Metaanalyse av NAD(P)(H) kvantifiseringsresultater viser variasjon mellom pattedyrvev
Jun 01, 2023
Nikotinamid Adenin Dinukleotid (NAD pluss) spiller en viktig rolle i energimetabolisme og signalveier som kontrollerer viktige cellulære funksjoner. Deøkt interesse for NAD pluss metabolismeogNAD pluss-forsterkende terapierhar forsterket nødvendigheten av nøyaktig NAD pluss kvantifisering. For å undersøke de publiserte NAD(P)(H)-tiltakene på tvers av pattedyrvev, utførte vi enmetaanalyse av eksisterende data. Et Ovid MEDLINE-databasesøk identifiserte artikler med NAD(P)(H)-kvantifiseringsresultater hentet fra pattedyrvev publisert mellom 1961 og 2021. Vi screenet 4890 poster og hentet ut kvantitative data, samtkvantifiseringsmetoder, pre-analytiske forhold og fagkarakteristikker. De ekstraherte fysiologiske NAD(P)(H)-konsentrasjonene iulike vevfra mus, rotter og mennesker, avslørte en viktig inter- og intra-metode variasjon som utvidet seg til nyere publikasjoner. Dette fremhever det relativt dårlige potensialet for krysseksperimentelle analyser for NAD(P)(H) kvantitative data og viktigheten av standardisering for NAD(P)(H) kvantifiseringsmetoder ogpre-analytiske prosedyrerfor fremtidig preklinisk ogkliniske studier.
Klikk her for å få Cistanche antioksidasjonsegenskaper og antialdringsprodukter
Nikotinamid adenindinukleotid spiller en dobbel rolle som enreduksjon–oksidasjon (redoks)koenzym, i dets oksiderte (NAD(P) pluss ) ogreduserte (NAD(P)H) former, og som enco-substrat (NAD(P) pluss) for enzymer involvert i deacylering1, mono- og poly-ADP-ribosylering2,3, og dannelsen av adeninbaserte andre budbringere4–7. Te NAD(P) pluss /NAD(P)H-forholdet er en viktig indikator på den intracellulære redokstilstanden og spiller en kritisk rolle i reguleringen av sentrale metabolske veier8,9. For eksempel er NAD plus essensielt for glykolyse, sammen med trikarboksylsyre (TCA) syklusen, for å gi reduserende ekvivalenter under generering av adenosintrifosfat (ATP), den viktigste energikilden for cellen8,9. Når NAD pluss er begrenset, kan det også regenereres fra NADH ved fermentering av pyruvat for å produsere laktat i pattedyrceller, og dermed opprettholde cellulær redoksbalanse25. NAD pluss og NADH kan også fosforyleres til henholdsvis NADP og NADPH av NAD pluss kinaser (NADKs)10,11. NADPH er avgjørende for reduktiv biosyntese, signaltransduksjon, cellulære antioksidantresponser, og spesielt glutationreduksjon12–14. I cytosolen reduseres NADP pluss til NADPH av glukose-6-fosfatdehydrogenase og 6-fosfoglukonatdehydrogenase fra pentosefosfatveien (PPP), blant andre reaksjoner13. Mens i mitokondriene opprettholdes NADPH-produksjonen av forskjellige reaksjoner, inkludert de som er avhengige av nikotinamid-nukleotidtranshydrogenase (NNT) og isositratdehydrogenaser (IDH2) enzymaktivitet15. Som et resultat har NAD(P)(H)-status vist seg å påvirke cellesignalering og metabolisme, energihomeostase, mitokondriell biogenese, oksidative stressresponser og DNA-vedlikehold og reparasjon16–18. Siden utviklingen av aldersrelaterte sykdommer, som fedme19, ikke-alkoholisk fettleversykdom20,21, nevrodegenerasjon22, mitokondrie23 og kardiovaskulære24 sykdommer, og muskelatrofi eller dystrofi25, har videre blitt knyttet til endringer i NAD pluss-relaterte metabolitter, tilnærminger. rettet mot å opprettholde NAD pluss homeostase er for tiden under utredning.
