µg/mL BPME-behandling for HUVEC-er under oksidativt stress sirkulære kjerner med normal morfologi. Sammenlignet med 0,2 µg/mL BPME-ekstrakt, hadde 0,1 µg/mL BPME en mindre beskyttende effekt mot H2O2--indusert oksidativt stress i HUVEC-er.
Figur 2. Resultater for GC-MS-kromatogram av rødbeteskall-metanolekstrakt (a), in vitro-celleproliferasjon (b) og lysmikroskopibilder for cellemorfologi (c) i HUVEC-er, behandlet med økende konsentrasjon av rødbeteskall-metanolekstrakt (BPME) ) (uniform form av adherente og prolifererende celler nevnt med rød pilspiss). Alle verdier er gjennomsnitt ± SD (n=6). * p Mindre enn eller lik 0.05 sammenlignet med kjøretøykontroll.
Figur 3. Analyse av mikrorørdannelse basert på fluorescensmikroskopisk i vehikelkontroll, 0.1 og 0.2 µg/mL dose av rødbeteskall metanolekstrakt (BPME) behandlet normal og H2O{{6} }induserte oksidativt stressede HUVEC-er etter 48 timer. Etter 48 timer viste H2O2-indusert oksidativt stresset HUVEC endret morfologi sammenlignet med vehikelkontroll. Volumer på 0.1 og 0,2 µg/mL av rødbeteskall-metanolekstrakt (BPME)-behandlede HUVEC-er viste normal morfologi med vaskulære mikrotubuli med prolifererende celler som lignet den vanlige morfologien til glattmuskelcelleadferd.
Figur 4. Propidiumjodid (PI)-fargingsanalyse for kjernemorfologi i vehikelkontroll, 0.1 og 0.2 µg/mL rødbeteskall metanolekstrakt (BPME)-behandlet normal (3a) og H2O2-indusert oksidativt stresset (3b) HUVEC etter 48 timer. Ved PI-farging viste vehikelkontroll at kjernen så ut til å være normal uten tegn til krympet, pyknose eller apoptotisk kjerne. I H2O2 alene viste behandlede celler en polarisert kjernemembran etter 48 timer. Behandling med 0.2 µg/mL BPME normaliserte den H2O2-induserte kjernemembranpolarisasjonen sammenlignet med 0.1 µg/mL BPME eller Quercetin 10 µM.
Figur 5a viser JC-1-fargeresultatene for HUVEC-er, inkludert kontroll- og BPME-behandlede celler; figuren illustrerer friske celler med aktive mitokondrier, som bekreftet av negativt ladet mitokondrieopptak av den ekstramitokondrielle lipofile kationiske JC-1 (grønn farge) og J-aggregater omdannet med rød farge intramitokondrielt. Figur 5b viser JC-1-fargeresultatene for 0.2 µg/mL BPME administrert til HUVEC-er med oksidativt stress indusert av H2O2; resultatene bekreftet at nesten 94 prosent av negativt ladede mitokondrier konverterte den lipofile kationiske JC-1 (grønn farge) til røde farge J-aggregater sammenlignet med 0.1 µg/mL BPME (61,4 prosent) behandling eller H2O{{20}}indusert oksidativt stress i HUVEC-er (2 prosent). Mitokondriell membranpotensial (MMP) ble observert å være høyere i BPME-behandlede celler sammenlignet med referansemedisinen quercetin. 3.4. FACS-assistert mitokondriell membranpotensial (∆ψm; BD MitoScan) og Annexin V/apoptose-analyse i HUVEC-er Figur 6 viser mitokondriell membranpotensiale i BD MitoScan-analyse etter 0.2 µg/mL HUVEC-behandling av normal BPME-behandling og HUVEC-er med oksidativt stress indusert av H2O2. Vi fant at 0,2 µg/mL BPME-behandling økte MMP (∆ψm) til 92,7 prosent ± 3,7 prosent sammenlignet med HUVEC-er behandlet med H2O2 alene (27,9 prosent ± 7,2 prosent). I kontrast viste quercetin-behandlede celler en 41,4 prosent ± 1,6 prosent prosentandel av økt MMP (∆ψm) sammenlignet med HUVEC-er behandlet med BPME og H2O2 eller H2O2 alene.
