Abstrakt

Foreliggende oppfinnelse beskriver enCistanche-ekstrakt for å forbedre beinmineraltetthet (BMD). I utdraget ertotalt innhold av echinacosid og acteosid (verbascoside)er>25 vekt%. Ekstraktet tilberedes ved å utføreutvinning av destillert vannavråpulver avCistanche tubulosa, etterfulgt avfiltrering, sentrifugeringav filtratet,konsentrasjon, væske-væske ekstraksjon, konsentrasjon med fjerning av urenheter, fortynning, etterbehandling, og derettersluttkonsentrasjon og tørkingfor å få Cistanche-ekstraktet.

 

 

Cistanche-ekstraktprosess

I Cistanche-ekstraktet for forbedring av beinmineraltetthet i henhold til oppfinnelsen, ertotalt innhold av echinacosid og acteosider25–30 vekt%(unntatt 25 vekt%), og ekstraktet er også rikt påshikiminsyresamtkomponenter av typen fenylpropionsyreogkomponenter av alkaloidtypen, slik at den kanstabilt utøve en bentetthetsforbedrende effekt.

 

Krav

1. Forberedelsesmetode

Fremgangsmåte for fremstilling av et Cistanche-ekstrakt for å forbedre beinmineraltetthet, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn:

knusendeCistanche tubulosaå få råpulver avCistanche tubulosa;

tilsetning av destillert vann til råpulveret avCistanche tubulosafor ekstraksjon, filtrering, sentrifugering av filtratet og konsentrering for å oppnå en konsentrert løsning avCistanche tubulosa;

ekstrahering av den konsentrerte løsningen avCistanche tubulosakonsentrere den nedre ekstraksjonsfasen for å fjerne urenheter, og fortynning for å oppnå en lasteløsning;

etterbehandling av lasteløsningen, etterfulgt av konsentrering og tørking for å oppnå Cistanche-ekstraktet.

2. Forholdet mellom materiale og vann

Fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at masse-til-volum-forholdet til råpulveret avCistanche tubulosatil destillert vann er1 : (15–25).

3. Ekstraksjonstemperatur

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonstemperaturen for destillert vann er60–100 grader.

4. Forhold under væske-væskeekstraksjon

Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori under ekstraksjon av den konsentrerte løsningen, volumforholdet til den konsentrerte løsningen avCistanche tubulosatil ekstraksjonsløsningsmiddel er1 : (1–5).

5. Ekstraksjonsløsningsmiddel

Fremgangsmåten ifølge krav 4, hvori ekstraksjonsløsningsmidlet omfatter minst én avpetroleumseter, etylacetat, n-heksan eller cykloheksan.

6. Etterbehandlingsprosess

Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori etterbehandlingen av lasteløsningen omfatter: å føre lasteløsningen gjennom enmakroporøs harpiks, og elueres deretter sekvensielt meddestillert vannog enetanolløsning.

7. Elueringsvolumer

Fremgangsmåten ifølge krav 6, hvori volumforholdet mellom destillert vann og den makroporøse harpiksen er(5–10) : 1, og volumforholdet mellom etanolløsningen og den makroporøse harpiksen er(3–9) : 1.

8. Utdraget

8. Cistanche-ekstrakt for forbedring av beinmineraltetthet, karakterisert ved at det er fremstilt i henhold til hvilket som helst av kravene 1-7.

9. Aktiv markørinnhold

Cistanche-ekstraktet ifølge krav 8, hvori det totale innholdet av echinacosid og acteosid er25–30 vekt%, unntatt 25 vekt%.

10. Søknad

10. Anvendelse av Cistanche-ekstraktet ifølge hvilket som helst av kravene 8-9 ved fremstilling av et produkt for forbedring av beinmineraltetthet, hvori konsentrasjonen av Cistanche-ekstraktet i produktet er12,5–25 ug/ml.

 

Teknisk felt

Foreliggende oppfinnelse vedrører områdetmedisinske formuleringer, og gjelder spesifikt enCistanche-ekstrakt for å forbedre beinmineraltettheten, sintilberedningsmetode, ogapplikasjoner.

