CD8 og CD4 T-cellepopulasjoner i menneskelige nyrer
Mar 25, 2022
Abstrakt:Bakgrunn: Ved grensesteder og i indre organer bidrar vevsresidente minne T-celler (TRM) til immunbarrieren mot patogener som virus, bakterier, sopp og kreft. Informasjon om tilstedeværelsen og funksjonen til disse cellene i den menneskelige nyren er imidlertid liten. For bedre å forstå det T-cellemedierte immunologiske forsvaret i dette organet, hadde vi som mål å bestemme fenotypiske og funksjonelle aspekter av CD8- og CD4-T-celler som er tilstede i friske og allograftnyre vev. Metoder: Ved å bruke flerkanals medcytometri, vurderte vi fenotypen og funksjonen til T-celler i friske nyrevevsprøver (n=5) ognyreallograftvev (n=7) og sammenlignet disse aspektene med T-celler i perifert blod fra friske kontroller (n=13). Resultater:Nyrevevsprøver inneholdt betydelige mengder CD8 og CD4 T-celler. I motsetning til de sirkulerende cellene,nyreT-celler uttrykte ofte CD69 og CD103 og syklet oftere aktivt. Dessuten nesten allenyreT-celler uttrykte CXCR3, og uttrykte ofte CXCR6 sammenlignet med T-celler i sirkulasjonen. Utmerket,nyreT-celler produserte større mengder IFN enn sirkulerende celler og var ofte polyfunksjonelle. Konklusjon: Funksjonelle T-celler med de karakteristiske egenskapene til TRM finnes i menneskernyrevev. Disse cellene sykler oftere aktivt og uttrykker ofte CXCR3 og CXCR6.
Nøkkelord:vevsresidente lymfocytter; T-celler; CD8; CD4; CD69; CD103; nyre; allograft
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESYKDOM
1. IntroduksjonResident memory T-celler (TRM) vedvarer i vev for å gi et langsiktig lokalisert forsvar mot patogener. I motsetning til resirkulerende T-celler kan ikke TRM-populasjoner påvises i perifert blod, og skiller seg vesentlig fra resirkulerende T-cellepopulasjoner med hensyn til deres fenotype, funksjon og metabolisme [1]. Dette er faktisk ikke overraskende med tanke på det faktum at forskjellige organsystemer, som lungene, er utsatt for høyere belastninger av forskjellige patogener enn tilfellet er for sirkulasjonen, som generelt er isolert fra omverdenen [2].Vevretensjon av TkM vedvarer i årevis og formidles av mekanismer som involverer sfingosin-1-fosfatreseptor1 (S1PR1)-sfingosin 1-fosfat (SP1)-aksen. S1PR1 er en reseptor uttrykt av T-celler som medierer egresjon fra sekundære lymfoide organer ved binding til det bioaktive signalmolekylet SP1, som er en viktig mediator for T-cellehandel. Denne aksen kan avbrytes av CD69, et membranbundet c-type lektin som antagoniserer S1PR1-ekspresjon, og dermed medierer retensjon. Videre induseres S1PR1-ekspresjon hos mus av transkripsjonsfaktoren Krüppel-lignende faktor 2 (KLF2), som ble funnet å være nedregulert i TRM, og dermed også hemme lymfocyttutgang [3]. I sin tur ble nedregulering av KLF2 vist å være mediert av transkripsjonsfaktorhomologen til Blimpl i T-celler (Hobit), som uttrykkes på en TpM-spesifikk måte i murine T-celler [4]. Videre uttrykker noen TRM også CD103 (integrin E), hvorved TRM kan identifiseres ved bruk av CD69 og CD103 uttrykk [1].
Mens kunnskap om TRM-fenotype og funksjon øker for ulike menneskelige vev, er lite kjent om disse aspektene inyre. Her blir T-celler utsatt for et distinkt sett med patogener som bakterier som stiger opp fra de nedre urinveiene og renotrope virus som polyomavirus BK (BKPyV). Faktisk beskrev vi nylig hvordan menneskelige nyrer inneholder en undergruppe av T-celler som uttrykker CD69 og/eller CD103, blant dem er det CD8 T-celler som spesifikt retter seg mot BKPyV-proteinene virionprotein1(VP1) og stort T-antigen (LTAG)-protein [5]. Vi, og andre, demonstrerte også tilstedeværelsen av CD69/CD103-som uttrykker slimhinne-assosierte invariante T (MAIT)-celler inyrevev [6,7].
For bedre å forstå hva slags T-celler som utgjør den lokaliserte immunresponsen i dette organet, brukte vi flerkanals flowcytometri for å undersøke fenotypen og funksjonen tilnyreTRM-er, isolert fra givernyremateriale fra nyretransplanterte (RTR) og fra friskenyrevev ved siden av renale klare cellekarsinomer, for å se hvordan disse populasjonene sammenlignes med T-cellepopulasjoner i sirkulasjonen.Vi fant det mennesketnyrevev inneholder betydelige mengder CD4 og CD8 T-celler som bare uttrykker CD69, CD69 og CD103, eller ingen av disse markørene. Vi fant at CD69-CD103- celler innnyrevev skiller seg vesentlig fra T-celler i sirkulasjonen og kan representere en TRM-populasjon som mangler de kanoniske TRM-markørene. Videre viser vi at nyre-T-celler oftere sykler aktivt, bedømt ved økt ekspresjon av Ki-67, sammenlignet med blod. Vi fant også at CD8 og CD4 T-celler inyrevev uttrykker nesten alltid CXCR3 og uttrykker ofte CXCR6. Disse funnene impliserer en rolle for disse kjemokinreseptorene i tiltrekningen og vedlikeholdet av nyrebosatte minne T-cellepopulasjoner.
