Abstrakt:Fytokjemisk undersøkelse av frø av egyptisk mandarin (Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) ga tretten kjente forbindelser, 1–13. Strukturene til isolerte forbindelser ble tildelt ved å bruke 1D og 2D NMR og HRESIMS analyser. For å karakterisere den farmakologiske aktiviteten til disse forbindelsene, ble flere integrerte virtuelle screeningsbaserte og molekylær dynamikksimuleringsbaserte eksperimenter brukt. Som et resultat ble forbindelsene 2, 3 og 5 antatt identifisert som hyaluronidase-, xantinoksidase- og tyrosinaseinhibitorer. Den påfølgende in vitro-testingen ble gjort for å validere de in silicobaserte eksperimentene for å fremheve potensialet til disse flavonoidene som lovende hyaluronidase-, xanthinoxidase- og tyrosinase-hemmere med IC50-verdier fra 6,39 ± 0,36 µM til 7237. . Denne studien belyste potensialet til egyptisk mandarinappelsin sitt avfallsprodukt (dvs. frøene) som et hudhelsefremmende naturlig middel. I tillegg avslørte den anvendeligheten av integrert invers docking-basert virtuell screening og MDS-baserte eksperimenter for effektivt å forutsi det biologiske potensialet til naturlige produkter.

Glykosid av cistanche kan også øke aktiviteten til SOD i hjerte- og levervev, og redusere innholdet av lipofuscin og MDA i hvert vev betydelig, effektivt rense ulike reaktive oksygenradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) og beskytte mot DNA-skader forårsaket av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en sterk renseevne for frie radikaler, en høyere reduserende evne enn vitamin C, forbedrer aktiviteten til SOD i sædsuspensjon, reduserer innholdet av MDA og har en viss beskyttende effekt på sædmembranfunksjonen. Cistanche-polysakkarider kan øke aktiviteten til SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevev hos eksperimentelt senescent mus forårsaket av D-galaktose, samt redusere innholdet av MDA og kollagen i lunge og plasma, og øke innholdet av elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlenger hypoksitiden hos eldre mus, forbedrer aktiviteten til SOD i serum og forsinker den fysiologiske degenerasjonen av lunge hos eksperimentelt eldre mus. Med cellulær morfologisk degenerasjon har eksperimenter vist at Cistanche har den gode antioksidantevnen og har potensial til å være et medikament for å forebygge og behandle aldringssykdommer. Samtidig har echinacoside i Cistanche en betydelig evne til å rense DPPH-frie radikaler og har evnen til å rense reaktive oksygenarter og forhindre frie radikal-indusert kollagen-nedbrytning, og har også en god reparasjonseffekt på anionskader av tymin frie radikaler.

Klikk på Cistanche Tablets fordeler

【For mer informasjon: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Introduksjon

Mandariner, C. reticulata, er noen av de mest bemerkelsesverdige sitrusavlingene for fersk utnyttelse [1]. De blir ofte introdusert som 'tangeriner;' Imidlertid er 'Mandarin' det mest populære navnet. Flere hybrider og varianter av mandarinarter er utbredt i naturen [1]. De mest kjente, sofistikerte artene består av C. unshiu Marcovitch, C. nobilis Loureiro, C. deliciosa Tenore og C. reticulata Blanco [1,2]. Mandariner er blant de viktigste sitrusfruktene som høstes i mange land. Selv om avlingene hovedsakelig brukes til dessert, har de betydelig kommersiell betydning på grunn av deres essensielle oljer [3]. Sitrussmaker brukes i drikkevarer, godteri, kjeks og desserter [4]. C. reticulata peeling brukes også til smakstilsetninger av brennevin [4].