Figur 5. Analyse av mitokondriell membranpotensial ved bruk av JC-1-farging for vehikelkontroll, 0.1 og 0.2 µg/mL rødbeteskall-metanolekstrakt (BPME) behandlet normalt (a ) og H2O2-indusert oksidativt stresset (b) HUVEC etter 48 timer. JC{{10}}flfluorescensbilder som viser sammenslåtte bilder av de røde og grønne signalene til fargestoffet, tilsvarende JC-1 i J-aggregater vs. monomer form. Vi fant færre J-aggregater H2O2 alene behandlede HUVECs. I 0.2 µg/mL BPME-behandlede HUVEC-er som viser høye j-aggregater som direkte representerer (høy MMP, ∆ψm) høyt mitokondriemembranpotensial sammenlignet med 0,1 µg/mL BPME eller 10 µM Quercetin.
4. Diskusjon
Ved ekstracellulært eller intracellulært stress overtar biotilgjengeligheten av reaktive oksygenarter (ROS) antioksidantforsvaret, og oksidativt stress forstyrrer redokssignalering og kontroll [31]. Utviklingen av oksidativt stress er assosiert med patogenesene til kroniske lidelser, som nevrodegenerative sykdommer, diabetes og aterosklerose. Som for eksempel oksidativt stress initierer endotelial dysfunksjon og fremmer systemisk betennelse og rekruttering av makrofager [32]. Aktiverte immunceller migrerer inn i vaskulaturen og frigjør cytokiner og kjemokiner assosiert med vasokonstriksjon og remodellering av glatte muskelcellers blodkar og betennelse som påvirker vaskulære glatte muskelceller og vaskulærveggen [33]. Økt vaskulært oksidativt stress ender med vaskulær skade, stivhet i glatte muskelceller og strukturelle elastinavvik. I tillegg har vaskulært oksidativt stress blitt stimulert ved andre patologiske tilstander, som visceral fedme eller aterosklerose, på grunn av økt NADPH-oksidase (NOX-2) aktivitet i perivaskulært fettvev [34]. Vaskulært oksidativt stress forårsaker viktigste epigenetiske endringer som oppstår under aldring, og det ender med en tidlig aldringsprosess [35]. Utvikling av ROS-produksjon og oksidativt stress i det biologiske systemet avhenger i stor grad av mitokondriell dysfunksjon, i tillegg til NOX-2, endotelial xanthinoksidase, ukoblet eNOS og lipoksygenase [36]. Antioksidantegenskaper til kostholdsmidler kan nøytralisere ROS-generering via økt antioksidantkapasitet [26]. Ginkgo Biloba-ekstrakt beskytter mot utvikling av aterosklerose ved å redusere ROS-generering og lipoksygenaseaktivitet ved OxiLDL-indusert endoteldysfunksjon [37]. I tillegg kommer ulike fenolforbindelser ogflavonoider fraspiselige planter og korn har egenskapen til å rense ROS og lipidperoksidasjon [38]. Rødbeteskall (Beta vulgaris) metanolisk ekstrakt har antioksidantpotensial på grunn av tilgjengeligheten av høy fiber, antocyaniner og flavonoider som vitexin og betanin [39]. I denne studien ble BPME valgt for å identifisere den mitokondrieavhengige mekanistiske tilnærmingen for å oppdage dens effekt på mitokondriell membranpotensial, LPO-slukking og hemming av vaskulære betennelsesrelaterte mRNA-ekspresjonsnivåer. MTT-analyse bekreftet at BPME betydelig økte celleproliferasjonen, som bekreftet av den økte nukleære integriteten i PI-farging med den effektive dosen på 0.2 µg/mL BPME versus testet 0.1 µg/mL av BPME. Identifikasjon av effektiv dose med lav konsentrasjon og høyeste aktivitet kan anses som fysiologisk trygt. Vi fant FL-fluorescensmikroskopisk farging av JC-1, og mitokondriemembranpotensialet ble gjenopprettet både i normal og H2O{{10}}indusert eksternt stimulert oksidativt stresset HUVEC etter 0,2 µg/mL BPME behandling. Mitokondriell dysfunksjon endrer oksidativ fosforylering, som ikke klarer å transformere oksygen (O2·−) radikaler til H2O2 og H2O av glutationperoksidase. På grunn av utilstrekkelig ROS-avgiftning eller ukontrollert