Kan Cistanche Deserticola-ekstrakt fremme immunrespons?

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*

et Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, 830046, Xinjiang, Kina

b Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, 200032, Kina

Etnofarmakologisk relevans:Urtepolysakkarider har utvist et stort immunforsterkende potensial. Adjuvanser er et nøkkelverktøy for å utvikle effektive vaksiner. I vår forrige studie, et vannløselig polysakkarid ekstrahert fra villCistanchedeserticolaYC Ma viste kraftig immunstimulerende aktivitet.

Målet med studien:I denne studien, immunprofiler og effektivitet av vandige ekstrakter av kultiverteCistanchedeserticolaYC Ma (AECCD) på ICR-mus mot ovalbumin (OVA) ble undersøkt. I in vitro-eksperimenter ble den mulige DC-aktiveringsmekanismen av AECCD evaluert.

Materialer og metoder:AECCD ble ekstrahert ved bruk av varmt vann, hvoretter de urene polysakkaridene ble utfelt med etanol. Mus ble først immunisert subkutant med OVA (10 ug per mus) alene eller OVA (10 ug per mus) som inneholdt forskjellige doser av AECCD (200, 400 og 800 ug per mus) på dag 1 og 14 og størrelsen og kinetikken til antistoffer og cellemedierte responser ble deretter vurdert.

Resultater:AECCD utløste kraftige og langsiktige IgG-responser med blandede Th1/Th2-responser og oppregulerte nivåer av Th-assosierte cytokiner (CD4 pluss IL-4, CD4 pluss IFN- og CD8 pluss IFN-). Dessuten induserte AECCD den sterke cellulæreimmunresponskarakterisert ved økt splenocyttproliferasjon så vel som den aktiverte T-celleresponsen. Spesielt forbedret AECCD betydelig modningen av dendritiske celler (DCs) og hemmet Tregs. In vitro-eksperimenter indikerte foreløpige tester at AECCD induserte DC-aktivering ved å fremme fenotypisk modning, cytokinseksjon og allostimulerende aktivitet. Toll-lignende reseptor 4 (TLR4) var en essensiell reseptor for DC-er for å binde AECCD direkte. Hemmere av NF-KB reduserte ekspresjonsnivåene av CD40, CD80, CD86 og MHC-II og produksjonen av IFN-, TNF- og IL-6 gjennom DCS.

Konklusjoner:Til slutt antydet disse funnene at AECCD kunne fremkalle potent og holdbar antigenspesifikkimmunsvargjennom DC-aktivering, som var involvert i reguleringen av modningsmarkører og cytokinekspresjon via den TLR4-relaterte NF-κB-veien. Studien indikerer at AECCD er en potensiell immunmodulator.

Nøkkelord:Polysakkaridadjuvans dyrket,Cistanchedeserticola, Immunmodulator, Dendritiske celler Toll-lignende reseptor 4, NF-KB signalvei

Cistanche deserticolaekstrakt fremmeimmunrespons

1. Introduksjon

Mange studier har antydet at adjuvanser kan øke effekten av vaksiner mot ulike infeksjonssykdommer som HIV, COVID-19, influensa og munn- og klovsyke (Cao et al., 2020; Giuseppe et al., 2018 ). Adjuvanser kan indusere forskjellige typer og størrelser avimmunsvar, slik at en passende valgt adjuvans kan indusereimmunresponsnødvendig for et gitt patogen eller antigen (Reed et al., 2013). Naturlige urteekstrakter har lenge vært mye brukt i dagliglivet eller helsevesenet. I mange tilfeller forbedret tradisjonell kinesisk medisin (TCM) og dens aktive komponenter, spesielt flere TCM-polysakkarider-avledede adjuvanser, effekten av vaksiner betydelig. TCM-polysakkarider (Advax™, Astragalus-polysakkarid, Ginseng-polysakkarid, Lycium barbarum-polysakkarid og Ganoderma lucidum-polysakkarid) hadde flere fordeler i forhold til andre hjelpestoffer, som bedre sikkerhet, biokompatibilitet, sterk immunforsterkning og lav reaktogenisitet (Li 201 W; et al., 2020). TCM-polysakkaridbaserte forbindelser og formuleringer har derfor potensialet som adjuvanskandidater.

Cistanche deserticolaYC Ma (Roucongrong på kinesisk) er en tradisjonell kinesisk medisin registrert i Chinese Pharmacopeia og har blitt brukt som styrkende mat i hundrevis av år i Kina (Chinese Pharmacopoeia Commission, 1992). Moderne farmakologiske studier har vist dens mange farmakologiske og immunmodulerende anvendelser (Dong et al., 2007; Fu et al., 2017). I vår forrige studie ble de rå polysakkaridene avledet fra villCistanchedeserticolaYC Ma fremmet de antigenspesifikke humorale og cellulære responsene og regulerte modningen av dendrittiske celler (DCs) (Zhang et al., 2018; Zhao et al., 2019). Dog villCistanchedeserticolaYC Ma har blitt overdrevent utforsket og oppført som truede arter.CistanchedeserticolaYC Ma har blitt plantet i stor skala og er mye brukt i utvikling og anvendelse av TCM-ressurser. Imidlertid adjuvanspotensialet til dyrketCistanchedeserticolaYC Ma er fortsatt uklar.

DCS er viktige regulatorer mot infeksjonssykdommer. Etter at DC-er er aktivert, samhandler overflatemolekyler og pro-inflammatoriske cytokiner på DC-er med tilsvarende reseptorer for å aktivere T-celler og fremkalle antigenspesifikke responser og produksjon av cytokiner som styrer adaptiveimmunsvar(Banchereau og Steinman, 1998). Det er rapportert at toll-lignende reseptor 4 (TLR4) på ​​DC-er fungerer som en viktig polysakkaridreseptor (Park et al., 2014; Qi et al., 2016). Faktisk kan mange polysakkarider interagere direkte eller indirekte med TLR4 på DC-er for å aktivere nedstrøms nukleær faktor-kappa B (NF-κB), som kan indusere ekspresjonen av forskjellige proinflammatoriske gener som IFN- , TNF- og IL {{11 }} og den inflammatoriske responsen for å eliminere patogener (Tian et al., 2019; Zhou et al., 2017; Zhu et al., 2013). Derfor har DCS og NF-KB blitt grundig studert som potensielle mål for sykdomsbehandling.