2. Materialer og metoder
2.1. Pasienter og prøverPrøver ble hentet fra Biobank Renal Diseases ved Amsterdam UMC-lokasjonen AMC. I denne Biobanken kan pasientprøver, som blod ognyrevev, samles og lagres fra sunn livsstilnyregivere og RTR-er som følges før og etter nyretransplantasjon. Denne studien ble utført i henhold til prinsippene skissert i erklæringene fra Helsingfors og Istanbul, og alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke før registrering i biobanken. I tillegg ble restvev fra pasienter som gjennomgikk tumornefrektomi (nyrevev fjernt fra svulsten) donert av patologisk avdeling og også lagret i biobanken. Disse vevene ble behandlet anonymt i henhold til Federation of Dutch Medical Scientific Societies' Code of Conduct (Human Tissue and Medical Research: Code of Conduct for Responsible Use, 2011 www.federa.org).
2.2. Perifere blodmononukleære celler (PBMC)Blodprøver ble tatt fra cytomegalovirus (CMV)-seronegative friske kontroller (levendenyredonorer før operasjonen, n= 13). Karakteristikker til deltakerne i denne studien er vist i tabell 1. PBMC-er ble isolert fra natriumheparinblod ved standard tetthetsgradientsentrifugering og deretter kryokonservert til analysedagen.
2.3. NyrevevFriske nyrevevsprøver (n {{0}}) ble hentet fra nyrer som ble fjernet kirurgisk på grunn av nyrecellekarsinom (fjernt ikke-tumorøst vev fra den kontralaterale polen til nyren) og transplantert nyrevev (n {{1 }}) ble oppnådd fra eksplanterte nyre-allografter etter transplantasjonssvikt. Disse prøvene omtales som henholdsvis friske og transplanterte nyreprøver. Skiver av nyrebarken ble kuttet i 1-mm terninger med McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, USA), overført til 50 mL rør og vasket med kald PBS til det ikke ble blod. synlig tilstede og supernatanten var klar. Forvarmet (37 grader) fordøyelsesmedium ble tilsatt, 40 ml per 10 g vev (DNAse Type IV (50 KU/mL) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Nederland), kollagenase type IV (0,5 mg/ml) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), BSA (60 mg/ml) (Sigma Aldrich), 20 uL/ml føtalt kalveserum (FCS, VWR International BV, Amsterdam, Nederland), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdam, Nederland), penicillin-streptomycin (Biochrom GMBH, Berlin, Tyskland) i HBSS (Westburg BV, Leusden, Nederland)), og inkubert i en shaker i 20 minutter ved 37 grader. Den varme suspensjonen ble overført til et C-rør (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Tyskland) og utsatt for M_milten_04.01-programmet på GentleMacs(Miltenyi). Fordøyelsesmediet ble deaktivert med kald PBS og den resulterende cellesuspensjonen ført gjennom en cellesil for å oppnå en enkeltcellesuspensjon, som ble utsatt for standard tetthetsgradientsentrifugering i henhold til produsentens protokoll (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Norge ). De isolerte mononukleære cellene (nyre MNCs) varkryokonservert til analysedagen i IMDM supplert med 20 prosent FCS, 000036 v/v prosent -merkaptoetanol, 5 prosent DMSO, penicillin og streptomycin.
2.4. FlowcytometriMålinger ble utført på et LSRFortessa flowcytometer (BD Biosciences). For hver prøve ble 2×106 PBMC eller 0,5×106 til 10×106 nyre MNC analysert. Volumet av hver fargereaksjon var i forhold til antall celler og antistoffkonsentrasjonene forble konstante. Celler ble inkubert med overflateantistoffene (tilleggstabell S1) i 30 minutter ved 4 grader i mørket. Døde celler ble ekskludert ved bruk av det fikserbare levedyktighetsfargestoffet eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonale antistoffer med intracellulære mål (tilleggstabell S1) ble lagt til etter fiksering og permeabilisering av cellene ved bruk av FoxP3/Transcription Factor Staining Set (eBioscience Inc.). Publiserte metoder for flowcytometri og cellesortering for immunologiske formål ble fulgt [8]. Gatestrategien som brukes for den fenotypiske analysen kan finnes i tilleggsfigur S1. Vi har tidligere vist at ingen av de analyserte markørene ble påvirket av fordøyelsesmetoden som ble brukt for å isolere nyre-MNC [7].