Invers docking er en type virtuell screeningmetode som kan manipuleres for å forutse de potensielle molekylære målene for en gitt sammensatt struktur. Tidligere har vi brukt denne effektive virtuelle screeningsmetoden for å bestemme de beste proteinmålene for flere isolerte naturlige produkter [5]. Imidlertid gir docking-skårene som resulterte fra dette foreløpige screeningstrinnet bare noe informasjon om den strukturelle komplementariteten mellom proteinmålene og spørringssammensetningsstrukturen [6]. Følgelig gir eksperimenter med molekylær dynamikksimulering (MDS), inkludert absolutt bindingsfri energi (∆Gbinding), mer strenge og pålitelige resultater som kan velges for in vitro-testing. Her utsatte vi C. reticulata-frø for en trinnvis kromatografisk isolasjon for å få en ide om de viktigste fytokjemikaliene i dette avfallsproduktet. Deretter undersøkte vi om disse fytokjemikaliene har visse farmakologiske effekter ved å utsette dem for en trinnvis i silico-basert analyse som ble initiert av en omfattende invers docking og endte med flere MDS-eksperimenter. Potensialet til de bioaktive fytokjemikaliene avledet fra C. reticulata-frøene kaster lys over den høye kapasiteten til spiselige frukters avfallsprodukter som et stort reservoar for helsefremmende midler.

2. Materialer og metoder

2.1. Plantemateriale

C. reticulata-frukter ble samlet inn i januar 2021 fra en lokal region i Beni-Suef, Egypt, og autentisert av en senior botaniker, Prof. Dr. Abd El-Halim A. Mohammed Institutt for flora- og fytotaksonomiforskning; Hagebruksforskningsinstituttet; Dokki; Kairo; Egypt). Et eksemplar av fruktene ble oppbevart under bilagsnummer 2021-BuPD 80 ved farmakognosiavdelingen; School of Pharmacy; Universitetet i Beni-Suef; Egypt).

2.2. Kjemikalier og reagenser

Etylacetat (EtOAc), metanol (MeOH), n-heksan (n-heks), etanol (EtOH), diklormetan (DCM) og n-butanol (n-BuOH) ble anskaffet fra El-Nasr Company, Egypt. Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA, ga deutererte løsningsmidler for NMR-analyse, så vel som løsemidler med høy renhet for HPLC, spektroskopiske og kromatografiske analyser (f.eks. metanol-d4 (CD3OD), dimetylsulfoksid-d6 (DMSO), kloroform -d (CDCl3), metanol for HPLC, HPLC-kvalitet vann og HPLC-kvalitet acetonitril). For kromatografisk isolering, Sephadex LH20 (0,25–0,1 mm, GE Healthcare, Sigma-Aldrich; CA, USA) og silikagel (E-Merck, Sigma-Aldrich, CA, USA) ble brukt. For vakuum-væskekromatografi ble en silikagel for TLC (Pharmaceuticals and Chemicals; El-Nasr Company; Cairo, Egypt) benyttet (VLC). Forbelagt silikagel (E-Merck, Darmstadt, Tyskland) ble brukt for TLC-studier. Produserte flekker ble identifisert av para-anisaldehyd etter oppvarming ved 110 ◦C [7]. Alt materiale for biologiske undersøkelser kom fra Sigma Chemical Company (SCC; CA, USA).

2.3. Spektralanalyser

NMR-signaler ble oppnådd ved 400 for 1H-NMR og 100 MHz for 13C-NMR. CDCl3-d, CD3OD-d4 og DMSO-d6 løsningsmiddeltoppene ble brukt som referansesignaler. NMR-signalet ble oppnådd ved bruk av en NMR-maskin Bruker Advance-III 400 MHz (Bruker AG-Billerica, California, MA, USA).

Massedata med høy oppløsning ble samlet inn ved hjelp av en Acquity-Ultra-Performance-LiquidChromatography-maskin koblet til et Quadrupole-Time-of-Flight-Hybrid-Mass-Spectrometer (Waters, Milford, MA, USA). En Agilent/1260-Infinity-preparative-HPLC ble brukt for å oppnå HPLC-kromatografiske separasjoner.