Bakgrunn

[0002] Cistanche refererer til den tørkede kjøttfulle stilken med skjellblader fra Orobanchaceae-planteneCistanche deserticola YC MaellerCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche har flere aktiviteter som f.eksimmunregulering, anti-inflammatorisk, mot tretthet, antioksidant, nevrobeskyttende, ogstøtte for reproduktive system.

Fenyletanoidglykosider (PhGs)-medechinacosideogakteosid (verbascoside)å være de viktigste doktorgradsstudentene i Cistanche - er viktige bestanddeler.Echinacosidehar vist seg å ha effekt påforbedre beinmineraltettheten. Imidlertid fant vi at den bentetthetsforbedrende effekten av Cistanche-ekstrakter erikke bare korrelert med echinacoside innhold. Bare kontrollerer echinacoside-innholdikke kan sikreat utdraget vilstabiltutøve en bentetthetsforbedrende effekt. Derfor er det avgjørende å utvikle et Cistanche-ekstrakt og en tilberedningsmetode som kanstabiltgi ønsket bentetthetsstøttende effekt.

[0003] Kinesisk oppfinnelse patentsøknadCN102441040Abeskriver en fremstillingsmetode for totale fenyletanoidglykosider fra Cistanche via pulverisering, ekstraksjon, makroporøs harpiksadsorpsjon, eluering, konsentrasjon, etc. Under svakt sure forhold (pH 2–4) er stabiliteten til Cistanche fenyletanoidglykosider betydelig forbedret, og den resulterende andelen av total ekinaglykoside i en kombinasjon av > 90 %. Den bekrefter imidlertid ikke om produktet kanstabiltforbedre beinmineraltettheten.

Kinesisk oppfinnelse patentsøknadCN105111255Abeskriver en fremgangsmåte for ekstraksjon og separasjon av echinacosid og acteosid fra Cistanche, ved bruk av 75 % etanol som ekstraksjonsløsningsmiddel, AB-8 makroporøs harpiks som pakkemateriale og 55 % etanoleluering, som gir et Cistanche-ekstrakt med echinacosid > 25 %, akteosid > 8 %, og totalt phGs > 8 %. Det kan imidlertid fortsatt ikke garantere enstabilbentetthetsforbedrende effekt.

 

Sammendrag av oppfinnelsen

[0004] Å utvikle en Cistanche-ekstrakt og fremstillingsmetode som kanstabiltstøtter forbedret beinmineraltetthet, gir oppfinnelsen:

Første aspekt: ​​Forberedelsesmetode

Fremgangsmåte for fremstilling av et Cistanche-ekstrakt for forbedring av beinmineraltetthet, omfattende:

knusendeCistanche tubulosafor å oppnå råpulver;

ekstrahering av råpulveret med destillert vann, filtrering, sentrifugering og konsentrering for å oppnå en konsentrert løsning;

utføre utvinning; konsentrere den nedre fasen for å fjerne urenheter; fortynning for å oppnå en lasteløsning;

etterbehandle påfyllingsløsningen, konsentrere og tørke for å oppnå Cistanche-ekstraktet.

[0005] I en utførelsesform føres råpulveret gjennom en40 meshsil.

[0006] I en utførelsesform er masse-til-volum-forholdet mellom råpulver og destillert vann1 : (15–25).

[0007] I en utførelsesform er masse-til-volum-forholdet1 : 20.

[0008] I en utførelsesform er ekstraksjonstemperaturen60–100 grader.

[0009] I en utførelsesform er ekstraksjonstemperaturen80 grader.

[0010] I en utførelsesform utføres ekstraksjon1–2 ganger, 1 time hver gang.

[0011] I en utførelsesform utføres filtrering gjennom en80 meshfilter.

[0012] I en utførelsesform er sentrifugeringshastigheten3000–4000 r/minog tiden er3–9 min.

[0013] I en utførelsesform er sentrifugeringshastigheten3500 r/minog tiden er5 min.

I en utførelsesform, etter sentrifugering, konsentreres filtratet ved70 gradertil18%–28%av det opprinnelige volumet.

[0015] I en utførelsesform, under ekstraksjon av den konsentrerte løsningen, er volumforholdet mellom konsentrert løsning og ekstraksjonsløsningsmiddel1 : (1–5).

