Nettverksfarmakologi og eksperimentell validering avslører den mekanistiske rollen til Cistanche Phenylethanoid Glycosides i behandlingen av NAFLD via TNF/PI3K/Akt Pathway
Oct 29, 2025
3. Resultater
3.1 Nettverksfarmakologi
3.1.1 Aktive forbindelser og potensielle mål
Basert på tidligere forskning fra prosjektgruppen og informasjon fra databaser og litteratur, ble ti representative forbindelser med farmakologisk aktivitet valgt [10–11]:verbaskosid, isoverbaskosid, echinakosid, 2'-acetyl-verbaskosid, cistanosid A, cistanosid B, salidrosid, isocrenatosid II, cistanche glykosid A og cistanche glykosid F.
Høyinnhold Verbascoside(acteosid) Cistanche-ekstrakt for blodlipidbehandling
Cistanche-ekstrakt spesifikasjonsliste
BrukerSwissTargetPrediction44 mål ble oppnådd;NetInferspådde de 20 beste målene, og ga 45 mål;SuperPredga 118 mål. Etter å ha slått sammen og fjernet duplikater,195 unike målble identifisert.
FraGSE89632datasett, som inkluderte 39 NAFLD-prøver og 24 normale prøver,589 differensielt uttrykte generble skjermet. Kombinere data fraGeneCardsogDisGeNET, 2 315 NAFLD-relaterte sykdomsgenerble oppnådd etter deduplisering (figur 1A–1B). Ved å krysse sammensatte-relaterte mål med sykdomsmål,77 overlappende målble identifisert som potensielle terapeutiske mål for Cistanche fenyletanoidglykosider mot NAFLD (Figur 1C).
Disse målene ble importert tilSTRING database with an interaction threshold >0,400. Isolerte noder ble fjernet, og nettverket ble visualisert viaCytoscape, noe som resulterer i enPPI-nettverk med 75 noder og 408 kanter(Figur 1D). Ved å bruke funksjonen "Analyze Network" i Cytoscape, ble de 10 beste målene basert på gradsverdi identifisert som kjernemål:TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1, HIF1A, STAT1, APP, PRKACA, SMAD3.
3.1.2 GO, KEGG og DO berikelsesanalyser
GO berikelsesanalyse avdekket 93 vilkår formolekylær funksjon (MF), 38 forcellulær komponent (CC)og 989 forbiologisk prosess (BP). De 10 beste bidragene i hver kategori ble visualisert (figur 2). Resultatene indikerte at Cistanche-fenyletanoidglykosider kan ha anti-NAFLD-effekter gjennom veier relatert tilbetennelse, cytokiner, metabolisme og immunrespons.
DO berikelse identifisert833 sykdommerassosiert med målene, med de 25 beste visualisert (Figur 4), inkludertmetabolske, immune, kardiovaskulære, fedme-relaterte og leversykdommer, alle nært knyttet til NAFLD.
3.1.3 "Sammensatt–mål–bane"-nettverk
Basert på KEGG-anrikningsresultater, en"sammensatt-mål-bane" nettverkble konstruert ved hjelp avCytoscape 3.9.1. Grønne firkanter representerer aktive forbindelser, blå sirkler representerer mål, og oransje V-formede noder representerer veier (figur 5). Dette illustrerer at Cistanche fenyletanoidglykosider utøver anti-NAFLD-effekter gjennomflere forbindelser, mål og veier, medechinacoside og verbascosideer de mest tallrike og listede markørforbindelsene i 2020-utgaven avKinesisk farmakopé.
3.1.4 Molekylær dokking
De fem øverste kjernemålene i PPI-nettverket (TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1) ble koblet til de aktive forbindelsene, og deres minimumsbindingsenergier ble beregnet (figur 6). Alle dokkingscore var mindre enn–6 kcal/mol, som indikerer sterke bindingsaffiniteter.TNF viste den sterkeste affiniteten. Noen dokkingresultater ble visualisert ved hjelp avPyMOL(Figur 7).
3.2 Celleeksperimenter
3.2.1 Effekter av FFA på lipidakkumulering i HepG2-celler
Som vist iFigur 8, førte økende FFA-konsentrasjoner fra 0,5 til 2 mmol/L til en økning i røde lipiddråper, som smeltet sammen til store lipiddråper, noe som indikerer vellykket lipidbelastning.
3.2.2 Effekter av FFA og Cistanche Phenylethanoid Glycosider på cellelevedyktighet
Som vist iFigur 9A, FFA-konsentrasjoner av1 mmol/L og underhadde ingen signifikant effekt på cellelevedyktighet (P > 0,05); slik,1 mmol/Lble valgt for modellering. Som vist iFigur 9B, Cistanche fenyletanoidglykosider opp til200 μg/mlpåvirket ikke levedyktigheten signifikant (P > 0,05), men400 μg/mlsignifikant hemmet levedyktighet (P < 0,01). Derfor,25, 50 og 100 μg/mlble valgt som lave, middels og høye doser for behandling.
