Integrativ Omics-analyse avdekker mikrovaskulær betennelsesrelaterte veier i nyre-allograft-biopsier
Mar 24, 2022
Ved transplantasjon av faste organer har mikroRNA (miRNA) dukket opp som nøkkelspillere i reguleringen av allograftcellefunksjon som svar på skade. For å få innsikt i rollen til miRNA i antistoffmediert avvisning, en avvisningsfenotype histologisk definert av mikrovaskulær betennelse,nyre allograftbiopsier ble utsatt for miRNA, men også messenger RNA (mRNA) profilering. Ved å bruke en unik flertrinns seleksjonsprosess spesifikk for BIOMARGIN-studien (oppdagelseskohort, N=86;seleksjonskohort, N=99; valideringskohort, N=298),seks differensielt uttrykte miRNA-er ble konsekvent identifisert:miR-139-5p (ned) og miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (opp). Ekspresjonsnivået deres korrelerte gradvis med mikrovaskulær betennelsesintensitet. Cellespesifisiteten til miRNAs målgener ble undersøkt ved å integrere deres in vivo mRNA-mål med encellet RNA-sekvensering fra en uavhengig allograftbiopsikohort. Endotelavledet miR-139-5p-ekspresjon korrelerte negativt med MHC-relatert genuttrykk. Omvendt var epitelavledet miR-222-3p-overekspresjon sterkt assosiert med degradert nyreelektrolytthomeostase og undertrykte immunrelaterte veier. I immunceller regulerte miR-150-5p NF-kB-aktivering i T-lymfocytter, mens miR-155-5p regulerte mRNA-spleising i antigenpresenterende celler. Til sammen gjorde integrerte omics oss i stand til å avdekke nye veier involvert i mikrovaskulær betennelse og antyde at metabolismemodifikasjoner i tubulære epitelceller oppstår som en konsekvens av antistoffmediert avvisning, utover det nærliggende endotelrommet.
Nøkkelord:nyretransplantasjon, mikroRNA, multi-omics, mikrovaskulær betennelse, antistoffmediert avvisning
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESYKDOM
INTRODUKSJONInyretransplantasjon(KT), alloimmun skade er vanligvis dikotomisert i to typer allograftavvisning i henhold til den romlige fordelingen av immuninfiltrasjon og informasjon om tilstedeværelse eller fravær av donorspesifikke anti-HLA-antistoffer. Diagnosen er avhengig av allograft-biopsien med gradering av histologiske lesjoner i henhold til Banff International Consensus-klassifiseringen(1). Tubulitt ("t"-lesjon) og interstitiell betennelse ("I"-lesjon) er kjennetegnende histologiske trekk ved T-celle-mediert avvisning (TCMR) og er relatert til direkte cytotoksisitet til det tubulointerstitielle rommet. Antistoffmediert avvisning (ABMR) er oftest assosiert med sirkulerende anti-HLA-antistoffer med betennelse rettet mot det mikrovaskulære rommet. Aktive ABMR histologiske lesjoner inkluderer tilstedeværelsen av mononukleære celler i glomerulære kapillærer ("g"lesjon) og i peritubulære kapillærer ("ptc" lesjon), kombinert referert til som "mikrovaskulær inflammasjon" (MVI). Ved kronisk aktiv ABMR legger kronisk vevsskade som transplantasjonsglomerulopati eller arteriell intimal fibrose opp til disse akutte lesjonene(1). Ved å bruke de nåværende T'-celle-målrettede immunsuppressive midlene, anses TCMR å ha en begrenset prognostisk innvirkning, mens ABMR er en hovedårsak til graftsvikt, noe som er relatert til mangelen på effektive terapeutiske tilnærminger (2).
For å finne bedre terapier for MVI og ABMR, er det nødvendig med bedre innsikt i de biologiske mekanismene som ligger til grunn for disse skadeprosessene. Omics-teknologier med høy gjennomstrømning ser ut til å være egnet for formålet siden de tillater nøyaktig og samtidig screening av tusenvis av gener, proteiner og metabolitter(3). Hel-transkriptom avhør avnyreallograft-biopsier har vist dype mRNA-genekspresjonsendringer i de skadde residente cellene eller i infiltrerende cellepopulasjoner under ABMR(4). I mellomtiden har mikroRNA (miRNA) dukket opp som nøkkelspillere i cellemetabolisme, ved å regulere messenger RNA (mRNA) på posttranskripsjonelt nivå. Faktisk revolusjonerte miRNA vår forståelse av finjusteringen av kroppens fysiologiske prosesser involvert i spredning, apoptose, differensiering og utvikling(5). Ikke overraskende resulterer dysregulert miRNA-uttrykk i utviklingen av mange patologier, inkludertnyresykdom(6). Siden miRNA-ekspresjonsprofiler er forskjellige mellom syke og friske tilstander, har mange studier analysert miRNA enten alene eller i kombinasjon med andre mer tradisjonelle markører, ikke bare for å diagnostisere sykdom og prognostisere sykdomsprogresjon, men også for å designe potensielle terapeutiske anvendelser (7).
I sammenheng med transplantasjon av faste organer kan miRNA-er være involvert i avstøtning gjennom sin rolle i reguleringen av immuncellefunksjonen og i responsen til celler som bor i allograft på skade (6,8). Flere studier har undersøkt allograft miRNA som biomarkører og/eller effektorer i settingene til TCMR (8,9), men ingen har så langt fokusert på MVI og ABMR. I denne studien hadde vi som mål å integrere ulike omics-nivåer franyreallograft biopsier, for å få innsikt i rollen til miRNA i denne skadelige avvisningsfenotypen.