I studien, med in vivo (ICR-mus)-strategien, evaluerte vi først de immunstimulerende effektene av vandige ekstrakter av kultiverteCistanchedeserticolaYC Ma (AECCD) med forskjellige doser (lav, middels og høy) for å fremkalle enimmunresponsmot OVA og forklare in vitro måten å aktivere DC-er og nedstrøms reseptorrelaterte veier på. Med en musemodell avslørte vi at AECCD fremmet den langsiktige antistoffresponsen med økte IgG-titere og cellulæreimmunrespons. Viktigere, AECCD induserte Th-assosierte cytokiner, spesielt IFN-produksjon, som førte til Th1-respons mot infeksjoner. Induksjonseffekten var nært korrelert med en forbedret DC-modning og redusert Tregs. Mekanistisk fremmet AECCD DC-aktivering via TLR4-relatert NF-KB-vei. Oppsummert bekreftet studien den potente adjuvansaktiviteten til AECCD for å fremme den adaptive responsen. Studien la et grunnlag for utvikling av AECCD-polysakkaridadjuvanser.

2. Materialer og metoder

2.1. Reagenser

Ovalbumin (OVA), 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), polymyxin B (PMB), concanavalin A (ConA), lipopolysakkarid (LPS), mitomycin C og 3,3′,5,5′-Tetrametylbenzidin (TMB) ble hentet fra Sigma (USA). Fetalt bovint serum (FBS) ble kjøpt fra Biological Industries. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ble kjøpt fra Biosharp (Kina). Geit-anti-mus IgG/IgG1/IgG2a-HRP-konjugater var fra Southern Biotech (USA). Inject Alum var fra Thermo Scientific Pierce (USA). GM-CSF var fra Peprotech (USA). Fluorescensmerkede antistoffer (anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD62L-PE, anti-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, anti-IL-4-PE, anti–IFN– -PE, anti-CD86-APC, anti-CD40-FITC/PE, anti- CD11c-PE/FITC, anti-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm og Perm/Wash buffer var alle fra BD Bioscience (USA). Det regulatoriske T-cellefargingssettet var fra eBiosciences (USA). TAK-242 var fra MedchemExpress (Shanghai, Kina). PDTC var fra Beyotime Biotechnology (Kina). Multi-analyt flow analysesettet var fra Biolegend (USA).

2.2. Fremstilling av AECCD C. deserticola

(Et kupongprøve nr. CD10041602) ble identifisert av professor Jiang He. AECCD ble oppnådd ved vannekstraksjon, etanolutfelling og deproteiniseringsmetoden med noen mindre modifikasjoner (Zhang et al., 2018). Kort fortalt, dyrketCistanchedeserticolable først ekstrahert med vann mange ganger og deretter ble urene polysakkarider utfelt over natten ved tilsetning av etanol i et volumforhold på 1:4. Deretter ble de oppnådde rå polysakkaridene deproteinisert ved Sevag-metoden (Liu et al., 2012). Det totale sukkerinnholdet ble påvist til å være 76,82 prosent med antron-svovelsyremetoden (Dubois et al., 1951).

2.3. Infrarød spektroskopisk analyse

For det formål å analysere organiske funksjonelle grupper, ble AECCD med KBr presset inn i pellets for infrarød (IR) spektramåling. IR-spektrene til prøvene ble bestemt innenfor 4000–400 cm-1.

Cistancheherbareklamereimmunrespons

2.4. In vivo eksperimenter

2.4.1. Dyreimmunisering

C57BL/6 hunnmus og ICR-mus (6 uker gamle) fra Xinjiang Medical University (Urumqi, Kina) ble akklimatisert i 3 dager. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med forskriftene til komiteen for etikk av dyreforsøk ved Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering ved Xinjiang University (BRGE-AE001).

Mus ble subkutant immunisert med OVA alene eller OVA med forskjellige konsentrasjoner av AECCD og boostet på dag 14 i henhold til forskjellige grupper som følger (6 mus i hver gruppe): Kontrollgruppe (0,9 prosent NaCl), OVA-gruppe ( 10 ug OVA), AECCD-H-gruppe (AECCD 800 ug), OVA/AECCD-L-gruppe (10 ug OVA, AECCD 200 ug), OVA/AECCD-M-gruppe (10 ug OVA, AECCD 400 ug ), OVA/AECCD-H-gruppe (10 ug OVA, AECCD 800 ug) og OVA/Alun-gruppe (10 ug OVA, Alum100 ug). Vaksineformuleringer i 100 μL 0,9 prosent NaCl ble injisert på to forskjellige steder (50 μL på hvert sted) i baksiden av hver mus. Etter vaksinasjon ble blodprøver tatt fra retro-orbital plexus, og sera ble ervervet og lagret ved -80 ◦C for videre analyse av IgG-deteksjon. Splenocyttproliferasjon og påvisning av cytokin, T-celleundergrupper, DCs overflatemarkører og Tregs ble utført etter samme vaksinasjonsprotokoll.

2.4.2. Antistoffanalyse

IgG-titere i serum mot OVA ble bestemt ved ELISA på dag 14, 28, 42 og 56 etter primærvaksinasjon nevnt tidligere (Zhang et al., 2018). IgG1 og IgG2a ble målt på dag 21. Absorbansen ved 450 nm/630 nm ble oppnådd ved å bruke en avleser (Bio-Rad, USA). Resultatene av antistoffrespons er uttrykt som IgG-titere og IgG1- og IgG2a-isotyper uttrykkes som tilsvarende absorbanser.

2.4.3. Splenocyttproliferasjonsanalyse

Splenocyttproliferasjonsanalyse i mus ble utført med et CCK-8-analysesett i henhold til produsentens instruksjoner. På dag 21 etter den første immuniseringen ble splenocyttene isolert fra milten til immuniserte mus og erytrocyttene ble lysert etter maling. Splenocytter (1 × 106 celler/brønn) ble stimulert med OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL), ConA (10 ug/mL) og LPS (10 ug/mL) for to dager og tomme celler ble brukt som kontroll. Proliferasjonsaktiviteten ble uttrykt som stimuleringsindeks (SI), som ble beregnet absorbansforholdet til en stimulert celle til en ustimulert celle under bølgelengden 570/630 nm.

2.4.4. Analyse av T-lymfocytt-fenotyping i drenerende lymfeknuter og milt

Splenocyttsuspensjoner fra lymfeknuter og milt i immuniserte mus ble oppnådd i henhold til metoden nevnt ovenfor (Zhang et al., 2018). Etter vasking ble prøver (1 × 106 celler/brønn) farget i 30 minutter med antistoffer for overflatemarkører, inkludert anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE og anti-CD62L-PE. Nivåene av T-lymfocytter ble undersøkt ved flowcytometri. Resultatene av T-lymfocytt-fenotyper er uttrykt som prosentandeler av CD4 pluss T-celle (prosent), CD8 pluss T-celle (prosent), CD44 pluss T-celle (prosent) og CD62L pluss (prosent) T-celle.