3.2.3 Effekter på lipidakkumulering
Som vist iFigur 10, viste modellgruppen betydelig akkumulering av røde lipiddråper sammenlignet med kontrollgruppen (P < 0,01), noe som bekrefter vellykket modellering. Behandling med50 og 100 μg/mlav Cistanche-fenyletanoidglykosider reduserte lipiddråpedannelse signifikant (P < 0,01). IFigur 11, TG og TC nivåer var forhøyet i modellgruppen (P < 0,01), mens alle behandlingsgruppene viste signifikant reduserte nivåer sammenlignet med modellgruppen (P < 0,01).
3.2.4 Effekter på mitokondriell skade
JC-1 fargestoff akkumuleres i sunne mitokondrier og avgir rød fluorescens; i skadede mitokondrier forblir den i monomer form og avgir grønn fluorescens. Som vist iFigur 12, rød fluorescens dominerte i kontrollgruppen, mens grønn fluorescens var fremtredende i modellgruppen. Behandlingsgruppene viste redusert grønn fluorescens og økt rød fluorescens, noe som indikerer forbedret mitokondriell membranpotensial.
3.2.5 Effekter på intracellulære ROS-nivåer
Som vist iFigur 13, viste modellgruppen signifikant økt fluorescensintensitet (P < 0,01), noe som indikerer forhøyet ROS. Behandling med Cistanche fenyletanoidglykosider reduserte ROS-nivåer signifikant ved alle konsentrasjoner (P < 0,01).
3.2.6 Effekter på apoptose
Hoechst 33342 farger kjerner, med apoptotiske kjerner som viser knallblå, kondensert eller fragmentert morfologi. Som sett iFigur 14, kontrollgruppen hadde minimal lys fluorescens, mens modellgruppen viste rikelig med knallblå apoptotiske kjerner. Behandlingsgruppene viste redusert fluorescensintensitet, noe som indikerer redusert apoptose.
3.2.7 Effekter på TNF/PI3K/Akt-signalvei og Bax-uttrykk
Som vist iFigur 15, sammenlignet med kontrollgruppen viste modellgruppen signifikant forhøyet uttrykk forTNF-α, PI3K p85, Akt og Baxproteiner (P < 0,05, P < 0,01). Ved behandling:
Alle Cistanche fenylethanoid glykosidgrupper viste reduserteTNF-auttrykk (P < 0,01),
De50 μg/mlgruppe viste redusertPI3K p85uttrykk (P < 0,01),
De100 μg/mlgruppe viste redusertAkt og Baxuttrykk (P < 0,05).
4. Diskusjon
NAFLD er en kompleks leversykdom assosiert med metabolske forstyrrelser, som involvererubalanse i lipidmetabolismen, insulinresistens og oksidativt stress[12]. De siste årene hartradisjonell kinesisk medisin (TCM)har vist betydelig løfte i behandling av NAFLD.
Moderne forskning har avslørt detfenyletanoidglykosider fra Cistanchekan regulere lipid- og glukosemetabolismen i leveren og hemme oksidativt stress, betennelse og fibrose [13–15]. Leveren brukerβ-oksidasjonå metabolisere fettsyrer ogCYP7A1å omdanne kolesterol til gallesyrer for lipidhomeostase [16–18]. I miljøer med høyt fettinnhold fører metabolsk ubalanse til lipidakkumulering og NAFLD [19].
Denne studien bekreftet detFFA-induserte HepG2-cellerviste økte lipiddråper og forhøyede TC- og TG-nivåer. Behandling med Cistanche fenyletanoidglykosider reduserte lipiddråperdannelse og TC/TG-nivåer betydelig, og forbedret leversteatose.
Mitokondriell dysfunksjon fører til redusert β-oksidasjon, overdreven ROS-produksjon og lipidperoksidasjon [20]. ROS skader mitokondrier ytterligere, og forverrer steatose [21]. Våre resultater viser at Cistanche phenylethanoid glykosiderredusere ROS, forbedremitokondriell membranpotensial, og lindreoksidativt stress, og dermed redusere fettansamlingen.
Nettverksfarmakologi indikerte at anti-NAFLD-effektene involverer fleremetabolske og apoptose-relaterte veier. Molekylær dokking viste sterke bindingsaffiniteter mellom aktive forbindelser og mål, spesieltTNF, som antyder dens sentrale rolle.
DeTNF-veier kritisk i cellesignalering. TNF-α binder seg tilTNFR1, aktiverer dødsreseptorveier og induserer apoptose [22]. Den aktiverer ogsåPI3K/Akt-veigjennom parakrin signalering [23–24]. Unormal PI3K/Akt-signalering er knyttet til lipidakkumulering, betennelse og fibrose i NAFLD [25]. Våre data viser at Cistanche fenyletanoidglykosiderhemme apoptoseog redusere uttrykket avTNF-a, PI3K, Akt, ogBax, i samsvar med nettverksspådommer, bekrefter viktigheten avTNF/PI3K/Akt-sti.
Konklusjon
Cistanche fenyletanoidglykosider regulerer NAFLD gjennomflere prosesser og veier, inkludert:
Reduserer lipidakkumulering,
Hemmer oksidativt stress,
lindre mitokondriell skade,
Undertrykker apoptose.
Disse effektene kan være nært knyttet tilTNF/PI3K/Akt signalvei. Denne studien gir ikke bare vitenskapelig støtte for anvendelsen av Cistanche-fenyletanoidglykosider i NAFLD-behandling, men også en referanse for utvikling og klinisk forskning av nye terapeutiske legemidler.