MATERIALER OG METODER StudiedesignDenne studien er en del av FP7-finansierte BIOMArkers ofNyreGraft Injuries forskningsprogram (BIOMARGIN, https://cordis.europa. eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, nummer NCT02832661), ledet av et europeisk forskningskonsortium på jakt etter biomarkører for allograft-immunlesjoner inyretransplantasjonmottakere, med diagnostisk og/eller prognostisk verdi. BIOMARGIN er en multisenter, prospektiv, flerfasestudie, utført på firenyretransplantasjonsentre i Europa (Necker Hospital, Paris, Frankrike; Universitetssykehus, Leuven, Belgia; Hannover Medical School, Hannover, Tyskland; og Universitetssykehuset, Limoges, Frankrike). Prøver ble prospektivt samlet på tidspunktet for screening og indikasjonsbiopsier mellom april 2013 og juni 2015 (Figur IA). Alle transplantasjoner ble utført med negativ komplementavhengig cytotoksisitetskryss. I disse fire kliniske sentrene ble protokollbiopsier utført ved 3,12 og noen ganger 24 måneder etter transplantasjon, i henhold til lokal senterpraksis, i tillegg til indikasjonsbiopsiene. Den institusjonelle vurderingskomiteen på hvert sted godkjente studien, og alle pasientene ga skriftlig informert samtykke.
StudiekohorterStudien ble delt inn i tre faser (figur 1A). I den første case-control-oppdagelsesfasen ble N=88 biopsiprøver brukt til global miRNA-ekspresjonsanalyse (N=754 miRNA, unntatt potensielle normaliserende miRNAer) . Vi valgte prøver basert på tilgjengelighet og histologiske kriterier (unntatt tilfeller med diagnosen glomerulonefritt eller polyomavirus-assosiert nefropati og tilfeller med uklar diagnose). Basert på lokale biopsiavlesninger ble det foretatt et første utvalg, som ble ytterligere foredlet gjennom sentral avlesning av en gruppe patologer, uavhengig av det opprinnelige senteret. Statistisk analyse (se miRNA-utvalg) ble brukt til å velge den utvidede listen over miRNA-er, mest forskjellig uttrykt mellom histologiske fenotyper, som deretter ble kvantifisert i den andre fasen.
Et lignende case-kontroll studiedesign ble brukt for den andre (seleksjons)fasen, der målrettet miRNA-ekspresjonsanalyse (N=143) ble utført på N=99 biopsiprøver. Den samme statistiske rørledningen ble brukt for å velge en enda mer begrenset liste over miRNA-er, som deretter skal kvantifiseres i den tredje fasen. Til slutt, i den tredje (validerings-) kohorten, ble alle prøver prospektivt og fortløpende samlet inn i henhold til BIOMARGIN-protokollen mellom 24. juni 2014 og 2. juli 2015, og med tilstrekkelignyreallograftbiopsikvalitet, ble vurdert for de 38 miRNAene som ble valgt som et resultat av den andre seleksjonsfasen. I denne kohorten i virkeligheten ble det ikke gjort noe utvalg basert på histologi, demografi, tid eller andre faktorer enn prøvetilgjengelighet og kvalitetskontrollkriterier (tilstrekkelig biopsi og RNA-utbytte).
utvelgelse av miRNAEn robust statistisk pipeline ble spesielt utviklet for BIOMARGIN-studien i R(R Core Team(10), versjon 1.0.44), som en utvidelse av biosignal R-pakken(1l). Kort fortalt, i oppdagelsesfasen gjennomførte vi en funksjonsvalgstrategi inkludert univariate og multivariate tilnærminger. For univariat utvalg brukte vi en ikke-parametrisk test (Wilcoxon-Mann-Whitney-test) og en parametrisk test (Students t-test), og en Discovery-kohort (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Prediksjonsskårene for hvert miRNA-transkript i hver multivariatmodell ble integrert for å gi en "multivariatscore". Ved å kombinere resultatene av disse univariate og multivariate analysene, var vi i stand til å rangere og velge et undersett av miRNA-kandidater for å være en del av den utvidede listen som skal kvantifiseres i neste fase.For denne posthoc-analysen med fokus på VMI-veier, ble median normalisert uttrykk for hver miRNA sammenlignet mellom tilfeller og kontroller ved å bruke Wilcoxon-testen i alle tre kohorter. Vi kontrollerte for flere tester ved å bruke Benjamini & Hochbergs metode for falsk oppdagelsesrate (FDR).
Klinisk patologisk vurderingDe individuelle histologiske lesjonsskårene ble semikvantitativt vurdert i henhold til Banff 2019-kriteriene(16). Begrepet "mikrovaskulær betennelse" (MVI) ble brukt for å referere til en hvilken som helst grad av kombinasjon av glomerulitt (g) og/eller peritubulær kapillaritt (ptc). Alle ABMR-tilfeller oppfylte de to første kriteriene i Banf 2015- eller Banff 2017-klassifiseringen (histologisk bevis på akutt vevsskade og bevis på nåværende/nylig antistoffinteraksjon med vaskulært endotel), men ikke alle oppfylte det tredje kriteriet [serologiske bevis på donorspesifikke antistoffer (DSA) og/eller CAd-farging]. DSA-er etter transplantasjon ble bestemt i henhold til lokal senterpraksis, med DSA-positivitet definert som påvisbare donorspesifikke serum-anti-HLA-antistoffer med gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) verdi på 500 på tidspunktet for biopsi eller et hvilket som helst tidspunkt før.