ROS-produksjon, er økt mitokondrielt oksidativt stress forbundet med aterosklerose [40]. Rødbeteskallekstrakter gjenopprettet effektivt mitokondriemembranpotensialet, noe som med suksess økte ROS-avgiftning og H2O2-generering. Annexin V/PI-fargingsanalyse bekreftet at BPME-behandling opprettholdt den levedyktige celleprosenten og forbedret celleproliferasjonsstadiet både i normale HUVEC-er og HUVEC-er med oksidativt stress indusert av H2O2. I denne sammenheng har Choo et al. [41] bekreftet at etter generering av overdreven ROS eller eksogen H2O2 på det iskemiske stedet, kan transplanterte mesenkymale stamceller (MSCs) svekke selvspredning og multi-lineage kapasitet. I regenerativ medisin er vaskulære glatte muskelceller de viktigste regulatorene av de kontraktile tonusarteriene ved å opprettholde arteriell perifer motstand, blodtrykksregulatorer, blodkar og reparasjon av arterier [42]. I tillegg er aldersindusert fenotypemodulering av ECs assosiert med redusert cellulær kontraktilitet og økt cellealderdom. Ved kontinuerlig stress eller på grunn av redusert mekanosensitivitet, identifiseres redusert tilpasning av mikromiljøsignaler i gamle glatte muskelceller [43]. De nåværende resultatene bekreftet at BPME-behandlingen opprettholdt den levedyktige cellepopulasjonen, som bevist av angiogenesekapasiteten. Den identifiserte spredningskapasiteten til BPME på HUVEC-er har blitt støttet av reduksjonen i LPO-ekspresjon og økte antioksidantgenuttrykk. ROS og LPO genereres i utgangspunktet fra mitokondriekomplekset (I og III) og NOX-4 under celleproliferasjon eller differensiering [44]. Overdreven ROS reagerer og skader biomolekylene, spesielt endrer integriteten til genomisk DNA, som er kritisk for cellulær spredning og funksjoner [45]. Det er imidlertid bekreftet at inntak av antioksidantpolyfenoler, som epigallokatekin og tokoferol, beskytter cellene mot oksidativt stress og øker spredningskapasiteten [46]. I vår studie ble mRNA-ekspresjonsnivåene av LPO redusert, og NOS-3, Nrf-2 og eNOS ble funnet å være to ganger økt i HUVEC-er med oksidativt stress indusert av H2O2. eNOS er den dominerende isoformen av NOS, ansvarlig for de fleste NO·produktene i glatte muskelceller og vaskulært vev. NO· utvider alle typer vaskulære kar og beskytter blodplateaggregering og leukocyttadhesjon i ECs [47]. Så langt har det vært mange motstridende rapporter om kardiovaskulære risikofaktorer, og endoteldysfunksjon har vært assosiert med redusert eller økt eNOS-uttrykk [48]. Forhøyet ekspresjon av eNOS observert ved vaskulær sykdom, som sannsynligvis er en konsekvens av overflødig produksjon av H2O2. O2·−, et dismutasjonsprodukt, kan øke eNOS-ekspresjonen gjennom transkripsjonelle og post-transkripsjonelle mekanismer [49]. Patogenese av den vaskulære sykdommen er ledsaget av en akselerert nedbrytning av NO· etter reaksjon med O2·−, og til slutt, ONOO−-form, noe som fører til eNOS-frakobling og NOX-enzymdysfunksjon [50]. Oksidativt stress har blitt undertrykt av antioksidantenzymer, og mRNA-nivåer av GSK-3 og GPX er økt etter BPME-behandling. BPME inneholder flere fytokjemikalier som er biologisk aktive, inkludert betalainer, flavonoider, polyfenoler, terapeutiske enzymer, askorbinsyre, dehydroaskorbinsyre (DHAA) og uorganisk nitrat (NO3), og disse kan være involvert i oppreguleringen av antioksidantkapasiteten i HUVEC. I denne sammenheng har Cha et al. (2014) [51] rapporterte at klorogensyre effektivt beskytter mot oksidativt stress-indusert DNA-skade i humane keratinocytter. Endotelin-1 (Edn-1), en endotelavledet vasokonstriktor, utfører glattmuskelcellemigrasjon og fungerer som en antiapoptotisk faktor i celler med