Cistanche polysakkarider forbedrer Echinacoside Absorption in Vivo og påvirker tarmmikrobiotaen

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu, et al

Abstrakt

Polysakkaridene ogfenyletanoidglykosiderfraCistanche deserticolahar vist seg å ha ulike helsemessige fordeler, men den interaktive effekten mellom disse to typene forbindelser in vivo er ikke i detalj kjent. Målet med denne studien var å undersøke de synergistiske virkningene av cistanche-polysakkarider med fenyletanoidglykosid og effekten av polysakkarider på tarmmikrobiota. Sprague-Dawley-rotter ble fôret med forskjellige typer cistanche-polysakkarider i 20 dager, den siste dagen ble alle rottene administrertechinacosideved 100 mg/kg. Resultatene ble sammenlignet hovedsakelig på forskjellen i farmakokinetiske parametere, sammensetning av tarmmikrobiota og innhold av kortkjedede fettsyrer. Resultatene indikerte at alle cistanche-polysakkaridene, inkludert råpolysakkarider, høymolekylærevekt polysakkarider, og lavmolekylære polysakkarider, kan regulere tarmmikrobiotadiversiteten, øke gunstige bakterier og spesielt øke veksten av Prevotella spp. samt forbedre produksjonen av kortkjedede fettsyrer og absorpsjonen av echinakosid. Ved å utforske de synergistiske virkningene til polysakkarider med små molekyler, antyder disse funnene at cistanche polysakkarider, spesielt lavmolekylære polysakkarider, kan brukes som en tarmmikrobiotamanipulator for helsefremmende.

Nøkkelord:CistanchedeserticolapolysakkaridEchinacosideTarmmikrobiota

Klikk her for å få mer informasjon om cistanche-produkter

1. Introduksjon

De siste årene har det blitt klart at polysakkarider modulerer sammensetningen av tarmmikrobiotaen og at endringer kan mediere flere ernæringsabsorpsjoner [1], og produsere fysiologisk funksjon [2,3]. Polysakkarider fra tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har vist seg å være ideelle kandidater for regulering av tarmmikrobiota og viste prebiotiske effekter. I fordøyelsen viser polysakkaridene og noen små molekylære forbindelser uunngåelig noen effekter på biologiske aktiviteter [4]. Som en av de viktigste aktive ingrediensene i Panax ginseng, som har vært mye brukt i tusenvis av år, viste polysakkaridene seg godeforbedringitarmmetabolismeogabsorpsjonavginsenosiderin vivo [5]. Codonopsis pilosula polysaccharides viste fremmende effekt av absorpsjon av saponiner i dekstransulfat-natrium-indusert kolittmus [6]. Ganoderma lucidum polysaccharides, spesielt fraksjonen med høy molekylvekt, ble avslørt å haprebiotiskfunksjoneri høyfett diett-indusert gut dysbiose musemodeller [7]. Longan-polysakkarider regulerte tarmmikrobiotaen og tarmmetabolittene (økte innholdet av pyruvat og butanoat) for å produsere immunmodulerende aktiviteter [8].

Cistanche deserticola, som en tradisjonell kinesisk medisin, har blitt mye brukt som kosttilskudd i Kina. Farmakologiske studier viste at det viste segnevrobeskyttende, immunmodulerende, hormonellebalansering, anti-utmattelse, anti-inflammatorisk, leverbeskyttelse,anti-oksidativt, anti-bakteriell, anti-viral, oganti-svulsteffekter [9]. Kjemisk analyse viste at fenyletanoidglykosider og polysakkarider var de viktigste aktive bestanddelene. Echinakosid, det viktigste fenyletanoidglykosidet i C. deserticola, har vist omfattende farmakologiske virkninger, men dets medisinerbarhet er begrenset på grunn av dårlig biotilgjengelighet, rask og omfattende metabolisme in vivo. Studier har bekreftet at echinacosid kan metaboliseres av tarmmikrobiotaen in vitro [10,11]. Bevisene in vivo har imidlertid ikke blitt undersøkt. Som vi vet spilte tarmmikrobiotaen en viktig rolle i å formidle den metaboliserende bioaktiviteten til urtemedisiner. Derfor var hovedmålet med dette arbeidet å undersøke påvirkningen avcistanche polysakkariderpå tarmmikrobiotaen og effektene på metabolismen av echinakosid.