2.4. Fremstilling av C. reticulata frøekstrakt

C. reticulata frø (1 kilogram) ble kjøpt ferske og deretter lufttørket i skyggen. Etter det ble frøene revet ved hjelp av en slipemaskin (Henan, Kina). Det pulveriserte produktet ble deretter ekstrahert grundig med 70 prosent EtOH (1 L × 5). Det resulterende flytende ekstraktet ble konsentrert ved bruk av en roterende fordamper (Buchi-Rotavapor-R-300, ColeParmer, Vernon Hills, IL, USA) under vakuum ved 45 ◦C for å gi 100 g rå tørrekstrakt, som deretter ble fordelt ved bruk av en serie løsemidler med økende polaritet: n-Hex-DCMEtOAc-n-BuOH. Fraksjoner I (24,0 g), II (5,0 g), III (3,0 g) og IV (6,0 g) ble oppnådd ved å fordampe den separerte organiske fasen ved redusert trykk. Alle ekstrakter og fraksjoner ble lagret ved 4 ◦C for påfølgende fytokjemisk og biokjemisk analyse.

2.5. Isolering av C. reticulata frøs viktigste naturlige produkter 

TLC-silikagelkolonne ble brukt for å eksponere fraksjon I (20 g) for normal VLC. EtOAc og n-Hex suksessiv eluering (0–100 prosent, 5 prosent økende) ble brukt. Tre underfraksjoner (I1–I3) ble oppnådd ved å samle identiske fraksjoner og fordampe dem under redusert trykk. På en annen silikagelkolonne ble subfraksjon I1 (1,0 g) omfattende fraksjonert. Kromatografisk eluering ble utført med n-Hex til EtOAc, gradientblandinger (0–10 prosent, 1 prosent stigende, 100 ml hver) for å gi forbindelse 13. (10 mg).

Underfraksjon I2 (50 mg) ble ytterligere kromatografert på silikagel-60 (100 × 1 cm, 20 g). Den kromatografiske prosedyren ble utført ved å bruke DCM: MeOH, isokratisk blanding (0,5 prosent, 500 ml) for å gi forbindelsene 8 (20 mg) og 9 (15 mg). Underfraksjon I3 ble noe fraksjonert på silikagel 60 (100 x 1 cm, 20 g). Eluering fremstilt ved bruk av DCM: MeOH, isokratisk blanding (0,5 prosent, 500 ml) for å gi 10 (20 mg).

TLC silikagelkolonne ble brukt for å eksponere fraksjon II (2,5 g). DCM: EtOAc (0–100 prosent , øker med 5 prosent ) ble brukt til å eluere prøvene. De produserte avløpsvannene ble mottatt i 250 ml deler. Identiske fraksjoner ble oppnådd og redusert til to underfraksjoner (II1–II2) ved redusert trykk. På en annen silikagelkolonne ble subfraksjon I1 (1,0 g) omfattende fraksjonert. Forbindelse 5 ble eluert ved bruk av DCM: EtOAc (0–10 prosent, 1 prosent stigende, 100 ml hver) (10 mg).

Underfraksjon I2 (50 mg) ble ytterligere kromatografert på silikagel60 (100 x 1 cm, 20 g). Kromatografisk eluering ble påført ved bruk av DCM til MeOH (isokratisk eluering; 0,5 prosent, 500 ml) for å tilby forbindelsene 11 (20 mg) og 12 (15 mg).

Ved normal VLC ble fraksjon IV (6,0 g) separert ved bruk av silikagel. DCM: EtOAc (0–100 prosent, 5 prosent stigende, 250 ml hver) ble brukt til å eluere prøvene. De kromatografiske avløpene ble mottatt i trinn på 250 ml.

Identiske fraksjoner ble gruppert og redusert under redusert trykk for å gi fem underfraksjoner (IV1–V5); underfraksjonene IV1, IV2, IV3 og IV4 ble bare litt kromatografert på en Sephadex-LH20-kolonne eluert med MeOH for å gi 4 (30 mg), 6 (50 mg), 7 (70 mg) og 1 (15 mg, henholdsvis, mens underfraksjon IV5 var signifikant pur (10 mg).