[0016] I en utførelsesform er forholdet1 : 3.

[0017] I én utførelse omfatter ekstraksjonsløsningsmidlet minst én avpetroleumseter, etylacetat, n-heksan eller cykloheksan.

[0018] I en utførelsesform utføres ekstraksjon sekvensielt ved å brukepetroleumseteretterfulgt avetylacetat.

[0019] I en utførelse betyr "konsentrasjon med fjerning av urenheter" å konsentrere den nedre ekstraksjonsfasen til en pasta, oppløse den i300 ml 50 vekt% vandig etanolfor å fjerne urenheter, og tilpasse seg1,0–1,5 g rå urt per mlsom lasteløsning.

[0020] I en utførelsesform er konsentrasjonen av lasteløsningen1,0–1,5 g rå urt/ml vann.

[0021] I en utførelsesform omfatter etterbehandling å føre lastingsløsningen gjennommakroporøs harpiks, og elueres deretter sekvensielt meddestillert vannog enetanolløsning.

[0022] I en utførelsesform er belastningsstrømningshastigheten gjennom den makroporøse harpiksen1–5 ml/min.

[0023] I en utførelsesform er harpiksenAB-8 makroporøs harpiksmed et harpiksvolum på0.93 L.

[0024] I en utførelsesform er volumforholdet mellom destillert vann og harpiks(5–10) : 1, og volumforholdet mellom etanolløsning og harpiks er(3–9) : 1.

[0025] I en utførelsesform er volumforholdet mellom destillert vann og harpiks7 : 1, og forholdet mellom etanolløsning og harpiks er6 : 1.

[0026] I en utførelsesform er etanolløsningen80 % (vekt/vekt) vandig etanol.

Andre aspekt: ​​Utdraget

[0027] Oppfinnelsen tilveiebringer videre et Cistanche-ekstrakt fremstilt ved metoden ovenfor.

[0028] I en utførelsesform er det totale innholdet av echinakosid og akteosid25–30 vekt%, unntatt 25 vekt%.

Tredje aspekt: ​​Bruk

[0029] Oppfinnelsen tilveiebringer videre bruk av Cistanche-ekstraktet ved fremstilling av produkter for forbedring av beinmineraltetthet, hvor ekstraktkonsentrasjonen i produktet er12,5–25 ug/ml.

 

Fordeler / gunstige effekter

[0030] Sammenlignet med kjent teknikk har oppfinnelsen følgende fordelaktige effekter:

Cistanche-ekstraktet inneholder25–30 vekt%totalt echinakosid og acteosid, og er rik påshikiminsyre, komponenter av typen fenylpropionsyre, alkaloider, ogfettsyrer, slik at den kanstabiltstøtte forbedring av beinmineraltetthet.

Innenfor12,5–25 ug/mlkonsentrasjonsområde, fremmer ekstraktet spredning avMC3T3-E1celler med utmerket spredningseffekt.

Ekstraktet viser den samme doserelaterte trenden for å fremme celleproliferasjon ogALP aktivitet, og kan stabilt fremme spredning og differensiering. Ved å fremme osteoblastmineralisering viser den en bedre effekt enn den positive kontrollen17 -østradiol.

Ekstraktet stimulerer osteoblastspesifikke transkripsjonsfaktorerRunx2ogOsx, forbedrer osteoblastdifferensiering og fremmer ekspresjon av osteogene markørerOPNogOCN, og fremmer dermed beindannelse. Det øker ogsåBmp2 mRNAuttrykk for å forbedre osteoblastdifferensiering og ny beindannelse ved å aktivereBMP/Smad-vei; videre ved å regulereLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, ogWnt3 mRNA, aktiveres denWnt/ -catenin signalering, påvirker nedstrøms transkripsjonsfaktoruttrykk, og fremmer osteoblastdifferensiering og bendannelse.

Fremstillingsmetoden gir et ekstrakt som inneholder fenyletanoidglykosider (echinakosid og akteosid), shikiminsyre og fenylpropionsyrer, alkaloider og fettsyrer. Disse komponentene sammen tillater ekstraktet å vise konsekvent doseavhengighet i spredning, differensiering og mineralisering, noe som muliggjør stabile bentetthetsstøttende effekter.