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer og kjemikalier

Cistanche deserticola YC Ma ble hentet fra Alashan, Indre Mongolia Mandela sandindustriutvikling Co., LTD, Kina. De ble autentisert av professor Lijuan Zhang (Tianjin University of Traditional Chinese Medicine). En kupongprøve ble deponert i vårt laboratorium. Standardstoffet som echinakosid, akteosid og klorogensyre ble hentet fra National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Beijing, Kina). Renheten til hver standard var større enn eller lik 98 prosent. Acetonitril og metanol av kromatografikvalitet ble kjøpt fra Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Maursyre ble kjøpt fra Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, USA). De andre kjemiske reagensene var av analytisk kvalitet og kjøpt fra Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Kina).

Sprague-Dawley hannrotter (200–220 g) ble levert av Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Beijing, Kina, lisensnr. SCXK (Jing) 2014- 0004). Alle dyrene ble avlet og holdt under SPF-forhold i dyreanlegget. Eksperimentet ble utført i henhold til retningslinjene fastsatt av dyrepleien og bruker en komité av TJUTCM og i samsvar med veiledningen for stell og bruk av forsøksdyr utgitt av US National Institutes of Health (NIH-publikasjonsnummer 85–23, revidert 1996) ). Etter 1 ukes akklimatiseringsperiode ble rotter tilfeldig delt inn i fire grupper: kontrollgruppe, total polysakkaridgruppe, høymolekylær polysakkaridgruppe og lavmolekylær polysakkaridgruppe. Hver gruppe besto av 6 rotter, som ble avlet i samme bur.

2.2. Cistanche polysakkarider fremstilling

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma ble renset og tørket ved 40 grader i lufttørkeovnen, deretter knust til et grovt pulver. Det tørre grove pulveret ble ekstrahert med 85% vandig etanol (v/v) ved 60 grader to ganger, og 2 timer for hver gang. Faststoff-væske-forholdene var henholdsvis 1:12 og 1:10. Urterestene ble ekstrahert med vann ved 100 grader ytterligere to ganger, ekstraksjonstiden og forholdet mellom faststoff og væske var det samme med 85 prosent etanol. Vannløsningen ble kombinert og konsentrert under redusert trykk og deretter utfelt i 80% etanol, henstand under 4 grader i 24 timer. Bunnfallet ble isolert gjennom sentrifugering ved 8000 rpm i 10 minutter ved 4 grader og deretter lyofilisert for å få de totale polysakkaridene (ZT). ZT ble deretter oppløst i avionisert vann og filtrert på en 100 kDa hulfiber ultrafiltreringsmembran, de retentive infiltratet høymolekylære polysakkaridene (HM) ble samlet. Det permeerte filtratet ble filtrert med en 6 kDa ultrafiltreringsmembran. De retentive filtratet mellommolekylære polysakkaridene (MM) og de permeerte filtratet lavmolekylære polysakkaridene (LM) ble oppnådd.

2.3. Primær karakterisering av cistanche polysakkarider

Polysakkaridets innhold ble bestemt ved svovelsyrefenolmetoden ved bruk av glukose som standard [12]. Totalt proteininnhold ble bestemt ved BCA-metoden [13]. Monosakkaridsammensetningsanalysen ble utført med HPLC (UltiMate 3000-system) utstyrt med en SinoPak C18-kolonne (5 μm, 150 mm × 4,6 mm) og diodearraydetektor (VWD-3000). Den kromatografiske separasjonen av PMP (1-fenyl-3- metyl-5-pyrazolon) pre-kolonnederivater ble utført ved bruk av 100 mM fosfatbuffer og acetonitril i et forhold på 82:18 (v/v) , prosent) som en mobil fase ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min. 10 μL av hver prøve ble injisert og en analysetid på 30 minutter med deteksjon ved 245 nm ble brukt. Datainnsamling og -behandling ble utført ved hjelp av Chromeleon Software 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA).