2.4.5. Flow-cytometrisk analyse av cytokinnivåer

For formålet med intracellulær cytokinfargingsanalyse ble miltlymfocytter separert og behandlet til en enkeltcellesuspensjon på dag 21 etter den første immuniseringen (Zhang et al., 2017). Prøver (2 × 106 celler/ml) stimulert med OVA (10 ug/ml) ble inkubert i 4 timer. Golgistop ble deretter tilsatt i 12 timer. Prøvene ble deretter vasket, blokkert og farget med anti-CD4-APC- eller anti-CD8a-FITC-antistoffer i 30 minutter. Etter fiksering og permeabilisering med Cyto fix/Cytoperm, ble prøvene deretter merket med anti-IL-4-PE- eller anti-IFN- -PE-antistoffer. Strømningsanalyse ble utført for å bestemme nivået av cytokin.

2.4.6. Estimering av DC-aktivering og Treg-celler i en milt

For å undersøke om DCs og Tregs spiller en rolle i det forbedredeimmunresponsmot OVA, på dag 3 etter den første vaksinasjonen, ble miltlymfocytter fra immuniserte mus høstet for vurdering av DC-modning (Zhang et al., 2017). Celler ble henholdsvis blokkert og inkubert med anti-CD11c-PE/FITC, anti-CD40-PE, anti-CD86-APC, anti-CD80-APC og anti-MHCII- FITC i 30 min. Celler ble analysert ved flowcytometri. På dag 21 etter den første immuniseringen ble Tregs testet med det museregulerende T-cellefargingssettet. Splenocytter ble farget med anti-CD4-FITC for celleoverflatemarkører, etterfulgt av intracellulær farging med anti-CD25-APC og anti-Foxp3-PE i henhold til produsentens instruksjoner. Nivået av CD4 pluss CD25 pluss Foxp3 pluss celler ble bestemt ved flowcytometri.

Cistanche anlegg ekstrakt fremmer enimmunrespons

2.5. In vitro eksperimenter

2.5.1. Generering av DC-er, cellelevedyktighet og endotoksinnivåer

DC-er avledet fra benmargen til C57BL/6-mus ble oppnådd i henhold til metoden beskrevet tidligere (Inaba et al., 1992). Kort fortalt ble celler dyrket med RPMI-1640 komplett medium (20 ng/ml GM-CSF og 5 ng/ml IL-4). Etter seks dager ble alle suspenderte celler samlet som umodne DC-er for påfølgende analyser. Prosentandelen av CD11c pluss DC i de ikke-adherente cellene ble bestemt til å være 94 prosent ved flowcytometri.

Cellelevedyktigheten til DC-er og splenocytter fra mus etter AECCD ble påvist med CCK{{0}}-settet i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene fra DCS og splenocytter ble oppnådd og deretter stimulert med forskjellige konsentrasjoner av AECCD (0, 10, 100, 400, 800 og 1600 ug/ml). Cellelevedyktigheten ble uttrykt som forholdet mellom absorbansen til den behandlede gruppen og absorbansen til kontrollgruppen) x 100 prosent.

For å utelukke effekten av endotoksin i AECCD, etter at AECCD (100, 200 og 400 ug/mL) og LPS (100 ng/mL) ble forbehandlet med PMB (100 ug/mL) i 60 minutter, DCs (5 × 105 celler/mL) ble inkubert med forhåndsbehandlet AECCD (100, 200 og 400 ug/mL) og LPS i 12 timer. Etter behandlingen ovenfor ble nivåene av CD40, CD86, CD80 og MHCII evaluert.

2.5.2. Analyse av DC-fenotype

Nivåene av costimulerende molekyler ble bestemt for å evaluere modning gjennom in vitro-eksperimenter. På dag seks ble DC-er behandlet med AECCD (20, 100, 200 og 400 ug/mL) eller LPS (100 ng/mL) i 12 timer. Deretter ble DC-er farget med overflatemolekyler og analysert ved flowcytometri.

2.5.3. Cytokinproduksjon av DCs in vitro

Cellekultursupernatanten ble samlet for å måle nivået av cytokiner ved å bruke et ELISA-sett eller multi-analyt-strømanalysesett med CBA-metoden. Alle eksperimentelle trinn ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.

2.5.4. Allogen blandet lymfocyttreaksjon (MLR)

Splenocytter fra BALB/c-mus ble aseptisk oppnådd i RPMI- 1640-medium (Zhang et al., 2018). Modne C57BL/6 DC-er (modnet i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av AECCD eller LPS) ble forbehandlet med 50 ug/mL Mitomycin C i 60 minutter ved 37 ◦C. Etter vask ble DC-er blandet med splenocytter i forholdet 1:5 eller 1:10 i 2 dager. Celleproliferasjon ble bestemt ved MTT-analyse.

2.5.5. Inhibitornøytraliseringseksperimenter

For å undersøke TLR4-relatert NF-κB-vei, ble innsamlede DC-er lastet på en 24-brønnplate og deretter forhåndsbehandlet med TAK-242 (5 μM) eller PDTC (5 μM) , henholdsvis. Etter 1- timers inkubering ble cellene stimulert med forskjellige konsentrasjoner av AECCD (100, 200 og 400 ug/mL) eller LPS (100 ng/mL) i 24 timer. Deretter ble ekspresjonsnivåene av overflatemolekyler og cytokiner i kultursupernatantene bestemt i henhold til metodene beskrevet ovenfor.

3. Resultater

3.1. FTIR-spektroskopi

De viktigste absorpsjonstoppene til AECCD i fig. 1 var karakteristiske absorpsjonstopper av glykosidstrukturer som tilsvarer O–H-strekkvibrasjonen ved 3342,95 cm−1. Båndet ved 2933,54 cm−1 hadde den karakteristiske svake absorpsjonen av C–H-strekkvibrasjoner. Toppen ved 1657,39 cm− 1 ble tilskrevet O–H bøyningsvibrasjon. Absorpsjonen ved 1411.00 cm− 1 ble tilskrevet O–H eller C–H og C–O strekkvibrasjoner. Toppene ved 1018,38 cm−1 indikerte også CO og C–O–C glykosidbåndvibrasjoner.

Fig. 1. FTIR-spektra av AECCD.