 

Kort beskrivelse av tegningene

[0035] Fig. 1: Effekt av ekstrakt (eksempel 1) på MC3T3-E1 celleproliferasjon
Fig. 2: Effekt av ekstrakt (eksempel 2) på MC3T3-E1 celleproliferasjon
Fig. 3: Effekt av ekstrakt (eksempel 3) på MC3T3-E1 celleproliferasjon
Fig. 4: Effekt av ekstrakt (eksempel 1) på ALP-aktivitet
Fig. 5: Effekt av ekstrakt (eksempel 2) på ALP-aktivitet
Fig. 6: Effekt av ekstrakt (eksempel 3) på ALP-aktivitet
Fig. 7: Bilder av Alizarin Red-farging av osteoblastmineralisering (eksempel 2)
Fig. 8: Kvantitative resultater av osteoblastmineralisering (eksempel 2)
Fig. 9–12: Effekter av eksempel 2 på Runx2, Osx, Opn, Ocn mRNA-uttrykk
Fig. 13: Effekt av eksempel 2 på Bmp2 mRNA-ekspresjon (BMP/Smad)
Fig. 14–16: Effekter av eksempel 2 på Lrp5, Wnt3, Lrp6 mRNA-ekspresjon (Wnt/ -catenin)
Fig. 17–18: Effekter av eksempel 2 på Osx- og RUNX2-proteinekspresjon

 

Detaljert beskrivelse / utførelsesformer

Eksempel 1

[0036] En fremstillingsmetode omfatter:

knusendeCistanche tubulosa, passerer gjennom en 40 mesh sikt for å oppnå200 gråpulver;

trekke ut meddestillert vann ved 5× masse(som beskrevet), trekker ut kl75 gradertil2 ganger, 1 time hver, konsentrerer seg kl70 gradertil et konsentrasjonsforhold på1 : 2.2for å oppnå en konsentrert løsning;

tilsetning av absolutt etanol til den konsentrerte løsningen for gradert etanolutfelling med endelige etanolmassekonsentrasjoner på20%, 40%, 60%, 80%, med nedbør kl5 grader i 24 timer, samle supernatanten etter80 vekt%etanolutfelling;

konsentrere og tørke kl70 graderfor å oppnå Cistanche-ekstraktet, med et utbytte på20.75%.

Eksempel 2

[0037] En fremstillingsmetode omfatter:

knusendeCistanche tubulosaå få240 gråpulver;

ekstrahering med destillert vann, filtrering, sentrifugering og konsentrering for å oppnå en konsentrert løsning;

ekstrahering av den konsentrerte løsningen; konsentrere den nedre fasen for å fjerne urenheter; fortynning for å oppnå en lasteløsning;

etterbehandling av lasteløsningen; konsentrere og tørke kl70 graderfor å oppnå ekstraktet, med et utbytte på19.69%.

[0038] Råpulveret passerer gjennom en 40 mesh sikt.
[0039] Masse-til-volum-forholdet mellom råpulver og destillert vann er1 : 20.
[0040] Ekstraksjonstemperatur er80 grader.
[0041] Ekstraksjon utføres1–2 ganger, 1 time hver.
[0042] Filtrering er gjennom en80 meshfilter.
[0043] Sentrifugering er3500 r/min i 5 min.
[0044] Konsentrasjon etter sentrifugering: konsentrer kl70 gradertil20%av det opprinnelige volumet.
[0045] Under ekstraksjon er volumforholdet mellom konsentrert løsning og løsningsmiddel1 : 3.
[0046] Ekstraksjon utføres sekvensielt medpetroleumseterogetylacetat.
[0047] Den nedre fasen konsentreres til en pasta og oppløses i300 ml 50 vekt% vandig etanolfor å fjerne urenheter.
[0048] Konsentrasjon av lasteløsning:1,0 g rå urt/ml vann.
[0049] Etterbehandling: pass gjennom makroporøs harpiks, eluer med destillert vann og deretter etanolløsning.
[0050] Strømningshastighet gjennom harpiks:3 ml/min.
[0051] Harpiks:AB-8, harpiksvolum0.93 L.
[0052] Volumforhold mellom destillert vann og harpiks:7 : 1. Etanol-løsning-til-harpiks-forhold:6 : 1.
[0053] Etanolløsning:80% (w/w)vandig etanol.