nitrogenoksidindusert stress [52,53]. Prosessene med vaskulær remodellering, migrasjon, proliferasjon og ekstracellulær matriseakkumulering har blitt stimulert av både Edn-1 og NO [54,55]. Vi observerte økt Edn-1-uttrykk etter BPME-behandling i HUVEC-er med oksidativt stress. Ved oksidativt stress eller LPO-akkumulering er det tidlige stadiet av vaskulær betennelse adhesjonen av leukocytter til endoteliale glatte muskelceller, det er fremtredende for de kritiske hendelsene med iskemi og aterosklerose [56]. Det formidles av VCAM- og ICAM-uttrykk; det har blitt stimulert av mange av kjemokinene og kjemotaksimidlene, slik som NF-KB, IL-1 og TNF-uttrykk [57]. Inhibering av IL-1-aktivering etterfulgt av adhesjonsmolekylekspresjon har blitt oppnådd av kostholdsfenolforbindelsen ellaginsyre [58]. Behandling med BPME mot eksternt stimulerte HUVEC-er med oksidativt stress reduserte signifikant de vaskulære cellespesifikke proinflammatoriske faktorene, slik som VCAM, ICAM, NF-KB, IL-1 og TNF-ekspresjonsnivåer. I denne sammenheng har Crespo et al. [59] rapporterte at kaempferol og quercetin hemmet pro-inflammatoriske gener, som henholdsvis VCAM, ICAM, NF-KB og IL-1 uttrykk. Totalt sett favoriserte hemmingen av oksidativt stress og vaskulær betennelsesrelatert genekspresjonspotensial av BPME uttrykket av vaskulære cellevekstfaktorer og potensielt hjulpet vaskulær celleproliferasjon og vekst.
5. Konklusjoner
De nåværende funnene bekrefter at det økte uttrykket av antioksidantgener var assosiert med slukking av oksidativt stress, og bidro til å overvinne svekkelsen av HUVEC-spredning og angiogenese. Svart hvitløk som inneholder hydroksymetylfurfural undertrykker den inflammatoriske effekten av TNF-indusert monocyttcelleadhesjon til HUVEC-er og undertrykker ytterligere ROS-generering, VCAM-1-ekspresjon og NF-KB-aktivering [60]. I tillegg har He et al. [61] bekreftet at hydroksymetylfurfural har potensial til å beskytte ECs mot hypoksi. Rødbeteskall er også identifisert å omfatte flavonoider, furan og antioksidantkomponenter, som 5-hydroksymetylfurfural, metylpyruvat, furfural og 2,3-dihydro-3,5- dihydroksy-6-metyl-4H-Pyran-4-on; disse komponentene er ansvarlige for den forbedrede antioksidantkapasiteten og undertrykkelsen av proinflammatoriske vaskulære glatte muskelcellers adhesjonsmolekyler. Rødbeteskall har blitt brukt som et stimulerende middel for antioksidantbassenger for å dempe den ytre stimulansen eller den indre patologiske stimulansen av peroksidativt cellulært stress. Funnene våre viste at komponentene i rødbeter hjelper til med å redusere metabolsk stress og betennelse i HUVEC-er, noe som kan være gunstig for vaskulær celleproliferasjon og angiogenese.
Forfatterbidrag:
Konseptualisering, LNA-H. og S.-BP; metodikk, LNA-H. og S.-BP; programvare, GS; validering, LNA-H. og S.-BP; formell analyse, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) og GS; undersøkelse, LNA-H., S.-BP og AMA-D.; ressurser, LNA-H.; datakurering, S.-BP og LNA-H.; skriving—originalt utkast til utarbeidelse, LNA-H. og S.-BP; skriving – gjennomgang og redigering, LNA-H., AMS, GS og AAA (Amna Abdullah Alotiby); visualisering, S.-BPog AAA (Ali A Alshatwi); tilsyn, LNA-H. og S.-BP; prosjektadministrasjon, LNA-H.; finansieringsoppkjøp, LNA-H. Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet. Finansiering: Forfatterne takker dekanatet for vitenskapelig forskning ved King Saud University for å ha finansiert dette arbeidet gjennom forskningsgruppe nr : Dataene presentert i denne studien er tilgjengelig på forespørsel fra den tilsvarende forfatteren.Interessekonflikter: Det er ingen interessekonflikt for denne studien.