3.2. OVA-spesifikk serumantistoffrespons

Sera fra de immuniserte musene ble testet for å sjekke for tilstedeværelsen av genererte antistoffer (IgG, IgG1 og IgG2a) mot OVA. Som vist i fig. 2A, fremkalte IgG-titere hos mus immunisert med OVA/AECCD-M høyere total IgG (titre: 220,000, 25{{30}}, 000 og 250,000) i forhold til OVA-gruppen (titre: 100,000, 100,000 og 120,000), og var nær Alun-gruppen (titre: 250,000, 250,000 og 270,000) på dag 28, 42 og 56 etter primærvaksinasjon. OVA/AECCD-M/H økte signifikant IgG1-nivåer sammenlignet med OVA-gruppen (P < 0,05)="" og="" forskjellen="" mellom="" ova/aeccd-m/h-gruppen="" og="" alun-gruppen="" var="" ikke="" signifikant="" (p=""> 0,05). OVA/AECCD-M/H økte også markant IgG2a-nivåer sammenlignet med OVA-gruppen og Alun-gruppen (fig. 2B og C) (P < 0,05).="" de="" økte="" igg2a-nivåene="" kan="" forhindre="" en="" sykdom="" som="" krever="">immunrespons.

Fig. 2. OVA-spesifikke antistofftitere og IgG-isotyper i serum. Serumprøver ble samlet etter primær- og boosterimmuniseringer for antistoffer med ELISA. (A) IgG-titere av sammenslått serum ble vurdert på dag 14, 28, 42 og 56 etter den første immuniseringen. (B–C) IgG1 og IgG2a ble målt på dag 21 etter den første immuniseringen. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n=6). *P < 0.05="" sammenlignet="" med="">

3.3. Cellulære immunresponser

Miltlymfocyttproliferasjon ble undersøkt ved MTT-analyse under restimulering med OVA eller OVA{{0}}. Proliferasjonsanalyse viste at OVA/AECCD-M både økte splenocyttproliferasjonen markant etter eksponering for OVA, OVA323-339, Con A eller LPS i forhold til OVA-gruppen. OVA og OVA323-339 forbedret den høyere spredningsresponsen signifikant enn i Alun-gruppen (fig. 3) (P <>

Fig. 3. Splenocyttproliferasjon ved AECCD-behandling in vivo. Splenocytter ble re-stimulert med OVA, OVA323-339, ConA eller LPS og målt ved MTT-metoden på dag 21 etter den første immuniseringen. Celleproliferasjon ble vist som stimuleringsindeks (SI): (A–B) Stimuleringsindeks for OVA og OVA323-339. (C–D) Stimuleringsindeks for ConA og LPS. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n=5). *P<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">

3.4. Aktivering av T-celleundergrupper i drenerende lymfeknuter og milt

Lymfeknuter og milt fra immuniserte mus ble høstet for å oppdage T-celleundergrupper på dag 21 etter primærvaksinasjon. Prosentandelen av T-celleundersett (CD4 pluss, CD8 pluss, CD44 pluss T-celler) fra lymfeknuter i OVA/AECCD-M-gruppen var signifikant høyere enn for OVA-gruppen og Alun-gruppen (fig. 4A–D) (P) < 0.05).="" prosentandelen="" av="" t-celleundersett="" (cd4="" pluss,="" cd8="" pluss,="" cd44="" pluss="" og="" cd62l="" pluss="" t-celler)="" i="" en="" milt="" var="" signifikant="" høyere="" enn="" ova-gruppen="" (fig.="" 4e–j)="" (p="">< 0,05).="" disse="" funnene="" indikerte="" at="" aeccd="" fremmet="">immunrespons.

Fig. 4. Nivåer av T-celleundergrupper i drenerende lymfeknuter og milt in vivo. På dag 21 etter den første vaksinasjonen ble celler fra lymfeknuter og milt brukt til å detektere T-celleundergrupper ved flowcytometri. (A–D) Prosentandeler av CD4 pluss, CD8 pluss og CD44 pluss T-celler i lymfeknuter. (E–J) Prosentandeler av CD4 pluss, CD8 pluss, CD44 pluss og CD62L pluss T-celler i en milt. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n=5). *P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01="" og="" ***p="">< 0,001="" sammenlignet="" med="" ova;="" #p="">< 0,05="" og="" ##p="">< 0,01="" sammenlignet="" med="">

3.5. Cytokiner utskilt av restimulerte splenocytter in vivo

'Th1/Th2-cytokiner fra milten til immuniserte mus ble bestemt ved intracellulær farging på dag 21 etter den første vaksinasjonen. Nivåene av CD4 pluss IL-4, CD4 pluss IFN- og CD8 pluss IFN- i OVA/AECCD-M-gruppen var signifikant høyere enn i OVA-gruppen og Alun-gruppen (P < 0="" .05,="" fig.="" 5).="" forskjellene="" indikerte="" at="" aeccd="" kunne="" stimulere="" th1/th2-responser,="" spesielt="">immunrespons.

Fig. 5. Antigenspesifikk cytokinanalyse i T-celler in vivo. Splenocytter fra immuniserte mus ble undersøkt på dag 21 etter den første immuniseringen ved intracellulær cytokinfarging. (A) Prosentandeler av CD4 pluss IL-4. (B–C) Prosentandeler av CD4 pluss IFN- og CD8 pluss IFN-. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n=5). *P < {{10}}.05="" og="" **p="">< 0,01="" sammenlignet="" med="" ova;="" #p="">< 0,05="" sammenlignet="" med="">

3.6. DC-modning og Tregs in vivo

DC-aktivering kan sette i gang adaptiv immunitet. Effektene av AECCD på DC-modning i immuniserte mus ble evaluert på dag 3 etter den første immuniseringen. OVA/AECCD-M induserte de høyeste nivåene av CD40, CD80, CD86 og MHCII på DC-er i forhold til OVA-gruppen, og forskjellen mellom OVA/AECCD-M gruppen og alungruppen var signifikant (fig. 6A–D) (P < 0,05).="" frekvensen="" av="" cd4="" pluss="" cd25="" pluss="" foxp3="" pluss="" tregs="" i="" ova/aeccd-m-gruppen="" var="" dramatisk="" lavere="" enn="" i="" ova-gruppen="" (fig.="" 6e)="" (p="">< 0,05).="" disse="" dataene="" antydet="" at="" aeccd="" kunne="" aktivere="" dc-er="" og="" senke="">

Fig. 6. Effekter av AECCD på DC-modning og Tregs in vivo. Splenocytter fra ICR-mus ble brukt til å oppdage kostimulerende molekyler på DCs og Tregs på dag 3 eller 21 etter den første immuniseringen. (A–D) Prosentandeler av CD40, CD86, CD80 og MHCII på CD11c pluss DC-er. (E) Prosentandeler av CD4 pluss CD25 pluss Foxp3 pluss Tregs. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n {{10}}). *P < 0.05="" og="" **p="">< 0.01="" sammenlignet="" med="" ova;="" #p="">< 0,05="" og="" ##p="">< 0,01="" sammenlignet="" med="">

