Cistanche Glycoside oppregulerer Bmi1 og fremmer spredning av musespermatogoniale stamceller gjennom Akt-signalveien

Objektiv: For å undersøke den fremmende effekten og relaterte mekanismer til Cistanche-glykosider på spredning av musespermatogoniale stamceller. Metode: MTT-analyse og EdU-celleproliferasjonsanalyse ble brukt for å oppdage effekten av Cistanche-glykosid på spredningsevnen til musespermatogoniale stamceller; Western blot-metoden ble brukt til å påvise ekspresjonen av Bmi1-, p-Akt- og Akt-proteiner med cistanche-glykosid; RT-PCR-eksperimentet oppdaget ekspresjonsresultatene til beslektede gener, og demonstrerte til slutt det oppstrøms og nedstrøms regulatoriske forholdet mellom p-Akt- og Bmi1-proteiner gjennom inhibitorer og siRNA. Resultat: Sammenlignet med kontrollgruppen, 0.5-1 µM Cistanche-glykosid fremmet spredningen av musespermatogoniale stamceller (P<0.05); Compared with the control group, the expression levels of p-Akt and Bmi1 proteins in the 0.5-1 µ M Cistanche glycoside treated group increased (P<0.05); Akt inhibitors downregulated the levels of p-Akt and Bmi proteins (P<0.05); SiBmi1 had no significant effect on Akt mRNA levels (P>0.05). Konklusjon: Cistanche-glykosid aktiverer Akt-signalveien og oppregulerer Bmi1-ekspresjon, og fremmer spredningen av musespermatogoniale stamceller.

Nøkkelord: Cistanche glykosid; Mus spermatogoniale stamceller; Bmi1 ; celleproliferasjon

Infertilitet har blitt et globalt problem som hindrer utviklingen av det menneskelige samfunn [1-2]. I følge epidemiologisk statistikk lider omtrent 15 prosent -20 prosent av par over hele verden av infertilitetssykdommer, med mannlig dysfunksjon som forårsaker mer enn 50 prosent av infertilitetssymptomer [3]. Derfor har det å finne effektive behandlingsmetoder for mannlig infertilitet blitt et hett forskningstema innen reproduktiv helse både nasjonalt og internasjonalt.

Cistanche mannlige fordeler-Tonifying nyre

Klikk her for å se produkter fra Cistanche for nyresykdom

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Polycomb-proteinhemmende kompleks 1 (PRC1) sammensatt av B-cellespesifikk Moroni-musleukemivirus-integrasjonssted 1 (Bmi1) kan forhindre for tidlig aldring og opprettholde selvfornyelsesevnen til stamceller [4]. Proteinkinase B (Akt) er involvert i celleproliferasjon og differensiering [5], og aktivert Akt er involvert i ulike viktige biologiske aktiviteter [6-7].

Cistanche-glykosid I (C27H30O11, molekylvekt: 530,52) er et hydrolysat av Cistanche-glykosid isolert fra tradisjonell kinesisk medisin Cistanche-glykosid, som har forskjellige farmakologiske og biologiske aktiviteter [8-9]. Ifølge rapporter kan Cistanche-glykosid ha en viss terapeutisk effekt på osteoporose [10]. Imidlertid er virkningen av Cistanche glykosid I på mannlig reproduksjonsfunksjon ennå ikke klar. Spermatogene stamceller (SSCs) er den mest primitive sædgruppen med evne til å fornye seg selv og differensiere, og spiller en uerstattelig rolle i å opprettholde mannlig reproduktiv funksjon. Derfor brukte denne studien muse-SSC-er som en in vitro-modell for å utforske effekten av Cistanche-glykosid på spredningsevnen til mus-SSC-er og deres virkningsmekanisme.

