Chaperone-mediert autofagi ved nevrodegenerative sykdommer og akutte nevrologiske fornærmelser i sentralnervesystemet del 2

4. Eksperimentelle forskningsverktøy for å analysere CMA-aktivitet

I denne delen beskriver vi de eksperimentelle forskningsverktøyene som er tilgjengelige for å analysere CMA-aktivitet in vitro og in vivo. Metodene som vanligvis brukes for å skaffe informasjon er korrelert med CMA-aktivitet samt CMA-funksjonelle analyser.

CMA (Certified Management Accountant) er en profesjonell sertifisering for regnskapsførere, som tar sikte på å sertifisere personer som har tilstrekkelige operasjonelle ferdigheter og fagkunnskaper innen ledelsesregnskap. Minne, en menneskelig hjerneevne, refererer til evnen til å huske informasjon, kunnskap eller erfaring.

Det er et visst forhold mellom CMA og minne. For det første krever CMA-eksamenen at kandidatene husker et stort antall kunnskapspoeng og konsepter, og krever samtidig at kandidatene mestrer ferdighetene til å anvende disse kunnskapspoengene. Derfor vil utmerket hukommelse spille en svært viktig rolle for å oppnå gode resultater i CMA-eksamenen.

For det andre kan hukommelsen forbedres gjennom læring og praksis, noe som også hjelper å studere til CMA-eksamen. For eksempel, ved å gjentatte ganger gjennomgå kunnskapspoeng, lære og memorere informasjon på forskjellige måter, og bruke hukommelsesteknikker, kan du forbedre hukommelsen og hjelpe kandidatene bedre å mestre kunnskapspoengene og ferdighetene som kreves for CMA-eksamenen.

Til slutt, å studere CMA er ikke bare en eksamen, men også en forbedring av faglig kvalitet. I karriereutvikling, hvis du ønsker å utøve din profesjonelle evne bedre, trenger du naturligvis en viss hukommelsesevne for å hjelpe deg selv bedre å fullføre arbeidsoppgavene dine.

Kort sagt er det et nært forhold mellom CMA og hukommelse. Å prøve å forbedre hukommelsen din vil ikke bare hjelpe deg med å få gode karakterer, men også hjelpe deg med å fullføre arbeidsoppgavene dine bedre og realisere dine personlige verdier og karriereprestasjoner etter hvert som karrieren din utvikler seg. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen vår, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig fordi den har antioksidant-, anti-inflammatoriske og antialdringseffekter, som kan bidra til å redusere oksidasjon og betennelse i hjernen, og dermed beskytte helsen til hjernen. nervesystemet. I tillegg kan Cistanche deserticola også fremme vekst og reparasjon av nerveceller, og dermed forbedre tilkoblingen og funksjonen til det nevrale nettverket. Disse effektene kan bidra til å forbedre hukommelsen, læreevnen og tenkehastigheten, og kan også forhindre forekomsten av kognitiv dysfunksjon og nevrodegenerative sykdommer.

Klikk Know for å øke minnekraften

4.1. Nyttige analyser for overvåking av CMA-aktivitet

Evaluering av endringer i mengden av de viktigste molekylære komponentene i CMA kan brukes som en indirekte måte å vurdere CMA-aktivitet på [46]. I tillegg kan antallet og distribusjonen av CMA-aktive lysosomer analyseres for å utlede endringer i CMA-aktivitet [46].

Imidlertid gir disse analysene bare dataene som er korrelert med CMA-status. Derfor bør disse analysene suppleres med funksjonelle analyser [47]. Immunblotting og bildediagnostikk for å evaluere endringer i de viktigste CMA-komponentene er de mest brukte metodene for å vurdere CMA-aktivitet.

Siden lysosomnivåene til LAMP2A er begrenset for CMA [48], korrelerer endringer i forekomsten av LAMP2A-proteinet i lysosomer vanligvis med aktiviteten til CMA. Derfor, i bildevurderinger, bør tilstedeværelsen av LAMP2A ved den lysosomale membranen analyseres [47].

Immunoblotting for LAMP2A ved bruk av lysosomanrikede fraksjoner eller i det minste en membranøscellefraksjon er mer informativ enn ved bruk av totale helcellelysater [46]. Nivåer av lysosomal-hsc70 er også relatert til CMA-aktivitet [49].

Imidlertid er hsc70 en av de mest tallrike cellulære chaperonene, og fraksjonen lokalisert i lysosomer er en liten mengde. Derfor er immunoblotting for hsc70 i totale cellulære lysater ikke informativ for CMA [46]. Kolokalisering av hsc70 med lysosomale markører (f.eks. LAMP1) kan brukes til å oppdage CMA-aktive lysosomer [49].