3.7. Analyser av cytotoksisitet og endotoksinkontaminering

Etter behandlingen med forskjellige konsentrasjoner av AECCD i 2 dager, ble cellene fra DCS og splenocytter fra mus brukt til å bestemme potensiell cytotoksisitet med CCK-8-settet. Det var ingen signifikant hemmet spredningsrespons i cellelevedyktigheten til DC-er og splenocytter sammenlignet med kontrollgruppene (fig. 7A–B) (P > 0.05). Disse resultatene viste at AECCD ved en konsentrasjon på 10–1600 ug/mL ikke viste noen signifikant cytotoksisitet for DCs og splenocytter sammenlignet med kontrollen (P > 0,05). Dermed ble konsentrasjonen av AECCD i påfølgende eksperimenter satt til å være under 1600 ug/ml.

For å utelukke interferens av endotoksinkontaminering i effekten av AECCD på DC-aktivering, ble PMB, et antibiotikum som er allment anerkjent på grunn av dets LPS-nøytraliserende effekt, brukt for å utelukke endotoksinkontaminering (Morrison og Jacobs, 1976). Som vist i fig. 7C–F, viste CD40, CD80, CD86 eller MHC-II ekspresjonsnivåer i AECCD-behandlede DC-er i nærvær av PMB ingen signifikant endring ( P > 0,05). Imidlertid ble det observert en dramatisk nedgang av CD40, CD80 CD86 og MHC-II ekspresjonsnivåer i LPS-behandlede DCs i nærvær av PMB (P < 0,001).="" disse="" resultatene="" viste="" at="" aeccd="" var="" fri="" for="">

Fig. 7. Cytotoksisitet og effekter av PMB på indusert DC-modning etter AECCD. (A–B) DCS og splenocytter av mus ble dyrket i nærvær av AECCD i 2 dager for å bestemme cellelevedyktigheten med MTT-metoden. (C–F) DC-er ble inkubert i 12 timer med AECCD eller LPS forbehandlet i nærvær/fravær av PMB i 6 0 min. Prosentandelen av CD40, CD80, CD86 og MHCII på CD11c pluss DC-er ble bestemt. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n =3). **P < 0,01="" og="" ***p="">< 0,001="" sammenlignet="" med="" gruppe="" med="">

3.8. Fenotypisk modning og funksjonell aktivering av DC-er in vitro

Basert på immuniseringseksperimenter ovenfor, ble den fenotypiske modningen av DCs ytterligere utforsket etter behandlingen med AECCD in vitro. På dag 6 ble umodne DC-er stimulert med en gitt konsentrasjon av AECCD eller LPS for å analysere overflatemolekyler. AECCD-indusert cellemodning karakterisert ved en betydelig økning i prosentandeler av CD40, CD80 CD86 og MHC II på en doseavhengig måte (P < 0,001,="" fig.="" 8a–d).="" en="" lignende="" fenotypisk="" modning="" av="" dc-er="" ble="" også="" observert="" etter="" stimulering="" med="" 100="" ng/ml="" lps.="" analysedataene="" viste="" at="" aeccd="" forbedret="">

Fra resultatene ovenfor forbedret AECCD den fenotypiske modningen av DC-er. For å observere effekten av AECCD på DC-funksjon in vitro, var evnen til AECCD-behandlede DC-er til å stimulere allogen T-celleproliferasjon i en MLR ved et DC-splenocyttforhold på 1:5 eller 1:10 undersøkt. DC-er behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECCD induserte signifikant T-celleproliferasjon sammenlignet med ubehandlede DC-er (fig. 8E–F) (P < 0.001).="" dc-modning="" kan="" indusere="" produksjonen="" av="" cytokiner.="" deretter="" ble="" supernatantene="" til="" dc-er="" behandlet="" med="" aeccd="" eller="" lps="" påvist="" med="" elisa-sett.="" nivåene="" av="" il-12="" og="" tnf-="" i="" supernatantene="" til="" dcs="" ble="" dramatisk="" økt="" på="" en="" doseavhengig="" måte="" (p="">< 0,001,="" fig.="">

Fig. 8. Fenotypisk modning og funksjonell aktivering av DCs ved AECCD-behandling in vitro. (A–D) På dag 6 ble DC-er behandlet med en gitt konsentrasjon av AECCD eller LPS i 12 timer. Celler ble farget med antistoffer og bestemt ved flowcytometri. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) for CD40, CD80, CD86 og MHCII på CD11c pluss DC-er. (E–F) C57BL/6 DC behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECCD eller LPS ble blandet med splenocytter fra BALB/c-mus i et forhold på 1:5 eller 1:1 0 i en MLR i 2 dager. Celleproliferasjon ble bestemt ved MTT-analyse. (G–H) Kultursupernatantene til DC-er ble analysert for IL-12 og TNF-a ved hjelp av ELISA-sett. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n =3). *P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" og="" ***p="">< 0.001="" sammenlignet="" med="" ubehandlede="" dc-er;="" #p="">< 0,05="" sammenlignet="" med="">

3.9. TLR4, en reseptor for AECCD på DC-er

DCS kan initiere cellulær signalering av membranreseptorer. Tilfastslårollen til TLR4 i å delta i AECCD-behandlet DC-modning, etter forbehandlingen med TLR4-hemmeren TAK-242 ble DC-er stimulert med en gitt konsentrasjon av AECCD, og ​​deretter ble aktiveringsstatusen til DC-er undersøkt med flowcytometer . Ekspresjonsnivåene av cytokiner i kultursupernatanter ble analysert med et multi-analyt-strømningsanalysesett. Oppreguleringen av CD40, CD80, CD86 og MHC-II indusert av AECCD ble signifikant hemmet ved å blokkere TLR4-veier (P < 0,01,="" fig.="" 9a–d).="" i="" tillegg,="" sammenlignet="" med="" ubehandlet="" kontroll,="" hadde="" blokkering="" av="" tlr4="" med="" tak-242="" en="" mer="" signifikant="" hemmende="" effekt="" på="" produksjonen="" av="" ifn-,="" tnf-="" og="" il-6="" (p="">< 0,01,="" fig.="" 9e–g)="">