RNA-ekstraksjon fra biopsiprøver for mRNA- og miRNA-profileringTo-nålskjerner ble tatt ved hvernyreallograft biopsi. Den ene ble brukt til konvensjonell histologisk gradering, og minst halvparten av den andre ble umiddelbart lagret i Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Nederland). Allprotect-rørene ble lagret ved 4C (minimum 24 timer til maksimalt 72 timer) , og deretter lagret ved -20 gradsgrad frem til RNA-ekstraksjon. Totalt RNA ble isolert franyreallograft biopsiprøver ved bruk av Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen Benelux BV) på et QIAcube-instrument (Qiagen Benelux BV). Mengden (absorbans ved 26{{20}} nm) og renhet (forholdet mellom absorbansen ved 230 260 og 280 nm) av det isolerte RNA ble målt ved bruk av NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo) Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgia). RNA-integritetsnummer (RIN) ble evaluert med Eukaryote nano/pico RNA-settet (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgia) på Bioanalyzer 2100-instrumentet (Agilent Technologies BelgiumNV). Kvalitetskontrollindeksene var ikke signifikant forskjellige mellom VMI og No. MVI-grupper [RIN(middel±SD):5,6±1,96 vs5,4±1,97,P=0.66;260/280-forhold (gjennomsnitt±SD):1,87±0,06 vs 1,87±0,1l,P{{26 }}.40]. For RNA-prøver med lav RIN(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRE DIALYSEN
miRNA profileringSpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 ble ansett som ikke uttrykt. RNU44 og RNU48 viste konsistent uttrykk i alle prøvene gjennomsnittlig (RNU44 pluss RNU48) variasjonskoeffisient var 3,73 prosent i Array Card A og 3,79 prosent i Array Card B] og ble brukt som husholdningsgener for datanormalisering på tvers av alle delstudier.
mRNA transkriptomisk analyseTranskriptomisk analyse ble utført med mikroarray som allerede beskrevet(17). Kort fortalt ble totalt RNA ekstrahert fra biopsiprøvene først amplifisert og biotinylert til komplementært RNA(cRNA) ved å bruke GeneChip 39 IVT PLUS Reagent Kit (Affymetrix) og hybridisert til Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays( Affymetrix), som omfattet 54 675 probesett som dekket hele genomet. Vi brukte en Robust Multichip Average (RMA) normalisering. Median normalisert uttrykk for hvert mRNA ble sammenlignet mellom tilfeller og kontroller ved å bruke Wilcoxon-testen. Vi kontrollerte inflasjonen av risiko-alfa på grunn av flere tester ved å bruke Benjamini & Hochberg-metoden for falsk oppdagelsesrate (FDR). Mikroarray-dataene ble håndtert i samsvar med retningslinjene for minimumsinformasjon om mikroarray-eksperiment.
I Silico AnalyserBiologisk tolkning av Multiomics EXperiments(BIOMEX)-programvare ble brukt for transkripsjonsdatadifferensialanalyse, ved bruk av Ensembl ID-annotering(18). Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Bygg: 478438M Innholdsversjon: 44691306, Qiagen) og OMICSnet(19) ble brukt til å bestemme settene med gener regulert av de utvalgte miRNAene. OMICSnet ble brukt til å utføre Gene Ontology-analyse med Reactome pathway-databasen, ved å bruke den komplette pathwayen (20). Byggingen av gennettverk var fullstendig uten tilsyn og var avhengig av antall rapporterte molekylære interaksjoner av hvert enkelt gen med alle andre gener i nettverket. Gener som presenterte det høyeste antallet interaksjoner ble automatisk plassert i midten av nettverket, mens genene med et lavere antall interaksjoner ble spredt ut i periferien. Den cellulære opprinnelsen til utvalgte miRNA-er ble undersøkt ved hjelp av Fantom5-prosjektet(21), som gir en cap-analyse av genuttrykk i humane celler og vev. For miRNA-ekspresjonsanalyse vurderte vi allenyre-relaterte strukturelle celler og alle sirkulerende hematopoietiske celler, uten ytterligere seleksjon.