Antallet av disse lysosomene som er kolokalisert medhsc70 i forhold til hele lysosompoolen øker når CMA aktiveres [12]. I tillegg kan en elektronmikroskopisk analyse ved bruk av immunogoldfarging for hsc70 også gi informasjon om poolen av CMA-aktive lysosomer [49].

I analyser som bruker isolerte lysosomer fra celler eller vev, kan økte nivåer av velkjente CMA-substrater (f.eks. GAPDH) indikere en redusert aktivitet av CMA [46].

Generelt brytes CMA-substrater raskt ned etter translokasjon [6]. En sammenligning av de lysosomale nivåene av CMA-substrater i celler eller dyr mellom modeller behandlet eller ubehandlet med inhibitorer av lysosomale proteaser (dvs. leupeptin) gjør det mulig å måle fluksen i CMA-verdier [24].

4.2. Funksjonelle analyser

Flere funksjonelle analyser muliggjør sporing av CMA-aktivitet over tid i celler, vev og isolerte organeller.

4.2.1. Intracellulær proteinnedbrytningsvurdering

Omtrent 30 % av totale cytosoliske proteiner kan brytes ned av CMA [9]. Imidlertid varierer den faktiske brøkdelen av det cytosoliske proteinet som brytes ned av CMA avhengig av celletype og cellulære forhold [6].

Derfor er måling av bassenget av cellulære proteiner som gjennomgår nedbrytning gjennom CMA en vanlig metode for å bestemme den totale aktiviteten til CMA-banen [46].

Puls- og jageeksperimenter ved bruk av en radiomerket aminosyre og hemmere av enten lysosomale proteaser eller andre autofagiske veier kan brukes til å skille proteiner som gjennomgår CMA-nedbrytning fra de som administreres av andre veier [50].

4.2.2. Photoconvertible CMA Reporters

I tillegg vil en metode for å overvåke den lysosomale assosiasjonen til kunstige fluorescerende CMA-reportere også være nyttig for å spore substratlevering og nedbrytning gjennom CMA [51].

Ved å bruke fotokonverterbare fluorescerende reportere [51], er det mulig å spore assosiasjonen til det fotokonverterte proteinet med lysosomer i en annen fluorescenskanal. En økning i antall fluorescerende puncta per celle ville være en god indikator på CMA-aktivering [46].

4.2.3. In vitro-analyser av CMA ved bruk av isolerte lysosomer

Krysssamtalen mellom forskjellige autofagiske veier gjør det vanskelig å nøyaktig vurdere CMA-aktivitet i intakte celler [41]. Derfor må vi separat analysere alle funksjonelle trinn involvert i den dynamiske nedbrytningsprosessen til CMA-veier [46,49].

Den mest pålitelige tilnærmingen for å analysere CMA-aktivitet er oppnådd ved in vitro-rekonstituering av CMA med isolerte lysosomer [52]. Isolering av den spesifikke fraksjonen av lysosomer som er aktive i CMA tillater en analyse av innholdet av endogene CMA-substrater i CMA-avdelingene [47].

Isolerte lysosomer tillater også rekonstituering av CMA in vitro for å følge trinnene involvert i CMA-prosess-substratbinding, lysosomalt opptak og lysosomal nedbrytning [50].

Behandling med lysosomale proteasehemmere etterfulgt av inkubasjon med CMA-substratet vil tillate måling av substratbundet og translokert til lysosomer (binding og opptak) [39].

Ved å diskontere mengden substrat bundet til lysosomesin som proteolyse ikke er forhindret, vil det da være mulig å beregne opptaket [39,53].

De isolerte lysosomale fraksjonene tillater også direkte sammenligning av endringer i innholdet, post-translasjonell modifikasjon og organisering av CMA-komponenter ved den lysosomale membranen. Reduksjoner i lysosomale LAMP2A- eller lys-hsc70-nivåer i isolerte lysosomer indikerer redusert CMA-aktivitet [54,55], mens økninger i LAMP2A-nivåer tyder på oppregulering av CMA-aktivitet [56].

I tillegg kan forholdet mellom lysosomal LAMP2A satt sammen til et multimert kompleks på et gitt tidspunkt bestemmes ved bruk av blånativ elektroforese av isolerte lysosomer og immunoblot for LAMP-2A [57].

5. Nevrodegenerative sykdommer og CMA

Nevroner er postmitotiske celler og krever effektive proteinnedbrytningsmaskineri for å opprettholde cellulær homeostase under stressforhold [58,59]. Forringelse av proteinnedbrytningsprosessen i CNS forårsaker aggregering av avvikende eller skadede proteiner, som er et tydelig trekk ved mange nevrodegenerative sykdommer.