Fig. 9. Aktivering av TLR4-signalering i AECCD-behandlede DC-er. Etter at umodne DC-er ble behandlet med AECCD i fravær eller tilstedeværelse av TAK-242 i 12 timer, ble den fenotypiske modningen undersøkt med flowcytometer og nivåene av cytokiner i supernatanter var ved CBA-metoden. (A–D) Prosentandeler av CD40, CD80, CD86 og MHCII på CD11c pluss DC-er. (E–G) Nivåer av IFN-, TNF- og IL-6. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n=3). **P < 0,01="" og=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">

3.10. DC-aktivering av AECCD via TLR4-relatert NF-KB-vei

For å undersøke om uttrykkene av overflatemolekyler og cytokiner til AECCD-behandlede DC-er ble regulert av NF-KB etter at umodne DC-er forbehandlet med NF-KB-hemmer PDTC ble stimulert med AECCD i 12 timer, ble ekspresjonsnivåene av costimulerende molekyler og cytokiner målt ved å flowcytometer. Nivåene av CD40, CD80 CD86 og MHC-II indusert av AECCD ble signifikant redusert sammenlignet med den ubehandlede kontrollen ved å blokkere NF-KB-veier med tilsvarende hemmere (P < 0,001,="" fig.="" 10a–d).="" samtidig="" ble="" uttrykket="" av="" ifn-,="" tnf-="" og="" il-6="" også="" signifikant="" hemmet="" av="" pdtc="" (p="">< 0,05,="" fig.="">

Fig. 10. Involvering av NF-KB i AECCD-indusert DC-aktivering. DC-er ble behandlet med AECCD i fravær eller nærvær av PDTC i 24 timer. (A–D) Prosentandelen av CD40, CD80, CD86 og MHCII på CD11c pluss DC-er ble bestemt ved hjelp av flowcytometri. (E–G) Nivåene av IFN-, TNF- og IL-6 i supernatanten ble bestemt ved hjelp av CBA-metoden. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n=3).*P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" og="" ***p="">< 0,001="" sammenlignet="" med="" gruppen="" med="">

4. Diskusjon

For tiden ble forskjellige polysakkarider fra TCM undersøkt som adjuvanser for vaksiner til mennesker og dyr (Sun et al., 2018; Rey- Ladino et al., 2011). I denne studien ble de immunmodulerende effektene av AECCD og den primære aktiveringsmekanismen til DC-er undersøkt in vivo og in vitro ved en serie eksperimenter for å evaluere den adaptiveimmunresponsmot OVA og aktiveringsstatusen til DCS. In vivo-eksperimenter indikerte at AECCD bemerkelsesverdig fremmet produksjonen av OVA-spesifikke IgG- og IgG-isotyper, forbedret splenocyttproliferasjon og induserte T-celleaktivering og cytokiner (IL-4/IFN-). Dessuten forbedret AECCD DC-modning og viste reduserte tregs. Disse funnene antydet at funksjonen til AECCD som en effektiv adjuvans ble realisert ved å fremme DC-modning og hemme Tregs. In vitro-eksperimenter indikerte at AECCD fremmet fenotypisk modning av DC-er, cytokinseksjon og allostimulerende aktivitet via TLR-4-relatert NF-KB-vei. Disse eksperimentelle resultatene indikerte at AECCD hadde betydelig potensial som en immunforsterkende stimulator.

Hver adjuvans har unike immunegenskaper mot forskjellige antigener, noe som indikerer at adjuvanser har brukspotensiale i forskjellige sykdommer. For det første ble adjuvansegenskapene ved samtidig administrering av AECCD med OVA testet ved å bestemme effekten deres på adaptivimmunresponshos mus. Mange studier viste at de immunstimulerende aktivitetene var direkte proporsjonale med dosen innenfor et visst område (Li et al., 2020; Reed et al., 2020; Zhang et al., 2017). Tilsvarende i studien avslørte analysen av antistoff og isotype at AECCD i et visst doseområde forbedret OVA-spesifikke IgG-, IgG1- og IgG2a-responser og at middeldosen av AECCD var den optimale dosen. I påfølgende eksperimenter undersøkte vi hovedsakelig den stimulerende effekten av AECCD ved en optimal middels dose. Den middels dosen av AECCD økte splenocyttproliferasjonsresponsen i immuniserte mus betydelig, noe som indikerer at AECCD fremmet cellulærimmunsvarmot OVA. Disse resultatene antydet at AECCD forbedret både humoral og cellulærimmunsvar, som var assosiert med adjuvanspotensial.
Den fremkalte betydelige T-celleaktiviteten kan bidra til sykdomsutryddelse. I løpet av enimmunrespons, kan aktiverte T-celler nå sekundært lymfoidt vev, inkludert milt og lymfeknuter (Steinman, 2012). Den middels dosen av AECCD forbedret effektivt vaksineeffektiviteten ettersom den kunne forbedre CD4-, CD8-, CD44- og CD62L T-celleresponsene i drenerende lymfeknuter og milt betydelig. Aktiverte CD8 T-celler medierte patogenutryddelse ved å utskille IFN-. Prolifererte CD4 T-celler ble differensiert til Th1-celler og Th1-celler. Th1-celler utskilte Th1-cytokin for å stimulere lymfocyttproliferasjon og Th2-celler utskilte Th2-cytokin for å øke antistoffproduksjonen (Seder et al., 2008). I studien ble nivåene av CD4 pluss IL-4, CD4 pluss IFN- og CD8 pluss IFN- økt av AECCD ved en middels dose. AECCD induserte en balansert Th1/Th2-respons og dirigerteimmunresponsved å endre cytokinnettverket.

En adjuvans bør indusere spesifikk immunitet og kontrollere utfallet avimmunresponsved å regulere DCs status på en rekke punkter (Carrera Silva et al., 2013). Uttrykket av overflatemolekyler på DC-er er en avgjørende indikator for å evaluere DC-modning og er typisk korrelert med T-lymfocyttdifferensiering (Steinman, 2012). I denne studien forbedret AECCD uttrykket av costimulerende molekyler og forenklet DC-modning når det ble brukt som en adjuvans mot OVA. Dette kan være en av måtene AECCD fremmet humoral og cellulærimmunsvar. I mellomtiden reduserte AECCD også frekvensen av CD4 pluss CD25 pluss Foxp3 pluss Tregs, noe som ga en balansert immunitet etter vaksinasjon. Resultatene våre støttet nylige funn om at ulike polysakkarider fra TCM var regulatoren for DC-modning (Bo et al., 2019; Li et al., 2015; Zhu et al., 2016).