Utover vanlige redoksoverganger, kan NADP pluss konsumeres ved å bytte nikotinamidgruppen med nikotinsyre i en reaksjon katalysert av cADPR-syntaser, slik som CD38, for å danne den andre budbringeren NAADP, som er involvert i kalsiummobilisering, hormonsekresjon og immuncelle. spredning6,7,26. NAD pluss kan også konsumeres når det fungerer som et co-substrat for å danne nikotinamid (NAM), som kan brukes som et substrat for å regenerere NAD plus via NAM salvage pathway. NAM kan også metyleres for å danne 1-metyl NAM (meNAM), som kan oksideres videre til nedbrytningsproduktene N1-metyl-2-pyridon-5-karboksamid (2py) og N1-metyl-4-pyridon-3-karboksamid (4py). Til syvende og sist kan de metylerte katabolittene fjernes fra kroppen via urin27,28. NAD pluss-poolen kan også reduseres ved forbruk av NADP plus via en base-utvekslingsreaksjon for dannelsen av den andre budbringeren NAADP14. Å opprettholde bassenget av NAD pluss krever derfor biosyntese via Preiss-Handler-veien (starter med det vanlige vitamin B3-molekylet niacin (NA; nikotinsyre)), de novo biosynteseveien (starter med aminosyren tryptofan (Trp)) eller regenerering fra konvertering av NAM via bergingsveien til NMN og deretter til NAD pluss. Til slutt er bergingsveien også viktig for biosyntesen av NAD pluss fra nikotinamid ribosid (NR), en alternativ form for vitamin B3 som finnes i matvarer, etter fosforylering av nikotinamid ribosid kinase til NMN og deretter konvertering til NAD pluss via bergingsveien .
Å forstå dynamikken til NAD plus-metabolomet har derfor blitt viktig og krever til slutt streng metabolittkvantifisering for bedre å forstå fuksen til NAD pluss-metabolitter under normal fysiologi, eller med sykdomsprogresjon eller sunn aldring. Et klart bilde av disse endringene er avgjørende for å koble endringer i NAD pluss metabolom til nedstrøms enzymatiske eller redoksreaksjoner, som holder nøkkelen til endringer i vevsfenotyper. Gitt den betydelige mengden tidligere rapporterte kvantitative data om NAD pluss metabolitter hos pattedyr, inkludert et økende antall rapporter hos mennesker, er det viktig og betimelig å oppsummere disse endringene under helse og sykdom. Tallrike studier har undersøkt komponenter i NAD plus-metabolomet hos gnagere og mennesker under forskjellige metabolske tilstander, aldre og sykdommer, men er likevel avhengige av forskjellige metoder for prøvepreparering eller kvantifisering. Prøveforberedelse er viktig for metabolitter involvert i redoksreaksjoner på grunn av potensiell nedbrytning og interkonversjoner under visse forhold29,30. For kvantifisering antas væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC–MS) og magnetisk resonansspektrometri (MRS) å være sensitive og spesifikke metoder31–33, mens enzymsyklusanalyser er de vanligste. Kvantitative LC–MS-metoder krever en omfattende inkludering av kvalitetskontroller for individuelle metabolitter som måles og for den totale matriseeffekten til prøvene, en effekt som forklarer varierende massespektrometriske responser for en gitt analytt når den måles i forskjellige løsninger. Uten disse kontrollene er LC–MS i beste fall semikvantitativ. I denne studien identifiserte vi betydelig variasjon i NAD(P)(H)-mål på tvers av gnager- og menneskestudier, og understreket behovet for riktige metoder for rapportering og standardisert prøvebehandling og analytiske protokoller. Samlet sett er sammenlignbare NAD(P)(H)-datasett på tvers av studier nødvendig for meningsfull tolkning av eksisterende og fremtidige data innen NAD pluss biologi.
Resultater
Metaanalyse av vanlige kvantifiseringsmetoder, sammen med arter, kjønn og vev studert.