Encellet RNA-sekvenseringsdataanalyseTidligere publiserte humane encellede RNA-sekvenseringsdata (siRNA-seq) fra to ABMR-biopsier og fire friske referanser tilsvarende transplantasjonsovervåkingsbiopsier ble brukt. De tilknyttede råtellingene eller matrisene ble lastet ned henholdsvis fra GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22)ogNyrePresisjonsmedisinprosjekt (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Rå genekspresjonsmatriser generert per prøve ble slått sammen og analysert ved bruk av Seurat V4-pakken (23). Parametrene som ble brukt for å lage og filtrere Seurat-objekter var som følger: inkludering av celler som uttrykker mellom 500 og 10 000 påviste gener og mindre enn 25 prosent mitokondrielle transkripter. Etter filtrering ble alle objekter integrert ved hjelp av SCTransform-integrasjonsarbeidsflyten på Seurat (24). Kort fortalt ble 3000 funksjoner brukt for integrasjon ved bruk av PrepSCTIntegration-funksjonen, og FindIntegrationAnchors-funksjonen ble brukt for å begrense batcheffekt. Et fullstendig Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) datasett ble generert ved hjelp av DimPlot-funksjonen og de 16 viktigste komponentene. Klynger ble bygget ved hjelp av funksjonene FindNeighbors og FindClusters med en oppløsning på 0,6. Klyngeidentifikasjon ble utført ved å bruke FeaturePlot-funksjonen ved å evaluere uttrykket av spesifikke markører i hver klynge. Punktplott ble generert ved å bruke DotPlot- og FeaturePlot-plottfunksjonene, med normaliserte tellinger i RNA-analysen som inngangsdata.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREINFEKSJON
Statistisk analysePasient- og donorkarakteristikker ble beskrevet med tall, prosenter og frekvenser for kategoriske variabler. Vi rapporterte kontinuerlige variabler ved bruk av gjennomsnitt og standardavvik (SD) hvis normalfordelt, medianer og interkvartilområder (IQR) for variabler med skjev fordeling. Vi sammenlignet egenskapene deres ved å bruke Fisher- eller Wilcoxon-testen når det var hensiktsmessig. Vi brukte Kruskal-Wallis-testen for å sammenligne median miRNA-uttrykk i henhold til MVI-intensitet, og Spearman-testen for korrelasjonsanalyse. Vi vurderte statistisk signifikans for P-verdier mindre enn 0.05. Vi brukte GraphPad Prism (versjon 8; GraphPad Software, San Diego, CA) og RStudio (versjon 4.0.3) for statistisk analyse og datapresentasjon. Følgende R-pakker ble brukt: heatmap3 (varmekart3_1.1.9)for varmekartanalyser, fmsb(fmsb_0.7.0) og skalaer (skalaer_1.1.1)pakker for radarplott, ggplot2 (ggplot2_3.3.5) for søylediagrammer, og complot(korrplot_0.90) for korrelasjonsmatriseanalyse.
RESULTATER
Flertrinnsidentifikasjon av MVI-assosierte miRNAerBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). De andre 59 pasientene (MVI-) presenterte ulike diagnoser som omfattet T-cellemediert avvisning (TCMR, N=8), interstitiell fibrose og tubulær atrofi (IFIA,N=20), og normale biopsier (N{{6} }}), men ingen MVI. Fra de 754 miRNA-kandidatene ble 18 miRNA-er differensielt uttrykt mellom MVI pluss- og MVI-grupper (Figur 1B). I seleksjonskohorten ble en begrenset liste på 143 miRNA kvantifisert i 99 prøver. I denne seleksjonskohorten ble 14 miRNA-er differensielt uttrykt mellom tilfeller med (N=28) og uten (N=71)ABMR (figur 1C). Til slutt, i den største transseksjonelle kohorten, ble 38 miRNA-er kvantifisert i 298 prøver, hvorav 12 miRNA-er ble differensielt uttrykt mellom ABMR(N=29) vs ingen ABMR (N=269)-biopsier (Figur 1D) ).
Konsekvent identifikasjon av 6 MVI-assosierte MiRNA-er og korrelasjon til histologiDeretter krysset vi de 3 listene over differensielt uttrykte miRNA-er og identifiserte 6 miRNA-er som konsekvent var assosiert med MVI eller ABMR på tvers av de 3 uavhengige kohortene (figur 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p og miR-223-3p ble overuttrykt i MVI/ABMR, mens miR-139-5p-uttrykk ble redusert. Radarplott (Figur 2B) viser for hvert trinn forskjellsuttrykket mellom tilfelle og kontroller av de 6 miRNA-ene og støtter robustheten til miRNA-profilene på tvers av de tre uavhengige kohortene. Deretter studerte vi hvordan 6 miRNA-ekspresjonen er assosiert med individuelle histologiske lesjoner på tvers av alle 483 allograftbiopsier tatt sammen. Ekspresjonen av de 5 oppregulerte miRNA-ene økte gradvis med MVI-lesjonens intensitet, mens uttrykket av miR-139-5p var negativt korrelert (figur 2C).MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p var ikke bare sterkt assosiert med ABMR-relaterte egenskaper (g, ptc, C4d-avsetning), men også med TCMR-relaterte lesjoner(i, t ) og IFTA-lesjoner (ct, ci), noe som tyder på deres involvering i vanlige, ikke-ABMR-spesifikke, inflammatoriske og arrdannelsesprosesser. Alternativt kan det være en iboende kollinearitet mellom lesjonene, noe som resulterer i vår manglende evne til å identifisere sann spesifisitet for en lesjon. MiR-222-3p korrelerte ikke med histologiske lesjoner av TCMR eller IFTA (figur 2D).