Desert ginseng-tonifiserende nyre

1 Materiale og metoder

1.1 Cellekultur

I denne studien ble spermatogoniale stamceller fra mus (C18-4) brukt. Cellene kom fra professor He Zupings forskningsgruppe og ble separert, renset og identifisert i henhold til spesifikasjonene. De musespermatogoniale stamcellene ble tilsatt 10 prosent føtalt bovint serum (Gibco) og 1 prosent penicillin/streptomycin i DMEM/F12 (Gibco), og dyrket i medium (37 grader, 5 prosent CO2)

1.2 MTT-eksperiment

Inokuler C18-4 med en mengde på 5000 celler per brønn i en 96-brønnplate for å sikre jevn celleinokulering. Etter celleadhesjon, velg nødvendige legemidler og medikamentkonsentrasjoner for behandling. Etter 72 timers medikamentavhengighet ble 50 µL tilberedt tiazolblått (MTT) tilsatt til brønnen hvor cellene ble inokulert, og 96-brønners platene ble plassert i en celleinkubator i 4-5 timer. Etter inkubering, kast kulturløsningen fra 96-brønns platene, tilsett 150 µL dimetylsulfoksid (DMSO) til hver brønn, og mål til slutt absorbansen ved å bruke en enzymkoblet immunosorbentanalyse (Biotek) ved en bølgelengde på 490 nm.

Cistanche pulver-Tonifying nyre

1.3 EdU celleproliferasjon

Inokuler celler jevnt på en {{0}}brønnplate (6,0 × 103/brønn), etter at cellene har festet seg til veggen, tilsett medikamenter i 24 timer i henhold til de eksperimentelle behovene, og bruk deretter 100 μ LDMEM/ F12 inneholder 20 µL EdU som erstatning for det originale kulturmediet, og spredningspotensialet til celler testes deretter i henhold til instruksjonene for EdU-testsettet.

1.4 Western blot

Den forhåndslagrede celleproteinprøven ble delt med SDS PAGE-gel og deretter overført til PVDF-membranen etter elektroforese. Den ble forseglet med 5 prosent skummet melk i 1 time. Det ble kombinert med spesifikt primært antistoff ved 4 grader over natten: kanin anti-mus p-Akt antistoff (1 ∶ 2000) (CST), Akt antistoff (1 ∶ 1000) (CST), GAPDH (1 ∶ 5000) (Abcam), Bmi1 (1 ∶ 5000) (Abcam). På den andre dagen, bind med sekundært kaninantistoff ved romtemperatur i 1 time. De tilsvarende proteinene ble påvist ved bruk av Chemiluminescence Liquid (ECL)-settet (Bio-Rad), og til slutt ble antigen-antistoff-reaksjonen observert ved bruk av ChemiDoc-systemet (Bio-Rad).

1,5 RT-PCR

Reagenset som brukes i den totale RNA-ekstraksjonsprosessen er TRIzol-reagens (Invitrogen), og cDNA er oppnådd i henhold til instruksjonene til første streng cDNA revers transkripsjonssett (Vazyme). RT PCR ble utført ved bruk av TaqMan-genekspresjon Master Mix (Bio-Rad) i henhold til instruksjonene, ved bruk av ΔΔ Ct-metoden beregner endringen i relative multipler av mRNA-ekspresjon, med en verdi på 2 − ΔΔ Ct. Primersekvenstabell i (tabell 1)

1.6 siRNA-transfeksjon

siRNA av Bmi 1 mRNA ble kjøpt fra Ribobio og sekvenslisten er i tabell 2. Transfeksjonsreagenset Lipofectamine 6000 (Invitrogen) ble brukt. Celler (2,0 × 105/brønn) ble dyrket over natten i DMEM/F 12 supplert med 10 prosent føtalt bovint serum på en 6-brønnplate. I henhold til produsentens retningslinjer ble Lipofectamine 6000 grundig blandet med henholdsvis kontroll siRNA og Bmi1 siRNA og transfektert i 5 timer i et kulturmedium uten føtalt bovint serum. Etter vasking med PBS ble det opprinnelige kulturmediet erstattet med 10 prosent føtalt bovint serum DMEM/F12. Etter 24 timer ble celler samlet for å oppdage ekspresjonsendringene til forskjellige tilsvarende proteiner og gener.