Betydelig bevis har blitt samlet på at dysfunksjon av CMA er assosiert med forskjellige patologier i forskjellige nevrodegenerative sykdommer som påvirker CNS [1,14].

I disse sykdommene har forskjellige patogene proteiner blitt identifisert som substratene til CMA, slik som -synuklein i PD [60], Tauprotein i AD [61], huntingtin (Htt) i HD [62,63] og TDP{{5} } i ALS og FTLD [64,65].

5.1. Parkinsons sykdom

PD er en av de vanligste nevrodegenerative lidelsene. De viktigste patologiske egenskapene til PD er det gradvise tapet av dopaminerge nevroner i substantia nigra og aggregering av protein-synuklein i Lewy-legemer.

Tallrike studier har vist at svekkelse av CMA er relatert til hovedpatogenesen av PD [4,66]. Hos pasienter med PD er nivået av LAMP2A-protein redusert i hjernen, noe som indikerer at CMA-aktiviteten er svekket [67,68].

Mange tidligere studier har antydet at hemming av CMA-nedbrytningsveien forårsaker akkumulering av -synuklein, som er assosiert med gradvis tap av dopaminerge nevroner [8].

Viktigere er at mutantformene A53T og A30P av -synuklein identifisert i familiær PD ikke kan degraderes av CMA. Videre binder disse mutantformene seg tett til LAMP2A ved den lysosomale membranen og hemmer følgelig den normale nedbrytningen av andre CMA-substrater in vitro [60,69]. G2019S-mutasjon i leucinrikt repeterende kinase 2-protein (LRRK2) kan være en patologisk årsak til familiær PD [70].

G2019S-mutanten hemmer den dynamiske sammenstillingen av CMA-translokasjonskomplekset ved den lysosomale membranen, noe som forårsaker dysfunksjonen til CMA i amusemodellen av PD og hjernen til mutante LRRK2 PD-pasienter [25]. I tillegg binder de patogene mutante former av LRRK2 til cytosolisk Hsc70 og interagerer unormalt med CMA-komponenter, og blokkerer nedbrytningen av andre CMA-substrater og neuronal proteinhomeostase in vitro [25,71].

Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) interagerer fysisk med LAMP-2A,Hsc70 og Hsp90 og er involvert i reguleringsmekanismen til CMA-banen [72]. I en tidligere studie ble I93M-mutantformen av UCH-L1 ble identifisert i en enkelt PD-familie [73].

Det har også blitt rapportert at I93M-mutasjonen i UCH-L1 unormalt forbedret interaksjon med den cytosoliske regionen til LAMP2A, og hemmet CMA-veien in vitro [74]. Videre induserte uttrykket av I93M-mutantformen av UCH-L1 pattedyrceller den CMA-hemmingsassosierte økningen i mengden synuklein [74].

Disse funnene tyder på at avvikende interaksjon av I93M-mutantformen av UCH-L1 med CMA-maskineri kan ligge til grunn for patogenesen av PD assosiert med aggregeringen av -synuklein. Parkinsons sykdom protein 7 (PARK7), også kjent som DJ-1, er en multifunksjonelt protein involvert i en rekke cellulære aktiviteter, inkludert oksidasjonsmotstand [75].

PARK7/DJ-1har en viktig rolle i å opprettholde mitokondriell homeostase [75]. Det er rapportert at en mutasjon i DJ-1-genet medierer autosomal recessiv og tidlige former for PD [76]. DJ-1-mangel akselererte nedbrytningen av LAMP2A i lysosomer, noe som førte til aggregering av -synuklein [77 ].

I motsetning til dette var DJ-1 i stand til å hemme akkumuleringen av -synuklein ved å regulere CMA [78]. Samlet sett anses ulike molekylære mekanismer som forårsaker dysfunksjon av CMA å ligge til grunn for patogenesen til PD.

Imidlertid forblir de patologiske mekanismene assosiert med CMA stort sett uklare. Ytterligere forskning vil være nødvendig for å avklare forholdet mellom CMA-prosessen og de faktiske patologiene til PD.

5.2. Alzheimers sykdom

AD er den vanligste nevrodegenerative sykdommen hos eldre. Hovedpatogenesen til AD er amyloid-plakkdannelse og Tau-aggregering forårsaket av svekkelse av proteinhomeostase. Flere proteiner relatert til AD har blitt identifisert som CMA-substrater. CMA-nedbrytningen av disse proteinsubstratene ble vist å være svekket hos pasienter med AD [45,61,79].

Den progressive akkumuleringen av amyloid-oligomerer er en sentraltoksisk hendelse i AD [80,81]. En fersk studie viste at merking av amyloid-oligomerer med flere KFERQ-motiver fremmet deres inntreden i endosomer og lysosomer, og beskyttet menneskelige primære dyrkede kortikale nevroner mot nevrotoksisitet [82]. Amyloid forløperprotein (APP) er et viktig patogent molekyl i AD fordi det kan behandles for å produsere amyloid- [83].