 

Klikk for å vite mer om cistanche-fabrikken

Eksempel 3

[0053] En fremstillingsmetode omfatter:

knusendeCistanche tubulosa, passerer gjennom en 40 mesh sikt for å oppnå120 gråpulver;

trekke ut med12× masseav50 vekt% vandig etanol, trekker ut kl70 grader, 2 ganger, 1 time hver, konsentrerer seg kl70 gradertil et forhold på1 : 2.5for å oppnå en konsentrert løsning;

tilsett vann for å justere konsentrasjonen til0,2 g rå urt/ml vann, sentrifugering kl3500 r/min i 5 mintar supernatanten som fylleløsningen;

passerer gjennom makroporøs harpiks; sekvensiell eluering med destillert vann og etanolløsning; oppsamling av etanolelueringen og konsentrering/tørking kl70 graderfor å oppnå ekstraktet med et utbytte på24.30%.

[0054] Harpiks:HPD750, harpiksvolum0.93 L.
[0055] Forholdet mellom destillert vann og harpiks:3 : 1. Etanol-løsning-til-harpiks-forhold:4 : 1.
[0056] Etanolløsning:30% (w/w)vandig etanol.

 

Ytelsestesting

1.1 Celleproliferasjonsanalyse

[0057] Osteoblaster er de viktigste funksjonelle cellene som er ansvarlige for bendannelse, som involverer spredning av pre-osteoblaster, produksjon av benmatrise og endelig differensiering. DeMC3T3-E1cellelinje brukes ofte til å studere osteogen aktivitet. Osteoblastdifferensiering involverer proliferasjon, differensiering og mineralisering, manifestert som økt pre-osteoblastantall, modning til osteoblaster og dannelse av ny benmatrise.

Alkalisk fosfatase (ALP)er et osteoblast-fenotype-relatert protein som kan påvises under celleproliferasjon og matrisemodning og er en ofte brukt tidlig markør for osteoblastdifferensiering.

Derfor, ved å evaluere MC3T3-E1-proliferasjon og ALP-aktivitet, ble den osteogenese-fremmende aktiviteten til ekstraktene fremstilt i eksempel 1–3 sammenlignet.

MC3T3-E1-celler ble gjenopplivet og passert. Etter stabilisering ble cellene fordøyd, sentrifugert og samlet. Celletettheten ble justert slik at hver 100 μL inneholdt 5×1035 x 10^35×103 celler og ble sådd inn i en 96-brønners plate. Etter kultur over natten ble mediet erstattet med komplett medium som inneholdt ekstrakter fra eksempel 1-3 i konsentrasjoner på6,25, 12,5, 25 og 50 ug/ml, eller inneholder0,1 M østradiol(positiv kontroll), eller medium alene (blindkontroll), og dyrket for48 h. Under lysbeskyttede forhold ble MTT-stamløsning (10%–20% av brønnvolumet) tilsatt, inkubert for4 hi en CO₂-inkubator, medium fjernet, og200 μL DMSOtilsatt for å løse opp formazan. OD-verdier ble målt til490 nm.

Resultater: Fig. 1 (eksempel 1), fig. 2 (eksempel 2), fig. 3 (eksempel 3).

[0058] Celleproliferasjonshastighet (%)=OD(Eksempel 1–3)−OD(Blank)OD(Blank)×100%\\frac{OD(\\tekst{Eksempel 1–3}) - OD(\\tekst{Blank})}{OD(\\tekst{Blank})} \\ ganger 100)\\%OD(Blanke 1–3)−OD(Blank)​×100 %