Tabell 1 RT PCR-amplifiserte primersekvenser

Tabell 2 siRNA Bmi1-sekvens

1.7 Statistisk analyse

Alle data ble analysert med SPSS 16.0 og GraphPad Prism 8-programvare. Basert på forskjellene i gjennomsnittsverdier mellom to eller flere grupper, ble Student t-test og enveis ANOVA-test valgt for sammenligning. En forskjell på P<0.05 was considered statistically significant.

2 resultater

2.1 Effekter av Cistanche-glykosider på spermatogoniale stamceller

For å finne ut om Epimedium glykosid I har en proliferativ effekt på musespermatogoniale stamceller, fant vi gjennom MTT-eksperimenter at Cistanche-glykosid I kan fremme spredningen av musespermatogoniale stamceller ved konsentrasjoner på {{0}}.5 og 1 uM (figur 1A). For å ytterligere verifisere den proliferative effekten av Cistanche-glykosid I på musespermatogoniale stamceller, bekreftet vi ytterligere gjennom EdU-celleproliferasjonseksperimenter at Cistanche-glykosid I også kan fremme spredningen av musespermatogoniale stamceller ved konsentrasjoner på 0,5 og 1 µM (Figur 1B).

Ørken levende cistanche-Tonifying nyre

2.2 Cistanche-glykosid oppregulerer uttrykket av Bmi1

Tidligere laboratoriestudier har vist at Bmi1 er sterkt uttrykt i testikkelvev sammenlignet med andre organvev, og kommer hovedsakelig til uttrykk i kjernen til musespermatogoniale stamceller. Nyere studier har vist at Bmi1 har stor betydning for å opprettholde spredningen av spermatogoniale stamceller [12]. Derfor spekulerer vi i at Cistanche glykosid I har en regulatorisk effekt på Bmi1, og fremmer dermed spredningen av musespermatogoniale stamceller. Western blot-resultater viste at Cistanche-glykosid I signifikant oppregulerte uttrykket av Bmi1-protein (figur 2).

2.3 Cistanche-glykosid aktiverer Akt-signalveien

Ifølge rapporter er fosforylert Akt nært knyttet til celleproliferasjon og differensiering [13]. Derfor undersøkte vi effekten av icariin I på Akt-fosforylering. Vi fant at Cistanche-glykosider signifikant oppregulerte Akt-fosforyleringsuttrykk ved konsentrasjoner på 0.5 og 1 µM (figur 3).

2.4 Hemming av Akt nedregulering av Bmi1

I følge tidligere forskningsrapporter [14] valgte vi en Akt-hemmer (MK-2206) i en konsentrasjon på 10 (µM) og fant at hemming av p-Akt signifikant hemmet Bmi1. Dette resultatet indikerer at Bmi1-uttrykk er regulert av Akt (figur 4)

Figur 1: Effekt av Cistanche-glykosid I på spermatogoniale stamceller fra mus

A. MTT-analyse ble brukt for å påvise effekten av Cistanche glykosid I-behandling i 3 dager på levedyktigheten til spermatogoniale stamceller fra mus; B. EdU-celleproliferasjonseksperiment ble brukt til å påvise spredning av musespermatogoniale stamceller etter 3 dagers behandling med Cistanche-glykosider, samt det statistiske analyseskjemaet; *P<0.05, * * P<0.01 compared to the control group, n=3.

Figur 2: Effekt av Cistanche-glykosid I på Bmi1-protein

Western blot-analyse ble brukt for å oppdage effekten av Cistanche deserticola glykosid I-behandling på ekspresjonen av Bmi1 i musespermatogoniale stamceller etter 24 timer, og det statistiske kartet ble også presentert* P<0.05, compared to the control group, n=3.

Figur 3: Effekt av Cistanche-glykosid I på Akt-signalveien

Western blot-analyse ble brukt for å påvise ekspresjonen av Akt og Akt-fosforylering i musespermatogoniale stamceller etter 24 timers behandling med Cistanche Cistanche glykosid I, og det statistiske kartet ble også presentert** P<0.01, compared to the control group, n=3.

Figur 4: Effekten av Akt-hemmer på Bmi1. Western blot-eksperiment ble brukt til å oppdage ekspresjonen av fosforylert Akt og Bmi1 i musespermatogoniale stamceller etter 24 timers Akt-hemmerbehandling, og det statistiske diagrammet ble presentert* P<0.05 * * P<0.01, compared to the control group, n=3.