Historisk sett var tidlige metoder brukt for NAD(P)(H)-kvantifisering basert på de spektrofotometriske eller fluorometriske egenskapene til disse metabolittene34,35. Nylig er enzymsyklusmetoder koblet til spektrofotometrisk eller fluorometrisk deteksjon mer vanlig brukt for å skille NAD(P)(H)-koenzymnivåer36–38. Det økende behovet for høy følsomhet og oppløsning i kvantifiseringen av disse ko-enzymene, sammen med nødvendigheten av å måle andre NAD pluss-relaterte metabolitter, førte til bruk av høyytelses væskekromatografi (HPLC) og LC–MS-teknikker. Av disse tilnærmingene har LC–MS blitt den foretrukne metoden, ettersom massespektrometri kombinert med væskekromatografi muliggjør spesifikk identifikasjon av eluerte forbindelser sammen med den ekstra fordelen ved å inkludere NAD(P)(H)-isotopmetabolitter som intern spike-in-kvalitet kontroller. Til tross for fordelene deres fremfor klassiske spektrofotometriske eller fluorometriske analyser, forblir HPLC og LC–MS begge dyre og tidkrevende, noe som forklarer hvorfor enzymsyklusanalyser vedvarer i nyere studier.
Ved å bruke en systematisk tilnærming, av de 241 kvalifiserte studiene (tilleggsmateriale 2), ble 205 studier som inkluderte en kvantitativ metaanalyse av NAD(P)(H)-konsentrasjoner i mus-, rotte- og menneskevev valgt for videre analyse. Av disse studiene brukte 46,7 prosent enzymsyklusanalyser, hvorav kolorimetrisk (40,9 prosent) eller fluorometrisk (5,8 prosent) deteksjon, mens 17,8 prosent brukte HPLC-metoder (koblet med UV- eller fluorescensdetektorer) og 13,2 prosent brukte LC–MS-analyser ( Fig. la). De fleste studiene inkluderte ikke en detaljert beskrivelse av metabolittekstraksjonsprosedyrene. Vanlig brukte ekstraksjonsprosedyrer besto imidlertid av enten ekstraksjonsbuffere med eller uten overflateaktive stoffer (Triton®, Tris, Dodecyl trimetylammoniumbromid), eller polare organiske løsningsmidler som acetonitril, metanol, etanol eller kloroform. Tidligere studier har vist at enzyminaktivering og optimale pH- og temperaturforhold var effektive for å bevare stabiliteten til de forskjellige NAD(P)(H)-formene30,39,40. Når de ble avslørt, ble prøver behandlet under lavtemperaturforhold, og ingen redokstilsetningsstoffer ble nevnt i de inkluderte studiene. Redoksreaksjoner ble begrenset av inaktivering av enzymene i prøvene før NAD(P)(H)-metabolittmålinger, vanligvis ved utfelling med løsningsmidler som etanol, metanol, acetonitril eller perklorsyre (PCA). Imidlertid var bruken av PCA sjelden på grunn av den syrelabile naturen til de reduserte formene (dvs. NADH og NADPH), samt nødvendigheten av et ekstra nøytraliseringstrinn. Blant studiene som rapporterte bruk av PCA under metabolittekstraksjonen (5,4 prosent), rapporterte 3,7 prosent bare NAD(P) pluss resultater eller brukte en andre ikke-sur ekstraksjonsmetode for riktig NAD(P)H-kvantifisering. Bare 1,7 prosent av studiene rapporterte NADH, total NAD(H) og/eller NAD pluss /NADH-resultater kun ved bruk av PCA-ekstraksjon. Den potensielle skjevheten fra disse studiene kunne ikke analyseres på grunn av de begrensede dataene.
Sammenligninger av gjennomsnittlige fysiologiske NAD(P)(H)-nivåer på tvers av vev for gnagere og mennesker.
For å hjelpe med å identifisere de forventede fysiologiske NAD(P)(H)-nivåene for det mest studerte muse-, rotte- og menneskevevet, samlet vi data fra alle kontroll- og villtypekohorter fra hver av de inkluderte studiene (tilleggsmateriale 2) ). Spesifikt registrerte vi gjennomsnittlige NAD(P)(H)-nivåer normalisert til vevsvekt eller, i tilfelle av blod, volum. Data fra studier som normaliserte metabolittnivåer til proteininnhold ble inkludert i vårt kompilerte datasett (tilleggsmateriale 2), men ble ikke brukt for videre analyse gitt det lave antallet rapporterte resultater. I tillegg, når det var mulig, beregnet vi NAD(P) pluss /NAD(P)H-forholdene, som en refleksjon av redokstilstanden, samt de totale NAD(P)(H)-nivåene (NAD(P) pluss pluss NAD (P)(H)) som er vanlige rapporteringsutganger for NAD(P)(H)-fikser. De ekstraherte dataene inkluderte også arter, stammer, alder, kjønn, kvantifiseringsmetode, diett og fôringsplan, prøvetype, prøveinnsamlingsmetode og tidspunkt for høsting (før eller post mortem).