[0059] Som vist i fig . 1-3, fremmet den positive kontrollen MC3T3-E1-spredning. Eksempel 1 fremmet spredning ved 6,25, 12,5 og 25 ug/ml; proliferasjonshastigheten ved 12,5 ug/ml var 1,4 x den for den positive kontrollen, men uten signifikant forskjell (P > 0,05). Eksempel 2 fremmet spredning ved 6,25, 12,5, 25 og 50 ug/ml; ved 12,5, 25 og 50 ug/ml var effektene overlegne den positive kontrollen (P < 0,01 eller P < 0,001), med spredningshastigheter 2,55x, 3,46x og 2,59x for den positive kontrollen. Eksempel 3 fremmet spredning ved 6,25, 12,5, 25 og 50 ug/ml; ved 12,5, 25 og 50 ug/mL var den overlegen den positive kontrollen (P < 0,01 eller P < 0,001), med spredningshastigheter på 1,40×, 1,76× og 0,93× for den positive kontrollen. Dette indikerer at eksempel 2 hadde den beste effekten på å fremme MC3T3-E1-proliferasjon.

1.2 ALP-aktivitetsanalyse

[0060] ALP-aktivitet ble målt ved bruk av et ALP-analysesett. Stamkonsentrasjonen av p-nitrofenol var 10 mM, og standardkurvekonsentrasjonene var 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 og 0,25 mM, fremstilt ved gradientfortynning med deteksjonsbuffer.

For hver prøvebrønn i en 96-brønners plate ble det tilsatt 49 μL deteksjonsbuffer, 1 μL protein ekstrahert fra de behandlede MC3T3-E1-cellene (fra avsnitt 1.1), og 50 μL kromogent substrat (tilsatt sist). Reaksjonen fortsatte i 30 minutter i inkubatoren beskyttet mot lys, avsluttet ved å tilsette 100 μL stoppløsning, og absorbansen målt kl.405 nm. ALP-aktivitet ble beregnet fra standardkurven.

Resultater: Fig. 4 (eksempel 1), fig. 5 (eksempel 2), fig. 6 (eksempel 3).

[0061] ALP-aktivitet (U/L)=(relativ molar konsentrasjon av protein) × 1000 × 100 / 30
(1000 for molar enhetskonvertering; 100 for totalt reaksjonsvolum; 30 for 30 min reaksjonstid)

ALP er en tidlig markør for MC3T3-E1-differensiering. Fig. 4–6 viser at den positive kontrollen økte ALP-aktiviteten. Eksempel 1 fremmet ikke ALP-aktivitet. Eksempel 2 økte ALP-aktivitet ved 12,5, 25 og 50 ug/ml; ved 25 og 50 ug/ml var forskjellene vs. blanke signifikante (P < 0,01). Eksempel 3 økte ALP-aktivitet ved 12,5 og 25 ug/ml (P < 0,001), men med økende konsentrasjon avtok forsterkningen. Dette indikerer at bare eksempel 2 og 3 økte ALP-aktivitet og støttet differensiering.

[0062] Totalt sett viste bare eksempel 2 dose-positiv korrelasjon i både MC3T3-E1-proliferasjon og ALP-aktivitet ved 12,5 og 25 ug/ml. Eksempel 3 viste dose-positiv korrelasjon for proliferasjon, men dose-negativ korrelasjon for ALP. Til sammenligning er eksempel 2 mer egnet for å forbedre beinmineraltetthet.

1.3 Mineralisering (Alizarin rødfarging) av eksempel 2

[0063] Siden eksempel 2 viste den beste aktiviteten og dosekorrelasjonen sammenlignet med eksempel 1 og 3, ble mineraliseringsforsøk utført for ytterligere å evaluere effekten.

[0064] MC3T3-E1-celler ble behandlet etter 72 timers kultur med eksempel 2-ekstrakt kl.12,5, 25 og 50 ug/ml, inkubert ved 37 grader for14 days(basert på kalsiumknuterdannelse), med medium endringer hver 2. dag. Alizarin Red-farging ble utført: medium fjernet, celler fiksert med 10 % nøytralt formalin (300 μL/brønn) i 30 minutter, skylt, farget med 0,1 % Alizarin Red (300 μL/brønn) i 30 minutter (romtemperatur, beskyttet mot lys), og vasket til ingen rød farge var igjen. Det ble tatt bilder. Deretter ble 10 % cetylpyridiniumkloridløsning (400 μL/brønn) tilsatt og ristet i 1 time for å løse opp forkalkede knuter. Den oppløste løsningen ble overført til en 96-brønns plate (100 μL/brønn) og OD målt kl.562 nmå beregne mineraliseringshastighet. Bilder: Fig. 7; kvantitative resultater: Fig. 8.