Aktivering av adaptivimmunsvarav polysakkaridadjuvanser medieres primært via deres gjenkjennelse av spesifikke reseptorer av DC (Akira, 2004). DC-er aktivert gjennom TLR4-relaterte veier kan skille ut ulike immunmodulatorer som den kritiske mediatoren mot infeksjoner (Akira, 2007). Derfor, i påfølgende eksperimenter, undersøkte vi foreløpig den molekylære mekanismen til den stimulerende effekten av AECCD på DC-er in vitro. For å observere cytotoksisiteten til AECCD, ble cellelevedyktigheten til DC-er og splenocytter fra mus først bestemt. AECCD ved 10–1600 ug/mL viste ingen cytotoksisitet for DCs og splenocytter. For å utelukke LPS-kontaminering forbehandlet vi AECCD med PMB. Ekspresjonsnivåene til CD40, CD80 CD86 og MHC-II i AECCD-behandlede DC-er ble ikke redusert, men PMB hemmet effektivt ekspresjonen av costimulerende molekyler i LPS-behandlede DC-er. Dette viste at AECCD var fri for endotoksinkontaminering. Deretter ble aktiveringsstatusen til DC-er undersøkt ytterligere. I likhet med LPS-behandlede DC-er økte AECCD-behandlede DC-er på en doseavhengig måte nivåene av CD40, CD80 CD86 og MHC II samt produksjonen av det pro-inflammatoriske cytokinet, som var en parameter for funksjonell modning av DC-er. I en MLR ble spredningsevnen til allogene T-celler evaluert i AECCD-behandlede DC-er. AECCD kunne prime og aktivere allogene T-celler. DC-er ble først forhåndsbehandlet med Mitomycin C og deretter grundig vasket for å fjerne denne reagensen, så effekten av AECCD på DC-er ble sannsynligvis ikke tilskrevet den mitogene aktiviteten. Eksperimentelle data viste at DCs fenotypisk modning og funksjonell aktivering kan tilskrives stimuleringen fra AECCD.

En rekke TCM-polysakkarider kan stimulere DCs-modning via TLR4. NF-κB som medlem av TLR4-relatert nedstrømsvei spiller en viktig rolle i å regulere fenotypisk og funksjonell modning av DC-er og indusere ekspresjonen av ulike gener involvert iimmunsvar(Qi et al., 2016; Re og Strominger, 2001; Wei et al., 2016; Zhu et al., 2013). Gjennom in vitro-eksperimenter fant vi at AECCD fremmet DC-modning og at TAK-242 (TLR4-hemmer) og PDTC (NF-κB-hemmer) reduserte ekspresjonsnivåene til CD40, CD80, CD86 og MHC -II og sekresjonsnivåene av IFN-, TNF- og IL-6 på AECCD-behandlede DC-er. Disse funnene indikerte at TLR4 og NF-KB var involvert i AECCD-indusert DC-aktivering og cytokinsekresjon. Disse resultatene stemte overens med tidligere rapporterte studier fordi AECCD som adjuvans forbedret antigenmålretting mot DC-er.

Oppsummert viste resultatene våre at AECCD induserte holdbare og Th1/Th2-responser, spesielt T-cellemediertimmunresponsmot OVA. AECCD-aktiverte DC-er gjennom den TLR-4-mediert NF-κB-veien, og øker dermed produksjonen av immunmodulatorer og allogen T-celleproliferasjon. AECCD kan brukes som en effektiv adjuvans i vaksineutvikling. Imidlertid vil en nøyaktig komponentanalyse bli utført for å bestemme hvilken komponent i AECCD-aktiverte DC-er. Med fokus på mekanismene angående hvordan AECCD øker immunogenisiteten, inkludert optimalisering av adjuvansformuleringer og rute for vaksineadministrasjon, vil vi videre utforske de immunmodulerende komponentene og de spesifikke adjuvansegenskapene til AECCD med det formål å designe effektive vaksineadjuvanser mot infeksjonssykdommer.

Cistanche deserticola fordelerfremme enimmunrespons

Forfatterbidrag

Innhenting, analyse og tolkning av data: Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng. Skrive originalutkast: Shuangshuang Feng, Xiang Weng.

Finansieringsanskaffelse:Ailian Zhang.

Etterforskning:Ailian Zhang.

Metodikk:Ailian Zhang, Bin Wang.

Tilsyn:Ailian Zhang.

Erklæring om konkurrerende interesse

Forfatterne har ingen interessekonflikt knyttet til denne studien.

Anerkjennelser

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China [tilskuddsnummer 31960164 og 31660259] Finansierne hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, forberedelse eller av manuskriptet.

Forfatterne takker prof. Xingguo Zheng og Jiang He (Urumqi, Kina) for vennlig å gi materialer og identifikasjon.

Referanser

Akira, S., 2004. Bompengereseptorfamilier: struktur og funksjon. Semin. Immunol. 16, 1–2.

Akira, KS, 2007. Signalering til NF-KB av tolllignende reseptorer. Trender Mol. Med. 18, 156–163.

Banchereau, J., Steinman, RM, 1998. Dendritiske celler og kontroll av immunitet. Nature 392, 245–252.
Bo, R., Liu, Z., Zhang, J., Gu, P., Ou, N., Sun, Y., Hu, Y., Liu, J., Wang, D., 2019. mekanismen til Lycium barbarum polysaccharides liposomer på aktiverende murine dendrittiske celler. Karbohydr. Polym. 205, 540–549.
Cao, P., Wu, S., Wu, T., Deng, Y., Zhang, Q., Wang, K., Zhang, Y., 2020. Den viktige rollen til polysakkarider fra en tradisjonell kinesisk medisin-Lungerensing og avgiftende avkok mot covid-19-pandemien. Karbohydr. Polym. 240,m116346
Carrera Silva, EA, Chan, PY, Joannas, L., Errasti, AE, Gagliani, N., Bosurgi, L., Jabbour, M., Perry, A., Smith-Chakmakova, F., Mucida, D., Cheroutre, H., BurstynCohen, T., Leighton, JA, Lemke, G., Ghosh, S., Rothlin, CV, 2013. T-celle-avledet
protein S engasjerer TAM-reseptorsignalering i dendrittiske celler for å kontrollere størrelsen påimmunrespons. Immunitet 39, 160–170.
Chinese Pharmacopoeia Commission, 1992. Chinese Ministry of Health Drug Standard Chinese Herbal Medicine, bind én. Chinese Pharmacopoeia Commission press, Beijing, s. 1.