2.5 Stilling av Bmi1 påvirker ikke Akt uttrykk

For ytterligere å validere oppstrøms-nedstrøms forholdet mellom Bmi1 og Akt, dempet vi Bmi1 og observerte endringer i celle Akt-uttrykk. For det første ble siRNA-er av forskjellige sekvenser av Bmi1 transfektert inn i museceller for å utforske transfeksjonseffektiviteten deres. RT PCR-eksperimentresultatene viste at siBmi1-1, siBmi1-2 og siBmi1-3 alle reduserte uttrykket av Bmi1 signifikant, med siBmi1-2 og siBmi1-3 ha bedre effekter (Figur 5A). Western blot bekreftet videre at både siBmi1-2 og siBmi1-3 kan redusere Bmi1-proteinnivåene betydelig (figur 5B), så vi valgte siBmi1-2 og siBmi1-3 for påfølgende forskning. Interessant nok viste RT-PCR at demping av Bmi1 ikke påvirket Akt-uttrykk (figur 5C). Resultatene ovenfor indikerer at Akt ligger oppstrøms for Bmi1.

Figur 5: Virkningen av å dempe Bmi1 på Akt

A. RT-PCR-analyse av effektene av tre lyddempende sekvenser på ekspresjonen av Bmi1-genet; B. Western blot-eksperiment ble brukt til å oppdage effekten av tre forskjellige siRNA-sekvenser på Bmi1-proteindemping sammenlignet med siCtrl, og statistisk analyse ble utført; C. RT-PCR-analyse av effekten av å dempe Bmi1 på Akt-genet** P<0.01, * * * P<0.001 compared to the control group, n=3.

3 Diskusjon

Infertilitet hindrer alvorlig bærekraftig utvikling av det menneskelige samfunn, med mannlig infertilitet som står for 50 prosent av infertilitetspasientene. Med den kontinuerlige utviklingen av medisinsk teknologi har det kliniske behandlingsnivået for mannlig infertilitet blitt betydelig forbedret. Eksisterende kirurgiske behandlingsmetoder, som assistert reproduksjonsteknologi, har imidlertid ulemper som høye kostnader og lav suksessrate og har et lite utvalg av begunstigede. De er egnet for pasienter som har fullstendig azoospermi under uthenting av mikrospermier i testikkel, har klare genetiske sykdommer og er uvillige til å motta behandling av ulike årsaker [16]. Derfor har det blitt gjort en innsats både nasjonalt og internasjonalt for å utvikle tryggere og mer pålitelige behandlingsmetoder for mannlig infertilitet, og medikamentell behandling har blitt et forskningshotspot innen mannlig infertilitet [17]. Eksisterende klinisk praksis har vist at tradisjonell kinesisk medisin i Kina har god effekt og sikkerhet ved behandling av mannlig infertilitet [18].