Metaanalysen av NAD(H)-data identifiserte de gjennomsnittlige fysiologiske konsentrasjonene for NAD pluss og NADH i muse- (fig. 2a,b, tilleggsfigur 1a,b) og rotte (tilleggsfigur 2a,b) fra dyr yngre enn 14 måneder for mus og 18 måneder for rotter. Det ekstraherte området av fysiologiske NAD pluss/NADH-forholdsverdier og totale NAD(H)-nivåer (NAD pluss pluss NADH) ble plottet for mus (fig. 2c,d) og rotter (tilleggsfig. 2c,d). I motsetning til musestudiene, inkluderte ikke de fleste av de rapporterte rottedataene alderen på dyrene; Vi valgte imidlertid å inkludere disse dataene forutsatt at studien ikke klassifiserte kohortene deres som gamle. Av de mest fremtredende studerte vevene viser denne metaanalysen at median NAD pluss-nivået for leveren (596 nmol/g, n=26) er høyere enn alt annet vev i mus, mens det overraskende er skjelettmuskulatur (162,8 nmol) /g, n=9) viser en av de laveste medianverdiene per gram vev (fig. 2a). Disse resultatene kan enten innebære en redusert effektivitet i NAD pluss metabolittekstraksjon, på grunn av muskelens svært fibrøse natur, eller at det er viktige forskjeller i muskel NAD pluss metabolisme sammenlignet med andre svært metabolske vev, som lever og nyre.
Til tross for få kvantitative aldringsstudier, var NAD pluss-nivåer fra gamle mus i gjennomsnitt redusert i leveren, muskel og retinalt pigmentert epitel (RPE), sammenlignet med deres unge kohorter, og sammenlignet med gjennomsnittet av alle studier utført med yngre mus. enn 14 måneders alder (Supplerende Fig. 3). En meta-analyse av NADH og NAD pluss /NADH-forholdet i gamle dyr var ikke mulig gitt at bare én av disse kvantitative studiene utførte disse målingene.
Disse dataene viser mangelen på kvantitative NAD(H)-data hos aldrende dyr.
For dataene hentet fra studier med friske mennesker, varierte aldersområdene sterkt på tvers av studier (fra 15 til 92,3 år), og i de fleste tilfeller var dataene ikke stratifisert på tvers av disse alderen. Det mest målte menneskelige vevet inkluderte skjelettmuskulatur og komponenter av blod, på grunn av deres mindre invasive innsamlingsnatur (fig. 3a–d). Resultater fra annet humant vev (n= 1–2) vises i tilleggsfigur 4. Denne analysen viste en median NAD pluss konsentrasjon på 44,62 nmol/ml (n=23) i fullblod, med lignende NAD pluss-konsentrasjoner rapportert for røde blodceller ved 46,96 nmol/ml (n=7) (fig. 3a; tilleggstabell 1). Blodplasma NAD pluss-nivåer var imidlertid betydelig lavere med en median på 0.37 nmol/ml (n=8) (fig. 3a). Median NAD pluss-nivåer funnet i skjelettmuskulatur hos mennesker var 191,9 (n=4) nmol/g i våte muskelpreparater mot 1713 (n=3) nmol/g i frysetørkede preparater, en lav temperatur dehydreringsprosess som sannsynligvis konsentrerer metabolitter (fig. 3a). I det mer vanlig undersøkte vevet for NADH-målinger var mediannivåene i humane røde blodlegemer, plasma og frysetørket skjelettmuskel 1,75 nmol/ml (n =7), 0,39 nmol/ml (n=8) og 136,8 nmol/g (n=6), henholdsvis (fig. 3b). De tilsvarende median NAD pluss /NADH-forhold var 23,65 (n=8), 1,57 (n=7) og 12,7 (n=3) (fig. 3c). Interessant nok var median NAD pluss /NADH-ratio for røde blodceller (23,65) og frysetørket skjelettmuskulatur (12,7) (fig. 3c) flere ganger høyere enn de fleste muse- og rottevev (fig. 2c og tilleggsfig. 2c). , som indikerer en svært oksidativ redokstilstand med en overflod av tilgjengelig NAD pluss i disse menneskelige vevene. Når det gjelder muskelvev, kan dette ha implikasjoner når man vurderer translasjonspotensialet til gnagerstudier som har identifisert fordelene med å øke NAD pluss-nivåer i muskler. Imidlertid kan et forhøyet NAD pluss /NADH-forhold i muskel også være et resultat av forsinkede prøvefrysingsprosedyrer i et klinisk miljø, noe som kan føre til ikke-fysiologiske endringer i prøveredoksstatus.