Dong, Q., Yao, J., Fang, J., Ding, K., 2007. Strukturell karakterisering og immunologisk aktivitet av to kaldtvannsekstraherbare polysakkarider fraCistanchedeserticolaYC Ma. Karbohydr. Res. 342 (10), 1343–1349.
Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, JK, Rebers, PA, Smith, F., 1951. En kolorimetrisk metode for bestemmelse av sukker. Natur 168, 167.
Fu, Z., Fan, X., Wang, X., Gao, X., 2018.CistancherHerba: en oversikt over dens kjemi, farmakologi og farmakokinetiske egenskaper. J. Ethnopharmacol. 219, 233–247.
Giuseppe, DG, Rino, R., Didierlaurent, AM, 2018. Korrelater av adjuvansitet: en gjennomgang av adjuvanser i lisensierte vaksiner. Semin. Immunol. 39, 14–21.
Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., Ikehara, S., Muramatsu, S., Steinman, RM, 1992. Generering av store antall dendritiske celler fra mus benmargskulturer supplert med granulocytt/makrofag kolonistimulerende faktor. J. Exp. Med. 176, 1693–1702.
Li, P., Wang, F., 2015. Polysakkarider: kandidater til lovende vaksineadjuvanser. Drug Discov Ther 9, 88–93.
Li, X., Zhao, R., Li, H., De, Z., Wu, H., 2012. Deproteinisering av polysakkarider fra stigma maydis ved Sevag-metoden. Adv. Mater. Res. 340, 416–420.
Li, J., Li, J., Zhang, F., 2015. De immunregulerende effektene av kinesisk urtemedisin på modning og funksjon av dendritiske celler. J. Ethnopharmacol. 171, 184–195.
Li, T., Zhang, L., Jin, C., Xiong, Y., Cheng, YY, Chen, K., 2020. Granatepleblomstekstrakt regulerer toveis spredning, differensiering og apoptose av 3T3- L1-celler gjennom regulering av PPAR-ekspresjon mediert av PI3K-AKT-signalveien. Biomed. Pharmacother. 131, 110769.
Morrison, DC, Jacobs, DM, 1976. Binding av polymyxin B til lipid A-delen av bakterielle lipopolysakkarider. Immunochemistry 13, 813–818.
Park, MJ, Ryu, HS, Kim, JS, Lee, HK, Kang, JS, Yun, J., Kim, SY, Lee, MK, Hong, JT, Kim, Y., 2014. Platycodon grandiflorum polysaccharide induserer dendritisk celle modning via TLR4-signalering. Food Chem. Toxicol. 72, 212–220.
Qi, C., Guo, Y., Zhou, W., Zhang, Y., 2016. Toll-lignende reseptor 4-relaterte immunstimulerende polysakkarider: primær struktur, aktivitetsrelasjoner og mulige interaksjonsmodeller. Karbohydr. Polym. 149, 186–206.
Re, F., Strominger, JL, 2001. Toll-lignende reseptor 2 (TLR2) og TLR4 aktiverer differensielt humane dendrittiske celler. J. Biol. Chem. 276, 37692–37699.
Reed, SG, Orr, MT, Fox, CB, 2013. Nøkkelroller til adjuvanser i moderne vaksiner. Nat. Med. 19, 1597–1608.
Reed, SG, Tomai, M., Gale, MJ, 2020. Nye horisonter i adjuvanser for vaksineutvikling. Curr. Opin. Immunol. 65, 97–101.
Rey-Ladino, J., Ross, AG, Cripps, AW, Mcmanus, DP, Quinn, R., 2011. Naturlige produkter og søket etter nye vaksineadjuvanser. Vaksine 29, 6464–6471.
Schijns, V., Fernandez ´ Ejada, A., Barjaktarovi, A., Bouzalas, I., Lavelle, EC, 2020. Modulering avimmunsvarbruk av adjuvanser for å lette terapeutisk vaksinasjon. Immunol. Åp 296, 169–190.
Seder, RA, Darrah, PA, Roederer, M., 2008. T-cellekvalitet i minne og beskyttelse: implikasjoner for vaksinedesign. Nat. Rev. Immunol. 8, 247–258.
Steinman, RM, 2012. Beslutninger om dendrittiske celler: fortid, nåtid og fremtid. Annu. Rev. Immunol. 30, 1–22.
Sun, B., Yu, S., Zhao, D., Guo, S., W, X., Zhao, K., 2018. Polysakkarider som vaksineadjuvanser. Vaksine 36, 5226–5234.
Tian, ​​H., Liu, Z., Pu, Y., Bao, Y., 2019. Immunmodulerende effekter utøvet av Poria Cocos polysakkarider via TLR4/TRAF6/NF-KB-signalering in vitro og in vivo. Biomed. Pharmacother. 112, 108709.
Wei, W., Xiao, HT, Bao, WR, Ma, DL, Leung, CH, 2016. TLR-4 kan formidle signalveier for Astragalus polysakkarid RAP-indusert cytokinekspresjon av RAW264.7-celler. J. Ethnopharmacol. 179, 243–252.
Zhang, A., Yang, Y., Wang, Y., Zhao, G., Yang, X., Wang, D., Wang, B., 2017. Adjuvansaktive vandige ekstrakter fra Artemisia rupestris L. forbedrerimmunsvargjennom TLR4-signalveien. Vaksine 35, 1037–1045
Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., Wu, DC, 2018. Immunstimulerende aktivitet av vann-ekstraherbare polysakkarider fraCistanchedeserticolasom planteadjuvans in vitro og in vivo. PloS One 13, e0191356.
Zhao, B., Lian, J., Wang, D., Li, Q., Zhang, A., 2019. Evaluering av vandige ekstrakter avCistanchedeserticolaer en polysakkaridadjuvans for sesonginfluensavaksine hos unge voksne mus. Immunol. Lett. 213, 1–8.
Zhou, L., Liu, Z., Wang, Z., Yu, S., Long, T., Zhou, X., Bao, Y., 2017. Astragalus-polysakkarider utøver immunmodulerende effekter via TLR4-mediert MyD88-avhengige signalveier in vitro og in vivo. Sci Rep-UK 7, 44822.
Zhu, J., Zhang, Y., Shen, Y., Zhou, H., Yu, X., 2013. Lycium barbarum polysakkarider induserer Toll-lignende reseptor 2- og 4-mediert fenotypisk og funksjonell modning av murine dendrittiske celler via aktivering av NF-KB. Mol. Med. Rep. 8, 1216–1220.
Zhu, N., Lv, X., Wang, Y., Li, J., Liu, Y., Lu, W., Yang, L., Zhao, J., Wang, F., Zhang, LW, 2016 Sammenligning av immunregulatoriske effekter av polysakkarider fra tre naturlige urter og cellulært opptak i dendritiske celler. Int. J. Biol. Macromol. 93, 940–951.