Cistanche deserticola effekt-Tonifying nyre

Cistanche glykosid er et hett tema i behandlingen av mannlig infertilitet i tradisjonell kinesisk medisin de siste årene. Dens hovedkomponent, Cistanche-glykosid, har forskjellige farmakologiske aktiviteter, inkludert forbedring av immunfunksjonen [19], forbedring av mannlig reproduksjonsfunksjon [20], antioksidanter [21] og anti-osteoporose [22]. For ytterligere å klargjøre virkningsmekanismen til Cistanche-glykosid etter at det kommer inn i menneskekroppen, valgte denne studien Cistanche-glykosid, et hydrolysat av Cistanche-glykosid, som forskningsobjekt for å utforske den spesifikke mekanismen som hydrolysatet utøver sin farmakologiske effekt. For det første fant vi at Cistanche glykosid I kan fremme spredningen av musespermatogoniale stamceller. Det er verdt å merke seg at Cistanche glykosid I ikke fremmet spredningen av musespermatogoniale stamceller på en konsentrasjonsavhengig måte, noe som indikerer at Cistanche glykosid I har et dosesikkert område. Deretter fant vi at Cistanche glykosid I signifikant oppregulerte ekspresjonsnivået til Bmi1-protein nært relatert til mannlig reproduktiv funksjon. Nylig har forskere funnet ut at fraværet av Bmi1 alvorlig kan påvirke reproduksjonsfunksjonen til hannmus, hovedsakelig manifestert i oligospermi og testikkelforstørrelse [23]. I mellomtiden bekreftet en annen studie fra forskningsgruppen vår at hemming av Bmi1 kan alvorlig påvirke spredningsevnen til spermatogoniale stamceller. Derfor spekulerer vi i at Cistanche glykosid I som fremmer spredning av musespermatogoniale stamceller kan være relatert til regulering av Bmi1-ekspresjon. Ifølge rapporter er p-Akt nært knyttet til celleproliferasjon og differensiering [14]. Derfor testet vi endringene i p-Akt protein forårsaket av Cistanche glykosid I og fant at Cistanche glykosid I også oppregulerte p-Akt. Til slutt utforsket vi oppstrøms og nedstrøms forholdet mellom Akt og Bmi1. Det er verdt å merke seg at det er forskjeller i forskningsresultatene for oppstrøms- og nedstrømsforholdet mellom Bmi1 og Akt oppnådd av forskjellige laboratorier [24-25]. Resultatene av denne studien indikerer at Akt-spesifikke hemmere nedregulerer Bmi1 mens demping av Bmi1 ikke påvirker Akt mRNA-nivåer, noe som indikerer at Akt kan være oppstrøms for Bmi1, som reguleres av Akt. I studien av effekten av å dempe Bmi1 på Akt, utforsket vi det bare på mRNA-nivå. Siden Bmi1 er en transkripsjonshemmer, spekulerer vi i at det kan være en interaksjon mellom Bmi1-proteinet og Akt-proteinet. Imidlertid er det foreløpig ingen fullstendig bevis for å bekrefte oppstrøms- og nedstrømsforholdet mellom Akt og Bmi1. Derfor vil vi supplere og forbedre dette i fremtiden.

Effekter av Cistanche-tonifiserende nyre

Oppsummert fant denne studien for første gang at Cistanche glykosid I har effekten av å fremme spredningen av spermatogoniale stamceller, og avslører en ny mekanisme for Cistanche glykosid I som fremmer spredningen av spermatogoniale stamceller på cellenivå, og beriker det teoretiske grunnlaget for bruk av Cistanche-glykosid i klinisk behandling av mannlig infertilitet.

henvisning

［1］ Dutta S, Biswas A, Sengupta P. Fedme, hormonforstyrrelser og mannlig infertilitet ［J］. Asiatiske Pac J Reprod, 2019, 8(5): 195.

［2］ Zhang F, Liu M, Gao J. Endringer i synaptonemale komplekse kodende gener og menneskelig infertilitet ［J］. Int J Biol Sci, 2022, 18(5): 1933-1943.

［3］ Serrano R, Garcia-Marin LJ, Bragado MJ. Sperm Phosphoproteome: Unraveling Male Infertility ［J］. Biology (Basel), 2022, 11(5): 659.

［4］ Yang D, Liu HQ, Yang Z, et al. BMI1 i hjertet: Nye funksjoner utover tumorigenese ［J］. EBioMedicine, 2021, 63: 103193.

［5］ Abeyrathna P, Su Y. Den kritiske rollen til Akt i kardiovaskulær funksjon ［J］. Vascul Pharmacol, 2015, 74: 38-48.

［6］ Peltier J, O'Neill A, Schaffer DV. PI3K/Akt og CREB regulerer proliferasjon og differensiering av nevrale hippocampale progenitorer for voksne ［J］. Dev Neurobiol, 2007, 67(10): 1348-1361.

［7］ Rafalski VA, Brunet A. Energimetabolisme i voksen nevrale stamcelleskjebne ［J］. Prog Neurobiol, 2011, 93: 182–203.