[0065] Mineraliseringshastighet (%)=OD(Eksempel 2)−OD(Blank)OD(Blank)×100%\\frac{OD(\\tekst{Eksempel 2}) - OD(\\tekst{Blank})}{OD(\\tekst{Blank})} \\ ganger 100\\%OD(Blank) OD(Eksempel(Blank)

[0066] Fig . 7 viser at antall kalsiumknuter økte sekvensielt med konsentrasjon vs. blank. Fig . 8 indikerer at eksempel 2 fremmet mineralisering på en konsentrasjonsavhengig måte ved 12,5, 25 og 50 ug/mL, med den sterkeste effekten ved 50 ug/mL, signifikant bedre enn den positive kontrollen (P < 0,001). Fordi mineraliserte knuter representerer det siste stadiet av osteoblastdifferensiering, bekrefter disse resultatene ytterligere den bentetthetsstøttende effekten av eksempel 2 og viser dens stabile aktivitet. Eksempel 2 var bedre enn østradiol, noe som indikerer potensiell verdi for benhelseprodukter.

Genekspresjon og banemekanisme (eksempel 2)

[0067] Eksempel 2-ekstrakt (12,5, 25, 50 ug/ml) ble påført MC3T3-E1-celler i 3 dager. RNA-ekstraksjon, kvantifisering, revers transkripsjon (20 μL system; 800 ng RNA-inngang) og qRT-PCR ble utført for å kvantifisere relative ekspresjonsnivåer avRunx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA og Ocn mRNA. Resultater: Fig. 9–12.

[0068] Runx2 og Osx er sentrale nedstrømsregulatorer i BMP-signalering, som induserer osteoblastdifferensiering. Runx2 er viktig i det tidlige forpliktelsesstadiet, mens Osx fungerer i terminaldifferensiering. OPN og OCN er viktige indikatorer for osteoblastaktivitet og vevsmineralisering. Fig. 9–12 viser at eksempel 2 økte det relative uttrykket av disse markørene, og støttet forbedret osteoblastdifferensiering og bendannelse.

[0069] Eksempel 2 oppregulertBmp2 mRNA(Fig. 13), som indikerer aktivering avBMP/Smad-vei, som støtter osteoblastdifferensiering og ny beindannelse.

[0071] Eksempel 2 økte relative uttrykk forLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA og Wnt3 mRNA(Fig. 14–16), som støtter aktivering avWnt/ -catenin signalering, som er nært knyttet til osteoblastproliferasjon, differensiering og bendannelse.

Proteinuttrykk (eksempel 2)

[0073] Western blot-analyse viste at eksempel 2 økteOsxogRUNX2proteinekspresjon (fig. 17–18), som indikerer regulering på både transkripsjons- og translasjonsnivå for å fremme osteoblastdifferensiering.

[0075] Disse aktivitetstestene viser at eksempel 2 ga den beste spredningsfremmende effekten og var det eneste med konsistent dosekorrelasjon for både spredning og ALP. Eksempel 2 var også overlegen østradiol når det gjaldt å fremme MC3T3-E1-proliferasjon og mineralisering, med sammenlignbare differensieringseffekter, noe som antyder optimalt bentetthetsstøttende potensial.

 

Kjemisk sammensetningstesting

6.1 Innhold av fenyletanoidglykosider

[0076] Med referanse til "Cistanche"-analysemetoden i den kinesiske farmakopéen, ble echinakosid- og acteosidinnhold i eksemplene 1-3 målt (resultatene vist i tabell 1). Basert på echinakosid, akteosid og totalt PhG var trenden konsistent: Eksempel 3 > Eksempel 1 > Eksempel 2, og akteosid i eksempel 3 var henholdsvis 3,85× og 4,27× av eksempel 1 og 2. Kombinasjon av aktivitets- og innholdsresultater indikerer at echinakosid og akteosid alene ikke direkte bestemmer de osteogene effektene.