De fysiologiske NADP(H)-nivåene i gnagervev ble kompilert, med den vanligste målingen i leveren. Muselever viste en medianverdi på 124,2 nmol/g NADP pluss (n=13) og 140,2 nmol/g NADPH (n=4) (fig. 4a,b) ), mens rottelever viste en median på 95,11 nmol/g NADP pluss (n=10) og 240,7 nmol/g NADPH (n=9) (tilleggsfigur 5a,b). Median NADP pluss /NADPH-ratio, avledet fra studier som målte begge metabolittene, var lavere enn 1 i de fleste muse- og rottevev (fig. 4c, tilleggsfig. 5c). Median totale NADP(H) (NADP pluss pluss NADPH)-nivåer i muse- og rottelever var 244,4 (n=3) (Fig. 4d) og 342.1 (n=9) (Supplerende Fig. 5d) , henholdsvis. Hos mennesker ble de vanligste målingene av NADP(H) utført i røde blodceller som viste en median på 33,2 nmol/ml for NADP pluss (n=14) og 22,4 nmol/ml for NADPH (n{{30} }) fra ikke-matchende studier, med et median NADP pluss /NADPH-forhold på 1,27 og en median total NADP(H) på 52,0 nmol/ml fra studier som målte begge metabolittene (n=11) (fig. 4e– h). Totalt sett er mengden av tilgjengelige data for NADP(H) sparsom i alle arter, noe som fører til lavere tillit til medianverdiene for hvert vev.
Analyse av skjevheter og variabilitet i NAD(P)(H) kvantifiseringsmetoder.
Gitt at et flertall av studiene inkludert i denne metaanalysen undersøkte NAD pluss-nivåer i leverprøver fra gnagere (fig. 1c,e), brukte vi både muse- og rotteleverfysiologiske NAD pluss-nivåer for å identifisere potensielle skjevheter i resultatene som tilsvarer til kvantifiseringsmetoden (fig. 5a,b). Gjennomsnittsalderen for mus inkludert i denne analysen var 17,9 uker (Rekkevidde: 2–55 uker), med 6 studier som ikke avslører alderen til dyrene. For rotter avslørte de fleste studier ikke alderen på dyrene bortsett fra tre som varierte fra 2 dager til 8 måneder. Ingen av studiene rapporterte bruk av gamle dyr. I muselever spenner det store området av de rapporterte konsentrasjonene for NAD pluss fra 1,8 til 1132 nmol/g av leveren med en gjennomsnittsverdi på 596.0 (n=26) (fig. 5a) , mens NADH-konsentrasjoner varierte fra 0,9 til 109 nmol/g vev med en gjennomsnittsverdi på 66,43 (n=6) (Supplerende Fig. 6a). Det er viktig at en variasjonskoeffisient på 52,5 prosent og 76,5 prosent ble beregnet for de gjennomsnittlige fysiologiske NAD pluss- og NADH-resultatene i henholdsvis muselever, målt ved flere kvantifiseringsmetoder, som viser omfanget av variasjonen på tvers av studier. Som forutsagt fra disse resultatene, viste gjennomsnittlig NAD pluss /NADH-forhold i muselever (3,41 pluss /− 3,16 SD, n=19) et like stort variasjonsområde med en CV på 92,7 prosent (Supplerende Fig. 6c) . Lignende variasjoner i NAD pluss- og NADH-mål ble også observert i rottelever (CV=42,6 prosent for NAD plus og CV=44,4 prosent for NADH). De tilsvarende konsentrasjonene for NAD pluss og NADH i rottelever varierte fra henholdsvis 159 til 796 (n=16) og 65 til 265 (n=12) nmol/g (fig. 5b, tilleggsfig. 