Multi-Omics-integrasjon: mRNA-miRNA-samspill i MVDeretter evaluerte vi de differensielt uttrykte genene mellom MVI pluss og MVI-tilfeller, i det tidligere publiserte funnsettet (25). Av de 54 675 probene ble totalt 2755 differensielt uttrykte gener (DEG) identifisert mellom MVI pluss og MVI-
grupper, omfattende 1085 nedregulerte og 1670 oppregulerte gener (Figur 3A). De mest differensielt uttrykte mRNA-ene i MVI pluss-prøver var CXCL9 og CXCL10, i tråd med tidligere rapporter (17,26) om at disse genene er de mest overuttrykte i ABMR. Deretter brukte vi IPA og OMICSnet for å identifisere i silico de antatte målgenene for hver miRNA. Totalt 4504 mRNA-er ble spådd å bli målrettet av minst ett av de 6 miRNA-ene. Deretter integrerte vi disse 4504 forutsagte målene med DEG-ene i allograft-biopsier. Integrert miRNA/mRNA-analyse identifiserte 61 DEG målrettet av miR-139-5p som ble betydelig økt i MVI pluss biopsier. Den identifiserte også 28, 58, 52, 43 og 27 DEG signifikant redusert i MVI pluss biopsier som ble målrettet av henholdsvis miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p,og miR-223-3p (Figur 3B).
Cellulær opprinnelse til de MV-assosierte miRNAeneDen cellulære opprinnelsen til de seks miRNA-ene ble karakterisert i forskjelligenyrecelle- og hematopoietiske celleundertyper ved bruk av miRNA-atlas tilgjengelig online [Fantom-database (27)]. Uovervåket klynging diskriminertnyrecelleavledede miRNAer fra immuncelleavledede miRNAer (figur 4A). Det avslørte også en eller to dominerende celletyper for hver miRNA. MiR-139-5p så ut til å være hovedsakelig uttrykt av glomerulære endotelceller (EC). MiR-222-3p, selv om uttrykket ikke var korrelert med tubulær betennelse (Banff lesjoner"t", figur 2D), var først og fremst relatert tilnyreepitelceller. De fire gjenværende miRNA-ene ble primært uttrykt i mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) eller granulocytter, med miR-142-3p anriket på NK-celler og monocytter, miR-150-5p i CD4 pluss og CD8 pluss T-celler,miR -155-5p i CD19 pluss B-celler og makrofager, ogmiR-223-3p i nøytrofiler.
Encellet RNA-sekvensering identifiserte alle nyreceller og infiltrerende immunceller For å karakterisere den potensielle rollen til hver MVI-assosiert miRNA, analyserte vi offentlig tilgjengelige sc-RNAseq-data fra tonyreallograftbiopsier med ABMR og høye MVI-skårer (g2, ptc3)(22). Disse datasettene ble integrert med 4 friske referansebiopsier uten MVI. Etter kvalitetskontroll og filtrering ble 31545 celler oppdaget og uovervåket klynging avslørte 12 klynger (figur 4B). Vi brukte veletablerte markører (28) for å identifisere alle de viktigste bosatte og infiltrerende cellesubtypene og merke dem (tilleggsfigur S2). Deretter fokuserte vi på cellepopulasjonene som de seks miRNAene våre ble antatt å stamme fra. I dette målet stratifiserte vi cellene i 4 hovedklynger som tilsvarer endotelet, epitelet, lymfocyttene og APC-ene (figur 4C). I tråd med tidligere analyse av disse dataene (22), ble verken nøytrofile eller NK-cellepopulasjoner påvist i sc-RNASeg-datasettene.
miR-139-5p kontrollerer EC-aktivering og antigenpresentasjonsvei under MVIMiR-139-5p var det eneste nedregulerte miRNAet i vår studie i tilfeller med MVI/ABMR (Figur 2A) og ble funnet å stamme hovedsakelig fra glomerulær EC (Figur 4A). 61 av målgenene ble bekreftet å være oppregulert i bulk-mikroarray fra MVI pluss-tilfeller (Figur 3B), og deres uttrykk ble videre undersøkt ved enkeltcelleoppløsning i de 3 tidligere identifiserte EC-subklyngene (Figur 4B, C). Som vist i figur 5A, var det aktiverte ECclusteret bare detekterbart i MVI pluss-prøver. Dessuten ble halvparten av de 61 genene (N=30) konsekvent økt i sc-RNAseq MVI pluss biopsier, uavhengig av de tre EC-subklyngene. Blant disse var GBP5 det mest økte genet. Deretter identifiserte genontologianalyse ved bruk av disse 30 endotelavledede transkripsjonene UBE2D1 og YWHAG som sentrale aktører i gennettverket (Figur 5B). Mer spesifikt ble immunrelaterte veier og hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC)-mediert antigenbehandling og presentasjonsveier beriket (figur 5C). Pseudotidsanalyse ble utført for bedre å karakterisere genekspresjonsendringer i løpet av EC-aktivering, bane på tvers av celler (figur 5D, E), UBE2D1, YWHAG og GBP5 økte kontinuerlig under MVI-assosiert endotelaktivering. Svært like baner ble funnet for MHC-relaterte gener HLA-A,-B og -DRA, men også for bonafide endotelaktivering og betennelsesmarkører som VCAM1, CXCL9 og CXCL10, noe som tyder på at alle disse genene uttrykkes samtidig under endotelaktivering. Til sammen antyder disse resultatene at miR-139-5p reduseres under MV-lesjoner og ikke lenger undertrykker MHC-antigenpresentasjonsveien i aktivert EC.