 

Tabell 1. Innhold av Echinacosid og Acteosid i Cistanche-ekstrakter (%)

Eksempel (eksempel)	Echinacoside (%)	Acteosid / Verbascoside (%)	Totalt (%)
Eksempel 1	28.68	1.63	30.31
Eksempel 2	26.27	1.47	27.74
Eksempel 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Andre komponenter (UPLC/Q-TOF/MS)

[0078] UPLC/Q-TOF/MS ble brukt for å sammenligne kjemiske komponenter blant eksemplene 1–3. Responsverdiene er vist i tabell 2.

I tillegg til echinacosid og acteosid, inneholdt eksempel 2 ytterligerekomponenter av typen shikiminsyre og fenylpropionsyre, og ogsåalkaloider. Sammenlignet med eksempel 1 og 3 hadde eksempel 2 11 fenylpropionsyre/shikiminsyre-relaterte komponenter med de høyeste responsene, inkludert:

Tabell 2. UPLC/Q-TOF/MS-responsverdier for nøkkelkomponenter i Cistanche-ekstrakter (eksempel 1–3)

注:原表为"响应值(responsverdi)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内刄为2绾Shikiminsyre og fenylpropionsyrederivater(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloider(生物碱).

A. Shikiminsyre og fenylpropionsyrederivater

Sammensatt	Eksempel 1	Eksempel 2	Eksempel 3
Isodanfenolsyre B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
p-hydroksyfenylpropionsyre (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Shikiminsyre (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksy-2-(3,4-dihydroksyfenyl)etoksy]karbonyl-2-(3,4-dihydroksyfenyl)-7-hydroksy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oksy-3-(3,4-dihydroksyfenyl)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Benzoylaceton (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinoresinol 4′-O- -D-glukosid (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshan glykosid* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
3,4-dimetylbenzosyre (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroksy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroksytetrahydropyran-2-yl]oksymetyl]tetrahydropyran-2-yl]oksykromen-2-on	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkaloider

Sammensatt	Eksempel 1	Eksempel 2	Eksempel 3
Verticine (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihydrokoptisin (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Tymin (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemin (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

isodanfenolsyre B,

p-hydroksyfenylpropionsyre,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksy-2-(3,4-dihydroksyfenyl)etoksy]karbonyl-2-(3,4-dihydroksyfenyl)-7-hydroksy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oksy-3-(3,4-dihydroksyfenyl)

benzoylaceton,

epipinoresinol 4'-O- -D-glukosid,

myricetin-relatert glykosid (som oppført),

jonoside A1,

3,4-dimetylbenzosyre,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroksy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroksytetrahydropyran-2-yl]oksymetyl]tetrahydropyran-2-yl]oksykromen-2-on.

Den inneholdt også 5 alkaloider, inkludert:

verticine,

dihydrokoptisin (som oppført),

tymin,

gesemin-relatert alkaloid (som oppført),

yohimbine.

[0080] Basert på sammenlignende resultater av proliferasjon/ALP-aktivitet, fenyletanoidglykosidanalyser og kjemisk profilering, kan det konkluderes med at fenyletanoidglykosider (echinakosid og akteosid), shikimic/fenylpropionsyrer, alkaloider og terpenoid-ekstrakter sammen utgjør den spesifikke sammensetningen av avhengighetsekstraktet, (12,5–25 ug/mL) på tvers av spredning, differensiering og mineralisering, noe som muliggjør stabile bentetthetsstøttende effekter.

[0081] Tabell 2: responsverdier for komponenter.
[0082] Oppfinnelsen, gjennom fremgangsmåten i eksempel 2, tilveiebringer et Cistanche-ekstrakt med totalt echinakosid + akteosid > 25 % og anrikede shikimic/fenylpropionsyrer og alkaloider, som tillater stabile bentetthetsstøttende effekter. Innenfor 12,5–25 ug/mL fremmer den MC3T3-E1-proliferasjon, differensiering og mineralisering på en doseforsterkende måte med konsistent dosekorrelasjon, som støtter bedre og mer stabile beinhelseresultater og muliggjør bruk i produkter relatert til forbedring av beinmineraltetthet.