2.6. I Silico Study

2.6.1. Invers dokking

De sannsynlige molekylære målene for de separerte flavonoidene ble konkludert ved å utsette deres strukturer for en virtuell screening avhengig av invers docking mot nesten alle proteiner som ble delt ut i Protein-Data-Bank; PDB.

Den nettbaserte IdTarget-plattformen ble brukt for dette trinnet. Dette sølle screeningsprogrammet for virtuell struktur bruker en spesiell invers docking-metode, nemlig DivideConquer-Docking, som konstruerer begrensede overlappende nettverk, noe som gjør proteinets utforskning mer begrenset. Som et resultat kan den utføre et stort antall dokkinger på kort tid [8]. Resultatene ble beskrevet som en liste over rangeringer som spenner fra de verste til de beste. For å identifisere de optimale proteinmålene for hver gitt struktur, brukte vi en affinitetsscore på -10 kcal/mol som en grenseverdi (tabell 1).

Molecular dynamics simulation (MDS) eksperimenter ble utført som tidligere rapportert av Alhadrami et al. 2021 [6]. MDS-maskinen til Maestro-programvaren (dvs. Desmond v. 2.2; Hamburg, Tyskland) ble brukt for å drive MDS-eksperimenter [9–11]. OPLS-Force-Field ble brukt for simuleringskjøringer.

Forberedelsen av proteinstrukturer ble utført av System-Builder-algoritmen, der de ble pakket inne i en ortorombisk vannboks (20 Å3) ved bruk av TIP3P-vannmodellen sammen med Na pluss og Cl−ioner, {{ 16}}.15 M for hver av dem. Deretter ble de optimaliserte modellerte strukturene utsatt for en foreløpig ekvilibrering i 10 ns. Ligandstrukturer ble automatisk parameterisert under strukturforberedelsestrinnet i henhold til OPLSForce-feltet. Metallholdige proteiner som MMP-er som involverer histidin-Zn pluss 2-kompleks i det effektive stedet bør parameteriseres under proteindannelsestrinnet. For å fortsette, bør en heterotilstand settes opp for heteroatomer som Zn (Generer heterostater). Denne funksjonen er en del av maestroens proteinformasjonsveiviser. Dette trinnet vil lette utviklingen av en riktig heterotilstand eller koordinert kovalent tilstand, for heteroatomet (dvs. Zn pluss 2) i et nettverk med proteinet slik at kraftfelt som OPLS raskt kan observere sinkatomet. For reproduksjoner utført av Nano-scale Molecular Dynamics-programvare (NAMD 3.0) [12], ble topologiene og parametrene til modellerte strukturer bestemt av nettplattformen Ligand Reader and Modeler. Harmoniske Tcl-krefter ble brukt for å holde Zn pluss 2 på plass.

Beregningen av bindingsfri energi (∆Gbinding) ble utført som tidligere beskrevet av Alhadrami et al. 2021 [6]. ∆Sliping ble utført ved å bruke prosedyren for fri energiforstyrrelse (FEP) [12], som er detaljert i Kim et al sin publikasjon. I et nøtteskall beregner denne teknikken den nødvendige tilgjengelige energien ∆Gbinding ved å bruke ligningen ∆Gbinding=∆GComplex − ∆GLigand. Verdien av hver ∆Grinding beregnes ved å bruke NAMD-programmet i separate eksperimenter.

Alle inndatafiler kan utarbeides via nettstedet CharmmGUI. Filene ble deretter brukt til å produsere de planlagte ∆Gbinding-beregningene ved å bruke FEP-protokollen i NAMD. Ekvilibreringen ble senere satt i NPT (300 K, 1 atm, Langevin-Piston-Pressure "Complex"-"Ligand") i eksistensen av TIP3P vannmodellen. Senere ble det produsert 10 ns FEP-simuleringer for hver struktur, og de siste 5 ns av de tilgjengelige energimengdene ble beregnet for de ferdige frie energiratene [12]. Til syvende og sist ble bindingsstillingene forutsett og evaluert ved å bruke VMD-programmet [13].