Begrensninger på vevsprøver resulterte i utelukkelse av prøver fra gardinpaneler. CD3 pluss celletall analysert per prøve i friske PBMC-er, sunne nyre-MNC-er og TX-nyrer kan finnes i figur S3. MNC-prøver ble bare analysert når de inneholdt over 50 prosent levende celler i lymfocytten, som vurdert av levedyktighetsdve, og CD69/CD103-baserte T-celle-undersett ble bare ytterligere karakterisert hvis deres totale celletall oversteg 50.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFEILT
2.5. StimuleringsanalysePBMC og nyre MNC ble stimulert som tidligere beskrevet [7,9]. PBMC-er og nyre-MNC-er ble tint i nærvær av DNAse I (200 KU/mL), vasket og tillatt å komme seg over natten i ubehandlede, rundbunnede 96-brønnplater (Corning) i kulturmedium (RPMI supplert med 10 prosent FCS og penicillin-streptomycin) ved en konsentrasjon på 20 × 106/mL (100 μL/brønn).
Neste morgen ble forbol 12-myristat 13-acetat (PMA, 10 ng/mL; Sigma Aldrich) og ionomycin (1 ug/ml; Sigma Aldrich) tilsatt for å stimulere cellene. Medium alene ble tilsatt som negativ kontroll. Alle inkubasjoner ble utført i kulturmedium i nærvær av CD28 (klon 15E8; 2 ug/ml), CD29 (klon TS 2/16; 1 ug/mL), brefeldin A (10 ug/ml, Invitrogen) og GolgiStop ( BD Biosciences) i et sluttvolum på 200 uL i 4 timer ved 37 grader og 5 prosent CO2.
Deretter ble cellene inkubert i 30 minutter med overflateantistoffene (tilleggstabell S2). Døde celler ble ekskludert ved bruk av fikserbar levedyktighetsfarge eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonale antistoffer for intracellulær farging (tabell S1) ble tilsatt etter fiksering og permeabilisering av cellene ved bruk av Cytofix/Cytoperm Reagent Set (BD Biosciences). Celler ble vasket to ganger og analysert på et LSRFortessa flowcytometer. Gatestrategien som brukes i funksjonsanalysen kan finnes i tilleggsfigur S2. For å bestemme polyfunksjonaliteten til hver T-celledelsett, ble gjennomsnittlig antall funksjoner for hver populasjon beregnet ved å bruke følgende formel:((prosent av celler som produserer 1 cytokin]*1) pluss ([prosent av celler som produserer 2 cytokiner]*2) pluss ([prosent av celler som produserer 3 cytokiner]*3) pluss ([prosent av celler som produserer 4 cytokiner]*4) pluss ([prosent av celler som produserer alle 5 cytokiner]*5))/100.
2.6.Dataanalyse
Data ble analysert ved å bruke FlowJo versjon 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Alle grafer og figurer ble laget med Graphpad Prism versjon 8.00 for Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Det samme programmet ble også brukt til de statistiske analysene av dataene. Den ikke-parametriske Mann-Whitney-U-testen ble brukt for å bestemme betydningen av uparrede prøver. For å sammenligne sammenkoblede prøver ble Wilcoxon signed-rank test brukt. p-verdier<0.05 were="" considered="" statistically="">
3. Resultater
3.1. Distinkt uttrykk for CD8 og/eller CD4 og markører for vevsresidens av T-celler i sunt nyrevevFørst sammenlignet vi uttrykket av CD4 og CD8 av CD3-positive T-celler i perifert blod med celler påvist i sunt nyrevev. CD4-CD8 pluss (CD8) T-celler ble signifikant oftere påvist i nyrevev enn i blod((median)25 prosent vs.38 prosent )(Figur la). I motsetning til dette, CD4*CD{{9} }(CD4)T-celler ble påvist i høyere frekvenser i blod enn i nyrevev ((70 prosent vs. 52 prosent )Figur la). Totalt sett ble CD4 T-celler sett hyppigere i sunt nyrevev enn CD8 T-celler (figur 1b).
Deretter undersøkte vi uttrykket av vevsresidensmarkørene, CD69 og CD103, i CD8- og CD4-definerte T-celleundersett. Som forventet ble CD69 og CD103 praktisk talt ikke uttrykt av celler i perifert blod (figur 1c). I sunt vev ble CD69-CD103-, CD69 plus CD103-, CD69tCD103 plus og CD69-CD103 pluss fenotyper uttrykt med 46 prosent , 45 prosent , 6,6 prosent, og 1,8 prosent av CD8T-celler, henholdsvis 61 prosent, 38 prosent, 0,44 prosent og 0,43 prosent av CD4T-celler (figur lc). Som konklusjon ble CD8, men spesielt CD4 T-celler påvist i et betydelig antall i sunt humant nyrevev. Videre ble uttrykk for CD69 og CD103, markører for vevsresidens, først og fremst påvist blant T-celler funnet i sunt vev og ikke i blod.