［8］Liu Zichen, Xu Ying, Chen Shizhong Farmakokinetikk og vevsfordeling av Cistanche glykosid I hos rotter [J] Chinese Journal of Pharmacy, 2008 (11): 848-851

［9］Zi Hui, Li Keqiang, Shang Deyang, et al Comparison of Metabolism and Tissue Distribution of Cistanche Glycoside in Monomer and Compound Compounds in Osteoporosis Model Rats [J] Chinese Journal of Experimental Prescriptions, 2015, 21 (6): {{ 4}}

［10］Zi Hui, Fan Ying, Jiang Ning, et al. Eksperimentell studie for å fremme osteogen differensiering av mesenkymale stamceller fra rottebenmarg gjennom BMP/Runx2/Osx-signalveien av Cistanche glycoside I og Cistanche glycoside II [J] Chinese Journal of Osteoporose, 2019, 25 (05): 690-695

［11］ Zhou S, Dong J, Xiong M, et al. UHRF1 interagerer med snRNA og regulerer alternativ spleising i musespermatogoniale stamceller ［J］. Stem Cell Reports, 2022, 17(8): 1859-1873.

［12］ Yu J, Shen C, Lin M, et al. BMI1 fremmer spermatogonial stamcellevedlikehold ved epigenetisk å undertrykke Wnt10b/-catenin-signalering ［J］. Int J Biol Sci, 2022, 18(7): 2807-2820.

［13］ Chen Z, Li L, Wu W, et al. Trening beskytter proliferative muskelsatellittceller mot utmattelse via Igfbp7-Akt-mTOR-aksen ［J］. Theranostics, 2020, 10(14): 6448-6466.

［14］ Ma Y, Sender S, Sekora A, et al. Den hemmende responsen på PI3K/AKT Pathway-hemmere MK-2206 og Buparlisib er relatert til genetiske forskjeller i pankreatiske duktale adenokarsinomcellelinjer ［J］. Int J Mol Sci, 2022, 23(8): 4295.

［15］ Carson SA, Kallen AN. Diagnose og behandling av infertilitet: En gjennomgang ［J］. JAMA, 2021, 326(1): 65-76.

［16］ Bosch E, De Vos M, Humaidan P. The Future of Cryopreservation in Assisted Reproductive Technologies ［J］. Front Endocrinol (Lausanne), 2020, 11:67.

［17］ Wang M, Wang Q, Du Y, et al. Vitaminer kombinert med tradisjonell kinesisk medisin for mannlig infertilitet: En systematisk gjennomgang og metaanalyse ［J］. Andrology, 2020, 8(5): 1038-1050.

［18］ Zhang Z, Yang J, Kong T, et al. Tradisjonell kinesisk medisin syndrom elementer av mannlig infertilitet avslørt av latent tremodellanalyse ［J］. J Tradit Chin Med, 2018, 38(6): 926-935.

［19］Ji Xin Forskningsfremgang på den immunmodulerende effekten av Cistanche-glykosider [J] Hebei Pharmaceutical, 2016, 38 (05): 753-756

［20］Li Kangmei, Li Mingxing, Chen Minqi, et al Forskningsfremgang på effekten av Cistanche-glykosider på reproduksjonssystemet [J] Western Traditional Chinese Medicine, 2022, 35 (04): 143-146

［21］Zhang Pan, Shi Juan, Liu Li, et al Studie om antioksidantaktiviteten til Cistanche-glykosider og deres derivater [J] China Food Additives, 2016, (02): 85-88

［22］Zhang Hao, Zheng Yuling, Ding Hui Forskningsfremgang på de relaterte banene til cistanche-glykosid i behandlingen av osteoporose [J] Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2022, 41 (04): 531-538

［23］ Dai X, Zhang Q, Yu Z, et al. Bmi1-mangelfulle mus viser mannlig infertilitet［J］. Int J Biol Sci, 2018, 14(3): 358-368.

［24］ Yang W, Wu Z, Yang K, et al. BMI1 fremmer hjertefibrose ved iskemi-indusert hjertesvikt via PTEN-PI3K/Akt-mTOR-signalveien［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2019, 316(1): H61-H69.

［25］ Su Z, Yang Z, Xu Y, et al. Apoptose, autofagi, nekroptose og kreftmetastaser［J］. Mol Cancer, 2015, 14:48.