6b) ), mens NAD pluss /NADH-forholdene viste en CV på 50.1 prosent (gjennomsnitt: 3.219 pluss /− 1.612 SD, n=23) (Supplerende Fig. 6d). Gjennomsnittsverdier og standardavvik for NAD pluss, NADH, total NAD(H) og NAD pluss /NADH-ratiodata i muse- og rottelever, gruppert etter kvantifiseringsmetode, er vist i tilleggstabell 2. Angående NADP(H)-nivåer og NADP pluss / NADPH-forholdet, lignende variasjon ble observert i levervev. NADP pluss-nivåer varierte fra 50,4 til 247,4 nmol/g vev for mus (Supplerende Fig. 8a) og fra 45,7 til 171 nmol/g vev for rotter (Supplerende Fig. 8b), mens NADPH-nivåer varierte fra 28 til 236,9 nmol/g vev for mus (tilleggsfigur 8c) og fra 90 til 409 nmol/g vev for rotter (tilleggsfigur 8d). Til slutt varierte NADP pluss/NADPH-forholdet fra 0,12 til 0,55 i muselever (tilleggsfigur 8e) og fra 0,12 til 1,44 i rottelever (tilleggsfigur 8f).
i det største spekteret av resultater (1,8 til 1132,3 nmol/g). Selv de siste LC–MS-studiene som ble undersøkt eksemplifiserte området for disse NAD pluss-verdiene, inkludert verdier på 1,8 nmol/g41 og 33,8 nmol/g42 og mye høyere verdier på 946,3 nmol/g43 og 1132,3 nmol/g44. I tillegg så det ikke ut til at det store spekteret av LC–MS NAD pluss-verdier korrelerte med studier som utelukket isotopmerkede interne standarder (fig. 5a), en metode som brukes for å forbedre identifiseringen av metabolitten og nøyaktigheten til den kvantifiserte verdien. . Imidlertid var de to identifiserte LC–MS-studiene som utelukkende baserte seg på en ekstern standardkurve for NAD pluss kvantifisering, i stedet for å inkludere en internkontroll, i gjennomsnitt lavere enn gjennomsnittet for alle målene (fig. 5a). Videre brukte studiene ved bruk av intern standardnormalisering forskjellige typer interne standarder, for eksempel inkludering av en enkelt merket referansemetabolitt45,46 eller merkede metabolittekstrakter fra gjær43,44 eller cellekulturer41. Interessant nok ga disse studiene som brukte gjær- eller cellekulturekstrakt-avledede standarder enten de høyeste eller laveste LC-MS-avledede målene for lever NAD pluss-nivåer. Dette understreker potensielt hvordan cellulære ekstrakter av isotoprike standarder kan bidra til variasjonen i NAD pluss målinger, da matriseeffekten av den tilsatte standardgjæren eller celleekstrakten kan forstyrre ioniseringseffektiviteten og følgelig de målte konsentrasjonene av målmetabolittene.
Begrensningene for denne analysen av kvantifiseringsskjevhet og variasjon inkluderer potensielle forskjeller i miljøet, genetisk bakgrunn, offer, kjønn og alder. Alle data for denne analysen kom fra dyr på en chow-diett, men kan variere i type. Ved ofring er det rapportert forskjeller i matet eller fastende tilstanden til dyret og tidspunktet på dagen for ofring. I tillegg, selv om de fleste musestudier ble utført på en C57BL/6-bakgrunn, var det et større utvalg bakgrunner brukt for rotter på tvers av studier (Wistar: 38 prosent, Albino Wistar: 25 prosent, og 6 prosent for Hooded Wistar, Sprague–Dawley, Holtzman, ACI, Long-Evans og Zucker-rotter). På tvers av museleverstudier var det ingen statistiske forskjeller mellom mannlige eller kvinnelige verdier for NAD pluss, NADH eller totale NAD(H)-nivåer eller for NAD pluss/NADH-forholdet (tilleggsfig. 7). Vi kan imidlertid ikke trekke konklusjoner på grunn av det begrensede antallet kvinnekull.
Spør om mer:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: pluss 86 15292862950