miR-222-3p svekker beggeNyreFysiologiske og immunrelaterte veier i epitelceller under MVI Deretter fokuserte vi på miR-222-3p, et oppregulert miRNA i MVI-prøver med ennyreepitelcelleopprinnelse og en mer eksklusiv korrelasjon til ABMR-relaterte histologiske lesjoner (figur 2A, D,4A). I bulk allograftvev ble uttrykket av 43 av målgenene nedregulert (figur 3B), og videre evaluert ved en enkelt- celleoppløsning i de forskjelligenyreepitelpopulasjoner vi tidligere identifiserte (figur 4B, C). En massiv nedgang på 41 av disse 43 (95 prosent) genene på tvers av alle identifisertenyreepitelcelleklynger antyder en gendemping
profil i VMI (Figur 6A). Interessant nok er 4 gener involvert inyrefysiologiske veier (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 og KIF3B), men også immunrelaterte gener (TRAPI og PEBPI) ble identifisert som sentrale gener i nettverket (Figur 6B). Genontologi til the43-genene avslørte berikelse i ErbB-signalveier, men også i immunrelaterte veier og cytokinrespons (Figur 6C) og ERBB4-ekspresjon ble ytterligere bekreftet på tvers av allenyreceller (Figur 6D). Til sammen antyder disse resultatene at under VMI, et høyt nivå på-222-3p innyreepitelceller er assosiert med sterk undertrykkelse av gener involvert i beggenyreelektrolytthomeostasebaner og immunrelaterte veier i epitelet.
miR-150-5p Regulerer NF-kB-aktivering i T-lymfocytter under MVI På samme måte undersøkte vi den regulatoriske rollen til (økt) miR-150-5p under MVI i T-celleklyngen, der den ble mest dominerende uttrykt (Figur 4A). Vi plottet de 58 reduserte MVI-assosierte DEG-ene identifisert i bulk allograft-biopsiprøver (figur 3B), og vi konfronterte det med genuttrykk i sc-RNAseq T-celleklyngen (figur 7A). Andelen gener både målrettet av miR150-5p og spesifikt underuttrykt i T-celler under MVI var overraskende lav (15/58,25,9 prosent), noe som tyder på at den globale reduksjonen av disse genene in vivo ikke utelukkende skyldtes T-lymfocyttrom. Ikke desto mindre, fra denne høyt utvalgte listen med 15 gener og ved å bruke OMICSnet-plattformen, konstruerte vi et gennettverk (Figur 7B) og utførte genontologianalyse (Figur 7C). Vi observerte at miR-150-5p-overuttrykk var assosiert med NF -KB-regulering i T-lymfocytter under MVI.
miR-155-5p Regulerer mRNA-spleising i APC-er under MV Til slutt ble nøyaktig samme strategi brukt for 52miR-155-5p-målgenene, underuttrykt under MVI (Figur 3B). I motsetning til miR-150-5p i T-lymfocytter, observerte vi at nesten to tredjedeler av de miR-155-5p-målrettede genene ble konsekvent redusert i APC sc-RNAseq-klyngen (31/52, 59,6 prosent, figur 8A). Gennettverksanalyse viste at AIFMI og CIAO1 var sentrale gener (Figur 8B). Videre avslørte genontologi sterk berikelse i veier relatert til mRNA-spleising (figur 8C).
DISKUSJONVed sin unike design er BIOMARGIN-studien det typiske rammeverket for multiomisk dataintegrasjon. Faktisk ble svært robuste rørledninger brukt i både oppdagelses-, seleksjons- og valideringskohorter som omfattet et stort antall pasienter fra forskjellige transplantasjonssentre. I de tre uavhengige kohortene observerte og bekreftet vi samtidig den særegne uttrykksprofilen til 6 miRNA under MVI: miR-139-5p ble redusert mens miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p og miR-223-3p ble økt. Viktigere var at nivået av hver av disse 6 miRNA-ene var korrelert med MVI-alvorlighetsgrad, noe som tyder på en doseavhengig reguleringsmekanisme. Vi brukte deretter i silisiumplattformer for å undersøke hver miRNA-cellulær opprinnelse. Påfallende nok ble to distinkte grupper av miRNA-er observert: en først avledet fra infiltrerende immunceller og en andre mer spesifikk for beboernyreceller. Deretter ble både miRNA-er og mRNA-er målt i det samme oppdagelsessettet med biopsiprøver, noe som muliggjorde en integrert analyse av in vivo-validerte differensielt uttrykte mRNA-er/miRNA-er assosiert med MVI. Til slutt, etter å ha beskrevet mRNAs/miRNAs assosiasjon ved bulkvevsoppløsningen, bekreftet vi samspill mellom mRNA/miRNAs ved enkeltcelleoppløsningen for fire av de 6 identifiserte miRNAene.