3.2. Forskjellige uttrykksmønstre for vanlige undergruppe-denominasjonsmarkører etter T-celle i helse/etter nyrevev
CD45RA, en tyrosinfosfatase, CCR7, en kjemokinreseptor kjent for å mediere T-celletrafikk til sekundære lymfoide organer, og CD28 og CD27, begge costimulerende reseptorer sterkt involvert i T-celleaktivering, er alle markører som tradisjonelt brukes til å identifisere funksjonelle T-celleundergrupper J1{ {53}},1l. Vi ønsket å undersøke i hvilken grad fordelingen av disse undergruppene i blod er forskjellig fra fordelingen i nyrevev. Som forventet var de største CD8 T-celleundergruppene som ble oppdaget i sirkulasjonen (dvs. de som gjaldt mer enn eller lik 5 prosent av den totale befolkningen) de med CD45RA pluss CCR7 pluss CD28 pluss CD27 pluss (naive T-celler eller TN, ( median) 13 prosent ), CD45RA-CCR7 pluss CD28 pluss CD27 pluss (sentralt minne T-celler eller TcM, 6 prosent ), CD45RA-CCR7-CD28 pluss CD27 pluss (TEv1,30 prosent ), CD45RA-CCR7-CD28 pluss CD27-(Tau2,10 prosent ), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 prosent ) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 prosent )og CD45RA pluss CCR7-CD28-CD27-(TEMRA ,10 prosent )fenotype. I sunt vev ble nesten ingen (0,6 prosent) CD8 T-celler påvist med en TN-fenotype, og bare noen få (0,8 prosent) viste en Tax-fenotype. I motsetning til dette var CD8 T-celler påvist i sunt nyrevev sammensatt av betydelige TEv1-(22 prosent ),TEM2-(12 prosent), Tpx3-(18 prosent ),TEx{ {65}} (23 prosent ), og TEyRA(11 prosent )T-cellepopulasjoner (figur ld og figur S4). Når man ser på CD4 T-celler i blodet, var de største populasjonene de som uttrykte Ty-(35 prosent), TcM-(25 prosent), TEMl-(16 prosent), TFM2-(9 prosent) og en populasjon med en ikke ellers spesifisert CD45RAtCCR7-CD28 pluss CD27* fenotype (0,4 prosent )(Figur 1d og Figur S4). I sunt nyrevev uttrykte få CD4 T-celler en TN- (3 prosent) eller en TcM -(3 prosent )fenotype. I stedet ble et betydelig antall celler med en TEM1-(22 prosent), TEM2-(40 prosent) eller TEM4(14 prosent) fenotype påvist i sunt vev (figur ld og figur S4) . Konklusjonen er at fordelingen av CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}definerte CD8- og CD4-T-celleundergrupper er vesentlig forskjellig mellom blod og friskt nyrevev.
3.3. CD8 og CD4 T-celler i sunt menneskelig nyrevev omfatter oftere aktivt syklingDeretter undersøkte vi om det er forskjeller i uttrykket av markører som er typiske for en cytotoksisk effektor-minneprofil, mellom CD8 og CD4 T-cellepopulasjoner i blod og nyrevev. Først så vi på uttrykket av T-boks-transkripsjonsfaktorene T-bet og eomeso-dermin(Eomes). Disse transkripsjonsregulatorene er direkte involvert i å generere akuttfase-effektorceller, indusere ekspresjonen av molekyler som interferon-y og granzyme B, og i genereringen av sekundære minneresponser. Som forventet var uttrykk for T-bet hyppig blant sirkulatoriske CD8 T-celler (54 prosent), mens sirkulatoriske CD4 T-celler sjelden uttrykte denne transkripsjonsfaktoren (13 prosent). Interessant nok var T-bet-ekspresjonen for CD4 T-celler signifikant høyere blant T-celler som ble oppdaget i sunt nyrevev enn i sirkulasjonen (53 prosent mot 13 prosent). Noe ekspresjon ble også påvist ofte blant sirkulatoriske CD8 T-celler (59 prosent), mens det igjen var sjeldent blant sirkulatoriske CD4 T-celler (15 prosent). Imidlertid var Eomes-ekspresjon hyppigere blant CD4 T-celler i nyrevev (32 prosent) enn i blod (Figur 2a,b).
Deretter undersøkte vi uttrykket av granzym B, en serinprotease som er kjent for å mediere apoptose etter injeksjon i cytoplasmaet av cytotoksiske T-celler. I tråd med tidligere rapporter ble T-bet og granzym B-ekspresjon påvist i betydelig antall i sirkulerende CD8 T-celler (28 prosent). Imidlertid var uttrykket sjeldent blant sirkulerende CD4 T-celler (1 prosent). For CD8 T-celler var uttrykket av granzym B likt i nyrevev og sirkulerende populasjoner (28 prosent ys.23 prosent) (Figur 2c). Interessant nok samsvarte ikke de høyere ekspresjonsfrekvensene for T-bet og Eomes påvist i CD4 T-celler i nyre med en høyere ekspresjonsfrekvens for granzym B i dette rommet (5 prosent). Vi så på uttrykket av KLRGl, en kohiberende reseptor kjent for å være hovedsakelig uttrykt av cytotoksiske akuttfase-effektorceller og effektor-minneceller. KLRG1 ble ofte uttrykt av sirkulerende CD8 T-celler (54 prosent), men ikke av CD4 T-celler ( 10 prosent). Ingen forskjeller ble funnet mellom anatomiske rom i KLRG1l-ekspresjon for CD8- eller CD4-T-celler. Til slutt undersøkte vi uttrykket av Ki-67, en markør som angir aktivt syklingende celler. I tråd med tidligere observasjoner var Ki-67-uttrykk blant sirkulerende CD8- og CD4-T-celler sjelden (henholdsvis 1 prosent og 2 prosent). Interessant nok, blant CD8 T-celler, men spesielt blant CD4 T-celler, ble Ki-67-ekspresjon signifikant oftere påvist i T-celler i nyrevev (henholdsvis 3 prosent og 11 prosent) (figur 2e). Som konklusjon ble CD4 T-celler påvist i sunt humant nyrevev, men ikke CD8 T-celler i dette rommet, oftere uttrykt T-bet og Homes. Dette førte imidlertid ikke til et hyppigere uttrykk av granzym B av CD4 T-celler i nyrene. Dessuten, selv om det totale antallet syklusceller var lavt, inneholdt nyrevev signifikant mer aktivt sykling CD8 og CD4 T-celler enn sirkulasjonen.