Referanser
1. Abdolmaleki, Z.; Arab, H.-A.; Amanpour, S.; Muhammadnejad, S. Anti-angiogene effekter av etanolisk ekstrakt av Artemisia sieberi sammenlignet med dets aktive stoff, artemisinin. Rev. Bras. Farmacogn. 2016, 26, 326–333. [CrossRef]
2. Yoo, SY; Kwon, SM Angiogenese og dens terapeutiske muligheter. Medit. Inflflamm. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angiogenese ved kreft, vaskulære, revmatoide og andre sykdommer. Nat. Med. 1995, 1, 27–31. [CrossRef]
4. Hoeben, A.; Landuyt, B.; Highley, MS; Wildiers, H.; Van Oosterom, AT; De Bruijn, EA Vaskulær endotelial vekstfaktor og angiogenese. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549–580. [CrossRef]
5. Ferrara, N.; Alitalo, K. Kliniske anvendelser av angiogene vekstfaktorer og deres inhibitorer. Nat. Med. 1999, 5, 1359–1364. [CrossRef]
6. Bysse, HF; Webster, NR Endotelets fysiologi. Br. J. Anaesth. 2004, 93, 105–113. [CrossRef]
7. Onat, D.; Brillon, D.; Colombo, PC; Schmidt, AM Menneskelige vaskulære endotelceller: Et modellsystem for å studere vaskulær betennelse ved diabetes og aterosklerose. Curr. Diabetes Rep. 2011, 11, 193–202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Betennelse i aterosklerose: Fra vaskulær biologi til biomarkøroppdagelse og risikoprediksjon. Clin. Chem. 2008, 54, 24–38. [CrossRef]
9. Esper, RJ; Nordby, RA; Vilariño, JO; Paragano, A.; Cacharrón, JL; Machado, RA Endotelial dysfunksjon: En omfattende vurdering. Cardiovasc. Diabetol. 2006, 5, 4. [CrossRef]
10. Baudin, B.; Bruneel, A.; Bosselut, N.; Vaubourdolle, M. En protokoll for isolering og kultur av humane endotelceller i navlestrengen. Nat. Protoc. 2007, 2, 481–485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Angiogenese hemmet ved å drikke te. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Antioksidant- og prooksidantegenskaper til askorbinsyre og gallussyre. Food Chem. 2002, 79, 307–313. [CrossRef]
13. Dhalaria, R.; Verma, R.; Kumar, D.; Puri, S.; Tapwal, A.; Kumar, V.; Nepovimova, E.; Kuca, K. Bioaktive forbindelser av spiselige frukter med deres anti-aldringsegenskaper: En omfattende gjennomgang for å forlenge menneskeliv. Antioksidanter 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Ernæringsmessige, bioaktive og fysisk-kjemiske egenskaper til forskjellige rødbeteformuleringer. Matavhengig. 2017, 6. [CrossRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. Om utviklingen av paringsatferd i trær: Predasjon eller vær? Er. Nat. 1992, 139, 6. [CrossRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, VMF Betanin som flerveis oksidativt stress- og betennelsesmodulator: Et rødbetpigment med beskyttende effekter på kardiovaskulær sykdomspatogenese. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2020, 1–16. [CrossRef]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Bemerkelsesverdig grønnsak: Dens nitrat- og fytokjemiske innhold kan justeres i nye formuleringer for å være til fordel for helsen og støtte behandlinger for hjerte- og karsykdommer. Antioksidanter 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Saad, HH; Soliman, MM; El-Raey, MA; Shehata, SM; Barakat, A.; Yasir, A.; Sobeh, M. HPLC-ESI- MS/MS-analyse av beteblader (Beta vulgaris) og dets fordelaktige egenskaper hos type 1-diabetiske rotter. Biomed. Pharmacother. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singh, B.; Nathan, BS Kjemisk sammensetning, funksjonelle egenskaper og bearbeiding av rødbeter - en gjennomgang. Int. J. Sci. Eng. Res. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. Ernæringsmessig og funksjonelt potensial av Beta vulgaris cicla og rubra. Fitoterapia 2013, 89, 188–199. [CrossRef]