Interessant nok var miR-139-5p det eneste miRNA som var negativt korrelert med MVI-lesjoner. Det stammer hovedsakelig fra EC og har blitt rapportert å regulere MHC-relaterte gener. Blant målgenene ble UBE2D1 sterkt oppregulert under endotelaktivering assosiert med MVI. UBE2D-familien er en E2 ubiquitin-konjugerende enzymfamilie i ubiquitin-proteasomsystemet (29, 30) og UBeD1 ble vist å forbedre March-I ubiquitinering, noe som fører til oppregulering av MHC klasse II-proteiner (31). I tillegg var GBP5 den mest representerte geninaktiverte EC under MVI, noe som er i tråd med våre nylige rapporter som viser at GBP5 er sterkt oppregulert i ABMR-biopsier(17), men også i blodprøver(32). Interessant nok ble GBP5-ekspresjon vist å være induserbar av type II-interferon i humane uterine mikrovaskulære endotelceller, sammen med CXCL9 og CXCL10(33). Den tidlige rollen til disse to proinflammatoriske kjemokinene i akutte avstøtningsprosesser er godt dokumentert, og nivået deres i urin er foreslått for å overvåke risikoen for akutt avstøtning ved rutinemessig overvåking av nyretransplanterte (34). Et annet miR-139-5p-mål er YWHAG.YWHAG koder for proteinfamilien til HLA-F og har blitt beskrevet som differensielt uttrykt under den aktive profibrotiske prosessen ved diabetisk nefropati (35). Den mulige rollen til miR-139-5p i fibrose, en siste vanlig vei etter betennelse, er desto mer relevant at IFTA nylig har blitt inkludert i en sammensatt poengsum for å forutsi overlevelse av nyreallograft etter ABMR(36). Til sammen antyder disse resultatene at miR-139-5p ikke lenger undertrykker MCH-antigenekspresjon på Anethum-overflaten under MVI og kan delta i kjemoatraksjon og fibroseprosesser, men disse mekanismene gjenstår å bli eksperimentelt bekreftet ekspresjon ved endoteloverflaten under MVI og kunne delta i kjemoatraksjon og fifibrose-prosesser, men disse mekanismene gjenstår å bli eksperimentelt bekreftet.
Den andrenyre-avledet miRNA vi identifiserte er miR-222- 3p, hvis uttrykk ble funnet å være mer spesifikt for MVI-lesjoner: det er assosiert med g- og PTC-skåre så vel som med C4d-avsetning, men ikke med i- eller t-lesjoner. Imidlertid stammet det hovedsakelig fra epitelceller. Etter multiomisk integrasjon ved celleoppløsning, bestemte vi at miR-222-3p hovedsakelig undertrykker ErbB-signalering som er avgjørende for grunnleggende cellulære funksjoner, som spredning, migrasjon, vekst og differensiering (37). I menneskelig biologi trengs fysiologisk ErbB-signalering fornyreelektrolytthomeostase og vedlikehold av nyreintegritet (38). Resultatene våre identifiserte også ADAM22, NRG1, ZNF91 som ErbB-signalrelaterte gener spesielt undertrykt i epitelet under MVI. Andre gener essensielle for nyrefysiologi som ATP1B1 og KIF3B ble også undertrykt i nyreepitel av miR-222-3p under MVI. Tidligere har Baker et al. viste at ATP1B1 (b1 underenhet av Na pluss /K pluss -ATPase) drivernyretubulær reabsorpsjon av natrium (39). I tillegg har Aguado-Fraile et al. har identifisert Kinesin Family Member 3B (KIF3B) som involvert i cellehandel i proksimale tubuliceller hos rotter. KIF3B fremstår som en nøkkelmediator for proksimal epitelrørcellerespons på iskemi/reperfusjon med potensiell anvendelse inyreiskemisk skadebehandling (40). Vi kan dermed spekulere i at miR-222-3p undertrykker essensielle fysiologiske veier under MVI i epitelet. Dessuten er immunrelaterte veier også regulert av miR -222-3p overekspresjon: viktige gener som TRAP1 og PEBP1 ble totalt hemmet i prøver med sterk MVI. Interessant nok ble TRAP1 vist å forbedre segnyretubulointerstitiell fifibrose hos mus med unilateral ureteral obstruksjon ved å beskyttenyretubulære epitelcelle mitokondrier (41). Videre gir PEBP1 antiinflammatoriske effekter gjennom hemming av både MAPK- og NF-kB-veier under homeostatiske/basale forhold (42). Inyreepitel, en studie av Marko et al. viste elegant at post-iskemisk NF-kB-aktivering forverrer tubulær skade og forverrer betennelse (43). I våre hender ble PEBP1 fullstendig undertrykt av miR-222-3p, noe som tyder på at NF kB-banen slippes løs under MVI. Til sammen viser disse resultatene at epitelbiologi er forstyrret under MVI ognyreepitelceller reagerer aktivt på MVI-skader, mens involvering av dette vevet i MVI sjelden behandles. Disse molekylære funnene kan kaste nytt lys over akutte tubulære skadelesjoner, et veletablert, men lenge forsømt ABMR-kriterium. Dessuten er det vist at epitelceller kan skille ut eksosomal miR-222-3p og indusere M2-fenotype i makrofager (44). I mellomtiden har Li et al. rapporterte nylig at M2-makrofager overuttrykker miR-155 og leverer dette miRNA i mikromiljøet, også gjennom utskillende eksosomer. Ved nyretransplantasjon ble miR-155 økt ved ulike tilstander (IFTA, akutt avstøtning og TCMR) og i kroppsvæske eller vev (45). Interessant nok kan miR- 155 fremme epitel-mesenkymal overgang ved å målrette RASSF4 i epitelceller (46). Denne miRNA-baserte krysstalen mellom makrofager ognyreepitelceller gjenstår å vurdere inyretransplantasjonog mer spesielt i sammenheng med MVI. I tråd med disse funnene observerte vi at miR-155-5p hovedsakelig ble uttrykt av APC-er som omfatter monocytter og makrofager. I denne spesielle undergruppen avslørte miR- 155-5p-target-gener ontologi berikelse i premRNA-spleisingsveier. Interessant nok, Janssen et al. rapporterte at lungebetennelse induserte pre-mRNA-spleisingsveier i alveolære makrofager. Dessuten skilte aktivering av pre-mRNA-spleising seg i vevsresidente makrofager sammenlignet med (blodrekrutterte) monocyttavledede makrofager. Endringer i kjernemetabolismen i rekrutterte makrofager ble rapportert, med økt effluks gjennom glykolyse og redusert effluks gjennom trikarboksylsyresyklusen (TCA-syklus, dvs. Krebs-syklus) (47). Når det gjelder miR-150-5p, fant vi at dets overuttrykk under MVI var assosiert med NF-kB-banen i lymfocyttklyngen som omfattet både medfødte NKT-celler og adaptive T-celler. Interessant nok er miR-150-5p avgjørende for å generere modne og funksjonelle NK-celler (48), og miR-150-5p-mangelfulle CD8 pluss T-celler ble rapportert å være mindre cytotoksiske (49). Dessuten kan CD8 T-celler også skille ut miR-150-5p i eksosomer (50) som igjen kan fremme fibroblastaktivering i tubulære epitelceller og påfølgendenyrefifibrose som foreslått av nyere rapporter (51, 52).