3.4. CD8 og CD4 T-celler i sunt nyrevev er nesten alle CXCR3-posisjonerVi så etter forskjeller i uttrykk for andre markører, typiske i sirkulerende populasjoner av ikke umiddelbart cytotoksiske minneceller, som vist tidligere for sirkulerende T-cellepopulasjoner. Vi så først på uttrykket av IL-7R, uttrykt primært på naive og tidlig-differensierte minneceller i sirkulasjonen, der det er involvert i å opprettholde homeostatisk proliferasjon [10,12,13]. I perifert blod ble IL-7Ra ofte uttrykt av CD8 T-celler (84 prosent) og CD4 T-celler (98 prosent). CD8 og CD4 T-celler i sunt nyrevev uttrykte denne markøren betydelig sjeldnere enn sirkulerende T-celler (henholdsvis 71 prosent og 76 prosent) (figur 2f).
Deretter undersøkte vi ekspresjonen av forskjellige andre kjemokinreseptorer. Interessant nok ble CXCR3, en kjemokinreseptor involvert i T-celle-trafikk til betent vev[14-17], uttrykt av et ekstremt stort antall CD8- og CD4-T-celler i nyrevev (99) prosent og 91 prosent, henholdsvis), og betydelig sjeldnere ved sirkulerende T-celler (henholdsvis 58 prosent og 26 prosent) (Figur 2g). Til slutt bestemte vi uttrykket for CXCR6, kjent for å være involvert i å danne TRM-populasjoner [18-22]. Mens CXCR6 ble uttrykt av bare en liten populasjon av sirkulerende CD8 T-celler (16 prosent), og praktisk talt ikke av sirkulerende CD4 T-celler. en betydelig større andel av CD8- og CD4-T-celler i nyrevev uttrykte dette molekylet (henholdsvis 40 prosent og 40 prosent) (Figur 2h). Avslutningsvis ble markører som vanligvis assosiert med en ikke umiddelbart differensiert tilstand i sirkulasjonen, sannsynligvis-7Ra, CCR7, CD28 og CD27, signifikant sjeldnere uttrykt av CD8- og T-celler i nyrene sammenlignet med de i blod. kontrast uttrykte nyre-T-celler oftere CXCR6 og nesten alltid uttrykte CXCR3.
3.5. Forskjellene i fenotype mellom friske nyrer og allograft T-celler er minimaleDeretter ønsket vi å undersøke om disse funnene ble stående i vev fra transplanterte nyre-allografter som ble oppnådd for ulike kliniske indikasjoner (Tabell 1).Med hensyn til antall CD8 og CD4 T-celler i sunt og allograft vev, ble det ikke sett noen forskjeller (figur 3a). Imidlertid la vi merke til en ikke-signifikant trend mot flere CD4T-celler og mindre CD8T-celler i sunt vev enn i allograftvev (figur 3b). I tillegg, når man ser på CD69/CD103expression og CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definerte delsett, er det ingen forskjeller i distribusjon av CD69/CD103- eller CD45RA/CCR7/CD28/CD27- definerte undersett ble notert, uavhengig av CD8/CD4-fenotype (figur 3d og figur S5). Når vi undersøkte ekspresjonsfrekvenser for markørene som er mer typiske for cytotoksiske sirkulerende T-celler, fant vi ingen forskjeller i ekspresjon av T-bet, KLRG1 eller granzym B mellom friske nyre- eller allograft-T-celler (Figur 3a, gh). Vi fant at Eomes-uttrykk ble sett sjeldnere i allograftvev CD4 T-celler enn i friske vevs T-celler (figur 3f). Ingen forskjeller i uttrykket til de andre markørene ble observert. (Figur 3-l og figur S5b-d). Avslutningsvis, bortsett fra en lavere ekspresjonsfrekvens av Eomer blant allograft CD4 T-celler, skilte ikke cellepopulasjoner seg mellom studiepopulasjoner.