2.7. In vitro-analyse av hyaluronidase-aktivitet

Aktiviteten til hyaluronidase-hemmende ble dannet i henhold til den tidligere etablerte prosedyren gitt til Chaiyana et al. 2019 [14]. Den hemmende effekten mot hyaluronidaseaktivitet ble estimert ut fra følgende ligning: hyaluronidasehemming ( prosent )=(1 − A/B) × 100, hvor A og B er hyaluronsyrekarakteren etter behandling i eksistens eller mangel på prøven, separat. Som en positiv kontroll ble 6-O-palmitoyl-laskorbinsyre påført. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer.

2.8. In vitro-analyse av Xanthine Oxidase-aktivitet

Xanthinoksidase (XO) hemmende potensial ble utført i henhold til den tidligere beskrevne metoden [15]. Fargen produsert på grunn av frigjøring av hydrogenperoksid under prosessen med oksidasjon av XO ble målt ved 570 nm ved å bruke plateleseren EPOCH™ "MICROPLATE READER (BIOTEK)". 44 mikroliter xantinoksidasebuffer ble blandet med 2 µL xantinsubstratløsning og 2 µL XO. L-mimosin ble påført som en positiv kontroll. Dette eksperimentet ble utført i tre eksemplarer.

2.9. In vitro-analyse av tyrosinaseaktivitet

Aktiviteten til tyrosinaseinhiberende for hver flavonoid ble observert ved å bruke DOPAchrome-prosessen i samsvar med et skjema av Momtaz et al. 2008 [16], som ble modifisert fra Nerya et al. 2003 [17], og Curto et al. 1999 [18]. Den tyrosinaseinhiberende aktiviteten ble målt fra følgende ligning: inhiberende aktivitet (prosent)=(1 − A/B) × 100, (9) hvor A og B er absorbansene til blandingen i nærvær eller fravær av test flavonoid, henholdsvis. Hvert eksperiment ble utført i tre eksemplarer.

3. Resultater og diskusjon

3.1. Fytokjemisk undersøkelse av C. reticulata frø

Ved å bruke UV, 1H og DEPT-Q NMR, i tillegg til sammenligning med litteraturen og bruk av noen autentiske prøver, de kjente forbindelsene kaempferol 1 [19], kaempferol-40 -O- -Dglucopyranoside 2 [19], kaempferol -7-O- -D-glukopyranosid 3 [19], 2-hydroksygenistein 4 [19], hesperetin 5 [19], 3000 (1000-O- - D-glukopyranosyl)-sukrose 6 [20], 6(1000 -O- -Dfructofuranosy)-30 (1"-O- -D-glukopyranosyl)-sukrose 7 [20 ], 1-O-elaidoyl-glycerol 8 [21], 1- O-oleoyl-2-palmitoyl-glycerol 9 [22], 1-O-oleoyl-glycerol 10 [ 21], (E)-3-((4-metylheptyloksy)karbonyl)akrylsyre 11 [23], (E)-3-((6-metylnonyloksy) karbonyl)akrylsyre 12 [23] og -sitosterol 13 [24] (Figur 1) ble identifisert fra det rå etanoliske ekstraktet av C. reticulata frø. Alle identifiserte forbindelser 11 og 12 ble separert her for første gang fra Citrus-slekten ( Figur 1 og S1–S28. Det er verdt å merke seg at, i motsetning til de vidt distribuerte flavanonene og flavonene i C. reticulata luftdeler, inkludert fruktene, så flavonoler ut til å være den dominerende typen flavonoider i frøene.

3.2. I Silico Investigation

For å karakterisere den biologiske aktiviteten til de isolerte forbindelsene, utsatte vi dem for en serie in-silico-baserte analyser. Først fokuserte vi på de isolerte flavonoidene (1–5) for vårt første virtuelle screeningstrinn fordi flavonoider er velkjente bioaktive plantesekundære metabolitter. I tillegg er de gjenværende isolerte forbindelsene (6–13) vanlige primære metabolitter som sannsynligvis ikke har noen terapeutisk effekt.