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKSJONEN
Vår studie har noen begrensninger. Vi fokuserte forskningen vår på 6 miRNA, konsekvent identifisert på tvers av vårt flertrinnsdesign. Imidlertid fortsatte vi med et trinn-for-trinn-utvelgelse av miRNA, med bare en brøkdel av alle kjente miRNA-er kvantifisert i valideringskohorten. Den statistiske veien for utvelgelse av miRNA var avhengig av BIOMARGINs opprinnelige design, egnet til å identifisere diagnostiske biomarkører for flere endepunkter (ABMR, men også TCMR og IFTA). Derfor, selv om det var betydelig økt i oppdagelses- og seleksjonskohortene (figur 2A), ble ikke miR-146a kvantifisert i valideringskohorten. Derved ble miR-146a de facto ekskludert fra seleksjonsprosessen vår, selv om litteraturen antyder en rolle i iskemi/reperfusjon ved nyretransplantasjon (53) og i Treg-mediert kontroll av alloimmune responser (54). Dessuten kan vi ikke utelukke at en kraftigere prøvestørrelse ville gitt flere miRNA-er, slik som miR-138 (ned) og miR-511 (opp) som ble differensielt uttrykt i ABMR-tilfeller av seleksjonskohorten og viste en trend i samme retning i funnkohorten. Dessuten utførte vi ikke sc-RNAseq-analyse på våre egne biopsiprøver, men brukte et online tilgjengelig sc-RNAseq-datasett. På tidspunktet for studiedesign og innsamling av biopsiprøver var scRNAseq-teknologien faktisk ikke tilgjengelig ennå, og behovet for nyinnsamlede prøver tillot ikke retrospektiv bruk av frosne eller parafininnstøpte prøver. Tilsvarende ble mRNA-profilering gjort ved hjelp av mikroarrays, den referanseteknologien på den tiden som nå har blitt bedre enn neste generasjons RNA-seq. Bruken av et online tilgjengelig sc-RNAseq-datasett begrenser vår evne til å rapportere de grunnleggende demografiske egenskapene til pasientene. Denne manglende informasjonen kan vekke bekymring angående representativiteten til befolkningsgrupper. Dessuten kontrollerte vi ikke noe teknisk aspekt ved sekvenseringen. Ved den valgte oppløsningen oppdaget ikke vår sc-RNAseq-analyse noen nøytrofile eller NK-celleklynge i disse prøvene. Derfor var nedstrømsanalysene våre av miR-142-3p og miR-223-3p begrenset til å bygge deres respektive målgennettverk og ontologi (tilleggsfigur S2) og tillot ingen enkeltcelleoppløsningsutforskning. Imidlertid avslørte gennettverket og ontologien til de 27 målgenene til miR -223-3p berikelse av TCA-syklus (tilleggsfigur S2) sammen med ERBB-signalering. Vi kan dermed spekulere i at både miR-155-5p i monocytter og miR-223-3p i nøytrofiler spiller en rolle i metabolismen og den inflammatoriske responsen engasjert av disse cellene under MVI. Dessuten har miR-142-3p allerede vist seg å være økt i nyreallograftavstøtning (9, 55, 56), men hadde så langt ikke vært spesifikt assosiert med ABMR. En annen begrensning ved vår studie er at spesifikke genuttrykksendringer i de sjeldne infiltrerende cellene kan maskeres i bulk-genekspresjonsanalyse. Ytterligere studier inkludert flere prøver er derfor nødvendig for å tillate riktig undersøkelse av alle, selv sjeldne cellesubtyper, men er for tiden begrenset av de relativt høye kostnadene ved teknikken.
Avslutningsvis undersøkte vi her de molekylære veiene assosiert med MVI, den viktigste histologiske skaden relatert til ABMR. Den integrerte omics-tilnærmingen som ble brukt gjorde det mulig for oss å avdekke nye veier involvert i MVI og antyder at tubulære epitelmetabolismemodifikasjoner oppstår som en konsekvens av ABMR, utover det nærliggende endotelrommet. Vår studie illustrerer det store potensialet til multi-omics for å avdekke sykdomsmekanismer og baner vei for nye undersøkelser for ytterligere å belyse krysstalen mellomnyreresidente og allograft-infiltrerende celleundersett.