3.6. CD69-CD103-T-celler i nyrevev er forskjellig fra sirkulerende cellerGitt den lignende fenotypiske sammensetningen av CD8- og CD4-T-celler funnet i sunt nyrevev og i nyre-allograftvev, samlet vi data fra begge studiegruppene for å undersøke egenskapene til disse cellene ytterligere i henhold til CD69- og CD103-uttrykk. Siden CD69-CD103 pluss-celler alltid ble oppdaget i svært lave frekvenser(<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Først undersøkte vi forskjeller i disse undergruppene i henhold til CD69/CD103-samuttrykk i nyre-T-cellepopulasjoner (figur 4 og figur S6). Interessant nok, for både CD8- og CD4-T-celler, ble det notert betydelige forskjeller i fordelingen av CD45RA/CCR7/CD28/CD{10}}definerte delsett blant CD69-CD103-, CD69 pluss CD{ {14}}og CD69*CD103* undersett. For CD8 T-celler inneholdt CD69-CD103--celler en betydelig populasjon av TeyRA-celler (21 prosent ) som var mye mindre blant CD69 pluss CD103- og CD69 pluss CD103 undersett (5,8) prosent og 2,2 prosent, henholdsvis). I stedet inneholdt disse sistnevnte populasjonene mye større TEy3 (henholdsvis 13 prosent, 30 prosent og 32 prosent) og TEy4 (henholdsvis 8 prosent, 19 prosent og 33 prosent) subpopulasjoner. For CD4 T-celler ble det sett få TEyRA-celler blant CD69-CD103-, CD69*CD103- og CD69 pluss CD103* undergrupper (2,6 prosent ,0 prosent og 1,7 prosent , henholdsvis). I stedet inneholdt disse cellene store underpopulasjoner av TFw1 (henholdsvis 26 prosent, 24 prosent og 10 prosent) og TEy2-eller (henholdsvis 30 prosent, 46 prosent og 27 prosent). Blant CD69 pluss CD103-og spesielt blant CD69*CD103*-cellene ble det sett en mye større TEM4-subpopulasjon (henholdsvis 6 prosent, 11 prosent og 34 prosent).
Gitt disse distinksjonene og den tidligere observasjonen at nyre-T-cellepopulasjoner knapt omfattet TN- og TcM-celler, undersøkte vi videre CD69-CD103--cellene funnet i nyrevev for å bestemme i hvilken grad disse cellene var ikke bare sirkulerende celler som passerer gjennom nyresirkulasjonen. For å gjøre det sammenlignet vi disse cellene med sirkulerende celler. CD69-CD103~celler i nyrevev skilte seg betydelig fra de i sirkulasjonen: T-bet, Ki-67 og CXCR3 ble uttrykt oftere av nyre-T-celler, uavhengig av CD8/CD4-fenotype (figur 5a-c). I motsetning til dette ble IL-7R, CCR7, CD28 og CD27 alle uttrykt signifikant sjeldnere av CD69-CD103- nyre-T-celler, uavhengig av CD8/CD4-fenotype (Figur 5d- g). CD69-CD103-CD4 T-celler i nyrevev uttrykte KLRG1 signifikant oftere enn i blod og CD69-CD103-CD8 T-celler i nyrevev uttrykte Eomer signifikant oftere enn i blod.
Deretter ønsket vi å se hvordan CD69 og CD103 samuttrykk påvirket markører for funksjonelt potensial. Først så vi på markører assosiert med cytotoksisk potensial. Selv om det ble notert forskjeller mellom individuelle subpopulasjoner, ble det ikke sett noen påfølgende mønstre for T-bet og Eomes i CD8 T-celler når CD69 eller CD103 ble samuttrykt (Figur 6a,b). I motsetning til CD4 T-celler økte disse transkripsjonsfaktorene begge sammen med CD69 og CD103 samekspresjon (figur 6a,b). Når vi så på KLRG1, la vi merke til at for CD8 T-celler avtok KLRG1-ekspresjonen sammen med CD69/CD103-samuttrykk. For CD4 T-celler ble en lignende trend sett. Her uttrykte imidlertid bare CD69-CD103-celler KLRG1 med en høyere frekvens enn CD69 pluss CD103- og CD69 pluss CD103* celler (Figur 6c). Ekspresjonsfrekvenser av granzym B falt også sammen med markører for vevsresidens, med ekspresjonsfrekvensen som var lavest blant CD69 pluss CD103*-celler, innenfor både CD8- og CD4-T-celler (figur 6d). Uttrykk av Ki-67, som var høyere blant nyre-T-celler sammenlignet med T-celler i blodet, var ikke forskjellig i henhold til CD69- eller CD103-samuttrykk (figur 6e).
Vi undersøkte deretter markører som normalt er assosiert med en ikke-cytotoksisk minneprofil i henhold til CD69/CD103 samuttrykk. Uttrykk av IL-7Ra, CCR7 og CD28 var høyest innenfor CD69-CD103--populasjonene, med en trend i å definere uttrykk sammen med samuttrykk av CD69/CD103 (Figur 6f-h ). Vi så på uttrykket til CXCR3 og CXCR6. Begge kjemokinreseptorene ble oftest uttrykt av CD69tCD103t-celler, uavhengig av CD8/CD4-fenotype, og viste en oppadgående trend med samuttrykk av CD69/CD103. Bare for CXCR6 var denne trenden statistisk signifikant, og påvirket både CD8 og CD4 Tells (Figur 6j,k). Som konklusjon er CD69-CD103--celler i nyrevev vesentlig forskjellig fra celler i sirkulasjonen og kan gjelde en annen TBv-populasjon som ikke er merket av CD69- eller CD103-ekspresjon. Den eneste markøren som skilte seg konsekvent, uavhengig av CD8/CD4-fenotype, når det gjelder CD69 og CD103 samuttrykk, var CXCR6.