APP inneholder et KFERQ-lignende motiv ved Cterminus. Dette motivet er viktig for normal prosessering og nedbrytning av APP for å forhindre akkumulering av APP-C-terminale fragmenter [84]. En fersk studie viste at APP er et CMA-substrat som binder seg til Hsc70 [85].

Hemming av CMA-nedbrytning av APP øker cytotoksisiteten. Videre reduserte aktivering av CMA av Hsc70 overekspresjonor Metformin de akkumulerte hjerneamyloidplakknivåene og reverserte de molekylære og atferdsmessige AD-fenotyper i en musemodell av AD [85]. Tau er et cytosolisk protein som normalt stabiliserer mikrotubuli i nevronceller.

Tauprotein har CMA-målrettede motiver og kan brytes ned av CMA-veien [79]. Aggregering av mutante Tau-proteiner som resulterer i Tau-hyperfosforylering og dannelse av nevrofibrillære floker er et kjennetegn på AD og relaterte tauopatier [86,87].

I tillegg kan de mutante Tau-proteiner interagere unormalt med LAMP2A og hemme translokasjon til lysosomlumen, og svekke CMA-aktivitet [79]. Regulatoren av calcineurin 1 (RCAN1) er et substrat for CMA [45] og er forhøyet hos pasienter med AD [88].

RCAN1 er en hemmer av kalsineurinavhengig defosforylering av Tau-proteiner. Viktigere er at CMA-aktivitet kan hemmes ved å øke nivået av RCAN1, og dermed svekke nedbrytningen av andre substrater av CMA [45].

5.3. Huntingtons sykdom

HD er en sen-degenerativ lidelse preget av ukontrollerte bevegelser, demens og følelsesmessige forstyrrelser. HD er en dominerende arvelig sykdom forårsaket av akkumulering og aggregering av mutant Htt-protein i striatale og kortikale nevroner.

Htt inneholder en unormalt utvidet N-terminal polyglutamin (polyQ)-kanal [62,63,89]. Dysfunksjon av Htt-nedbrytning foreslås som hovedpatogenesen til HD.

Tidligere studier har vist at CMA er involvert i nedbrytningen av mutant Htt i cellulære og musemodeller av HD [62]. Htt har et antatt KFERQ-motiv og samhandler med nøkkelkomponentene til CMA, Hsc70 og LAMP2A. I tillegg viser mutant Htt med en utvidelse av polyQ-kanalen et svekket opptak av CMA in vitro [89].

Ikke bare CMA, men makroautofagi er involvert i nedbrytningen av Htt [90]. Htt kan binde seg til både LAMP2A og det makroautofagi-relaterte proteinet Atg7 i nedbrytningsprosessen [89,91,92].

CMA-aktivitet er angivelig oppregulert i cellulære og dyremodeller av HD i den innledende fasen av sykdommen. Aktiviteten til CMA avtar imidlertid i det sene stadiet av sykdommen [91]. Disse funnene tyder på at den tidlige økningen i CMA-aktivitet kan være en kompenserende regulering som svar på ineffektiviteten til makroautofagi. Nedgangen i nivået av lysosomal LAMP2A indikerer at det er et tap av CMA-funksjon i den sene fasen av HD [91].

5.4. Amyotrofisk lateral sklerose og frontotemporal lobar degenerasjon

ALS og FTLD er nevrodegenerative sykdommer med mange lignende kliniske og patologiske trekk [93]. Transaktiveringsrespons DNA-bindende protein 43 kDa (TDP-43) er et ribonukleært protein som regulerer mange aspekter av RNA-metabolisme.

Akkumuleringen av TDP-43 C-terminale fragmenter i nevronceller oppdages ofte hos pasienter med ALS og FTLD [65]. Derfor er TDP-43-akkumulering ansett som et kjennetegn ved disse sykdommene.

TDP-43-protein inneholder et KFERQ-lignende motiv som binder til Hsc70 og kan brytes ned av CMA-prosessen [94,95]. Hsc70-ekspresjon ble rapportert redusert i lymfomonocytter hos sporadiske ALS-pasienter og bidro til TDP-43-akkumulering [64].

En mutasjon i det KFERQ-lignende motivet i TDP-43 kan forstyrre dens nedbrytning via CMA, indusere akkumulering av TDP-43 og hemming av CMA i dyrkede celler [94]. CMA kan bidra til å kontrollere omsetningen av de fysiologiske og patologiske formene av TDP-43 [94].

For more information:1950477648nn@gmail.com