Strukturene til flavonoider 1–5 ble utsatt for en docking-basert virtuell screening mot nesten alle proteiner som var vert i PDB. Nettplattformen, nemlig idTarget, ble brukt for denne foreløpige virtuelle screeningsoppgaven [8]. De gjenvunne skårene ble hentet som en liste fra den største negative verdien til den minste. Vi satte en avgjørende affinitetsscore på -10 kcal/mol som en utskjæringsverdi for å skille ut de gode målene for hver isolert flavonoid (1–5). Flere interessante molekylære mål ble funnet å være sannsynligvis gode mål for disse relaterte forbindelsene, inkludert proteinkinaser og syntaser (tabell 1).

Interessant nok ble tre vanlige molekylære mål rapportert mellom disse flavonoidene, hyaluronidase, xantinoksidase og tyrosinase-enzymer. Disse enzymene er relatert til å opprettholde sunn hud [25–30], og derfor identifiserte det foreløpige virtuelle screeningstrinnet disse flavonoidene som sannsynlige hudpleiefremmende midler.

3.3. Molecular Dynamics Simulering og Absolutt Binding Free Energy Calculation

For ytterligere å støtte det foreløpige dokkingbaserte screeningstrinnet, estimerte vi de absolutte frie bindingsenergiene (∆Gbinding) til forbindelsene 1–5 med hyaluronidase, xanthine oxidase og tyrosinase enzymer ved å bruke den MDS-avhengige metoden, nemlig fri energi perturbasjonsmetoden ( FEP) [26,31].

Som vist i tabell 2 var det bare forbindelsene 2, 3 og 5 som var i stand til å oppnå den høyeste affiniteten til hyaluronidase, xanthine oxidase og tyrosinase-enzymer med ∆Grinding-verdier fra -8,1 til -9,9 kcal/mol. De resterende forbindelsene fikk ∆Gbindingsverdier høyere enn −6 kcal/mol.

Ytterligere 50 ns MDS-eksperimenter ble utført for å undersøke interaksjonene og bindingsstabiliteten til forbindelsene 2, 3 og 5 med hyaluronidase, xanthine oxidase og tyrosinase enzymer. Som vist i figur 2, oppnådde både forbindelse 3 og den samkrystalliserte liganden lignende bindingsstabilitet inne i enzymets bindingssete gjennom MDS med RMSD på ~2,8 Å fra de første dokkingstillingene. Forbindelse 2 0 s RMSDs var også som for forbindelse 3 til 28,7 ns når den begynner å avvike litt høyere fra forbindelse 3 og den kokrystalliserte liganden for å oppnå en gjennomsnittlig RMSD på 3,8 Å gjennom MDS. Det siste øyeblikksbildet avledet fra MDS av forbindelsene 2 og 3 og den kokrystalliserte liganden indikerte at TYR-75, ASP-129 og GLU-131 var de vanlige interagerende aminosyrerestene via H- binding.

Når det gjelder xanthinoksidase, oppnådde forbindelse 3 stabil binding inne i dets aktive sete gjennom MDS, og registrerte en gjennomsnittlig RMSD på 2,6 Å som var konvergent til den til den kokrystalliserte inhibitoren (RMSD ~2,4 Å). En slik stabil binding av forbindelse 3 skyldtes åpenbart H-bindingsnettverket som den etablerte med LYS-771, PHE-798, GLU-802, SER-876, ARG{{ 12}}, PHE-911, ARG-912 og THR-1010 (figur 3).

Til slutt var forbindelse 5 også stabil inne i tyrosinasens aktive sete gjennom 50 ns MDS med en gjennomsnittlig RMSD-verdi på 4,9 Å, som var høyere enn den for den kokrystalliserte inhibitoren (RMSD ~3,8 Å). Som vist i det siste MDS-avledede øyeblikksbildet, var forbindelse 5 i stand til å samhandle med de to Zn2 pluss-ionene på samme måte som den ko-krystalliserte inhibitoren. I tillegg ble den stabilisert med flere H-bindinger med LYS-198, GLY-209, TYR-362, ARG-374 og THR-391 (Figur 4) ).

【For mer informasjon: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】