3.7.T-celler i nyrevev produserer oftere interferon- enn T-celler i blodTil slutt undersøkte vi cytokinproduksjonskapasitet ved CD8/CD4-definerte T-cellepopulasjoner i nyrevev. Først sammenlignet vi produksjonen av interferon-y (IFNy), tumornekrosefaktor (TNF ), interleukin-2 (IL-2), granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF), og IL-17 av stimulerte CD8/CD4-definerte T-cellepopulasjoner funnet i blod til de i sunt nyrevev (figur 7a-e). Interessant nok ble bare IFNy konsekvent uttrykt av en større andel T-celler i sunt nyrevev, sammenlignet med T-celler i blodet, uavhengig av CD8/CD4-fenotype (Figur 7a). Forskjeller ble også lagt merke til på et individuelt delsettnivå. Spesifikt ble TNF og GM-CSF oftere produsert av CD4 T-celler i nyrevev (figur 7b.c). Med hensyn til polyfunksjonalitet (dvs. antall samtidig produserte cytokiner), ble CD4 T-celler i nyrevev funnet å være mer polyfunksjonelle enn CD4-celler i blodet (Figur 7f).
Deretter så vi på forskjeller i cytokinproduksjonskapasitet mellom stimulerte T-celler fra sunt og allograftvev. Ingen forskjeller i produksjonen av individuelle cytokiner, eller i en rekke samtidig produserte cytokiner ble påvist mellom T-celler fra sunt eller allograft nyrevev (figur S7). Siden CD69 uttrykkes ved stimulering av T-celler, studerte vi bare forskjellen mellom CD103-negative og CD103-uttrykkende CD4- og CD8-T-celler (figur 7g-). Når vi sammenlignet CD4- og CD8-T-celler som uttrykker CD103 med celler som ikke uttrykker CD103 i nyrevev, la vi merke til at CD8- og CD4-CD103-celler uttrykte mer IFNy enn CD103--celler (figur 7g). I tillegg, selv om IL-1ZA-produserende celler var lave blant CD103 pluss CD8 og CD4 T-celler i nyrevev, ble de konsekvent funnet oftere i denne populasjonen sammenlignet med CD103--populasjonen. Som konklusjon produserte flere T'-celler i nyrevev IFNy sammenlignet med sirkulerende T-celler, uavhengig av CD8/CD4-fenotype. Faktisk ble den høyeste prosentandelen av IFNy-produserende celler funnet blant CD103-som uttrykker CD4 og CD8 nyreavledede T-celler. I tillegg skilte T-celler i nyre-allotransplantater seg ikke fra de i sunt nyrevev med hensyn til disse parameterne.
4. Diskusjon
I den nåværende studien tok vi for oss mangfoldet av T-celleundersett, i henhold til uttrykket av CD8 og CD4, og markørene for vevsresidens, CD69 og CD103, i menneskelige nyrer og sammenlignet med disse med blod. Betydelige antall CD8- og CD4-T-celler ble faktisk påvist i nyrevev. Videre inneholdt disse T-cellene i nyrene et betydelig antall CD69*CD103-celler. CD69 pluss CD103 pluss-celler ble også påvist, men hovedsakelig blant CD8 T-cellene og var praktisk talt ikke-eksisterende blant CD4 T-celler. Et lignende funn gjaldt lunge-TRM tidligere [23]. Som forventet var slike CD69- og CD-{15}}uttrykkende populasjoner i stedet nesten fraværende i sirkulasjonen. En slående forskjell når man sammenligner T-celler i nyrene med de i blod, gjaldt en distinkt fordeling av de tradisjonelle CD45RA/CCR7/CD28/CD{19}}definerte undergruppene. Interessant nok ble uttrykket av CD28 oftere ikke uttrykt når T-celler uttrykte CD69 alene eller i kombinasjon med CD103. Teoretisk sett burde dette gjøre disse populasjonene mindre mottakelige for costimulerende signaler fra CD80 og CD86. Andre forskjeller gjaldt en høyere ekspresjonsfrekvens for CXCR3, CXCR6 og Ki-67. I tillegg inneholdt nyre-T-celler oftere IFNy-produserende celler og var ofte polyfunksjonelle. Faktisk inneholdt CD103 pluss Tpys i nyrene flere IFN-produserende celler enn deres CD103-negative motstykker. I tillegg produserte CD103T-celler oftere IL-17, selv om dette gjaldt en beskjeden populasjon.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREINFEKSJON
Med hensyn til den hyppigere ekspresjonen av CXCR3 av CD8- og CD4-nyre-T-celler, ble CXCR3/CXCL10-aksen tidligere vist å være involvert i utformingen av TpM-populasjoner i hud, lever og lymfoidvev [24-28]. I tillegg er det involvert i menneskehandel til stresset epitel og betennelse i generell forstand [14-17]. Gitt de høye frekvensene av CXCR3 blant disse T-cellene i sunt nyrevev, ser CXCR3 ut til å være implisert i TRM-homeostase i nyrevev også og kan ikke nødvendigvis involvere betennelse eller faresignaler for å gjøre det. Når det gjelder CXCR6, har CXCR6/CXCL16-aksen faktisk allerede vist seg å være essensiell for handel med Tpst til forskjellige rom som lunger, hud, lever og hjerne, og kan dreie seg om en universell mekanisme som er avgjørende for å lede og beholde TRM til og i vev, også angående TRM i humant nyrevev [18-22].
Farber og medarbeidere har omfattende karakterisert og sammenlignet CD8- og CD4 TRM-populasjoner som er bosatt i forskjellige menneskelige vevstyper avledet fra organdonorer. De beskrev hvordan TRM-populasjoner i lunge, milt, tynntarm og ulike sekundære lymfoide vev er forskjellige med hensyn til transkriptomet, men også til uttrykket av ulike proteiner, inkludert cytokiner, undersøkt i den nåværende studien [29-31. Disse undersøkelsene omfattet imidlertid ikke TRM-populasjoner i den menneskelige nyren, og data om dette
emnet er lite. Vi har tidligere vist at CD8 T-celler rettet mot polyomavirus BK VP1- og LTAG-proteiner, som stammer fra et virus som har en sterk tropisme for nyreepitelceller, kan påvises i allotransplanterte nyrer. Disse virusspesifikke T-cellene uttrykte CD69 og CD103 i høyere antall enn deres motparter som ble funnet i sirkulasjonen til de samme pasientene. Videre uttrykte disse T-cellene generelt en CD45RA-CD27-granzyme B-negativ fenotype[5]. Senere har andre også rapportert om TRM-populasjoner i humant nyrevev hentet fra transplanterte nefrektomier. I denne publikasjonen rapporterer forfatterne at T-celler i disse vevene hovedsakelig gjaldt CD8 T-celler [321. Vi fant i stedet ut at CD4 T-celler faktisk utgjorde den største T-celleundergruppen. Imidlertid fant vi også at balansen skiftet, men ikke signifikant, mot et større antall CD8 T-celler i allograftvev sammenlignet med sunt nyrevev. Som sådan kan dette avviket forklares av en annen studiegruppe, og det kan være at i helse er det immunologiske forsvaret mer fokusert på ekstracellulære trusler, som bakterier, versus mer intracellulære trusler, som virus og kreft hos immunkompromitterte verter. Vi fant ikke andre forskjeller i markørene som ble studert, mellom friske nyre og allograft-T-celler. Imidlertid bør videre forskning, ved å bruke teknikker med et bredere syn på transkriptomer, som RNA-sekvensering, eller proteom, som massespektrometri, brukes for å fastslå om dette faktisk er tilfelle.
I tillegg har de Leur et al. beskrive hvordan TRM i nyrer ofte uttrykte granzym B, mens vi kun oppdaget lave mengder granzym B i både friskt og allograft nyrevev [32]. Imidlertid oppdaget vi betydelige T-bet og Eomes-uttrykkende T-celler i nyrevev, som i sirkulerende T-cellepopulasjoner, normalt faktisk er assosiert med et høyere uttrykk av granzym B [10]. Selv om sistnevnte kanskje ikke er overraskende, gitt det faktum at granzym B-ekspresjon også er direkte indusert av T-bet [33,34], var denne assosiasjonen ikke tydelig blant nyre-T-celler i den nåværende studien. Som vi og andre har vist at også menneskelig lunge-, hjerne- og hudavledet TRM [25,26,3536], så vel som nyreavledet vevsresident MAIT æll 【6,7】 har lavt innhold av granzym B. innhold, mens det ofte uttrykker betydelige mengder T-bet og Eomes, kan dette være et vanlig trekk ved (menneskelig) TkM. Videre, i lunge TRM ble granzym B-ekspresjon sett å bli raskt oppregulert ved stimulering [35l, noe som tyder på at dette også kan forekomme i andre TeM. Her antok forfatterne at slik 'skjult cytotoksisitet tjener til å beskytte den strukturelle integriteten til vev mot skade av cytotoksiske T-celler.
Avslutningsvis viser vi at Tcl-er i nyrevev er tilstede i et betydelig antall og omfatter populasjoner som ofte uttrykker CD69 pluss og CD103 pluss, molekyler som T-celler fester seg til og vedvarer i vev. Likevel ser CD69-CD103- T-cellene i nyrevev ut til å være forskjellig fra sirkulerende T-celler og kan gjelde en annen distinkt TiM-populasjon, muligens vedvarer i nyrene av andre mekanismer vet å bli avslørt. Et annet alternativ kan være at disse CD69-CD103-T-cellene angår en populasjon som nylig har forsvunnet fra sirkulasjonen, og haye har bare forbigående ervervet nye fenotypiske egenskaper på grunn av en interaksjon med nyrenes mikromiljø. Ytterligere undersøkelser av denne populasjonen er nødvendig for å belyse disse mulighetene. Dessuten. CD8- og CD4-nyre-T-celler var ofte aktivt sykling og uttrykte oftere CXCR6. I tillegg fortrengte CD8- og CD4-populasjoner et spesielt høyt uttrykk av CXCR3, noe som sterkt impliserte disse kjemokinreseptorene, så vel som CXCR6 i TRM-oppsamling og persistens i menneskelige nyrer. Derfor er det nødvendig med ytterligere undersøkelser for å forbedre bildet vårt av Tpv-populasjoner i den menneskelige nyren. Likevel utgjør funnene som presenteres her et solid første skritt mot en mer detaljert karakterisering av T-cellepopulasjoner i nyrevev og deres rolle i helse og sykdom.