Molekylvekten (Mw) ble bestemt ved høyytelses størrelseseksklusjonskromatografi (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0-system), utstyrt med et TSK gel G3000 PWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japan) og TSK gel GMPWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japan) kolonne og en RefractoMax521 brytningsindeksdetektor (RID). Prøvene ble eluert med 0,1 mL/L Na2SO4 ved en strømningshastighet på 0,5 mL/min. Kolonnens temperatur ble holdt ved 35 grader. Dextran som standarder og standardkurven ble plottet i henhold til elueringstiden plottet mot logaritmen av molekylvekt.

2.4. Farmakokinetisk studie

Blodprøver ble tatt fra den indre canthus kl. {{0}} t, 0.083 t, 0.167 t, 0.25 t, 0,5 t, 0,75 t, 1.0 t, 2.0 t, 3.{{20}} t, 4.0 t, 6.0 t, 8.0 t, 10 t, 12 t og 24 t etter administrering av echinacosid (100 mg/kg). Plasmaprøver ble oppnådd ved sentrifugering i 10 minutter ved 7500 pm. Til 100 μL av plasmaprøven ble det tilsatt 10 μL IS (klorogensyre) løsning og 500 μL metanol. Blandingen ble deretter vortexet i 3 minutter og sentrifugering ved 14,000 rpm i 10 minutter. Supernatanten ble samlet og tørket i nitrogen ved romtemperatur. Deretter ble resten oppløst i 100 μL 50 prosent vandig metanol, sentrifugering ved 14,{39}} rpm i 10 minutter igjen. Til slutt ble 3 μL av supernatanten injisert i LC-MS/MS-systemet for analyse. Prøvene ble analysert ved hjelp av metoden i henhold til tidligere rapportert. Den mobile fasen besto av CH3CN (løsningsmiddel A) og H2O (inneholdende 0,1 prosent HCOOH; løsningsmiddel B) ved bruk av følgende gradient: 0–1 min, 10 prosent A; 1–8 min, 10–90 prosent A; 8–9 min, 90–10 prosent A; 9–11 min: 10 prosent A. Prøven ble separert på ACQUITY HSS T3-kolonnen (1,8 μm, 100 mm × 2,1 mm id). Strømningshastigheten var 0,3 ml/min og kolonnetemperaturen ble satt til 35 grader. I MS-analysen ble negativ ioniseringsmodus brukt, med følgende optimaliserte parametere: kapillærspenning, 2,5 kV; desolvasjonstemperatur, 450 grader. Nitrogen ble brukt som desolvasjons- og kjeglegass, med en strømningshastighet på henholdsvis 900 L/t og 150 L/t. Kvantifisering ble således utført ved bruk av MRM av overgangene m/z 785,29 → 623,26 for echinakosid, m/z 353,06 → 191,07 for klorogensyre (IS), m/z 623,24 → 161,09 for akteosid. Kjeglespenningen for echinacoside, IS og acteosid var 100 V, 32 V og 74 V; kollisjonsenergi, 32 V, 14 V og 30 V.

2.5. Studie med kortkjedede fettsyrer (SCFA).

Sprague-Dawley hannrotter ble oralt administrert ZT, HM og LM i 3 uker. Bestemmelse av SCFA (eddiksyre, propionsyre, isosmørsyre, smørsyre, isovalerinsyre, valeriansyre og heksansyre) ved gasskromatografi (GC) ble gjort som beskrevet tidligere med noen få modifikasjoner [14]. Kort fortalt ble 0,5 g fekal prøve dispergert i 2,5 ml Milli-Q vann, vortexet i 10 min, og 7,5 ml 1 prosent HCl/etanol-løsning som inneholdt interne standarder (smørsyre 24,0 ug) /ml og 2- etylheksansyre 1,32 ug/ml som interne standarder) ble tilsatt. Blandingene ble homogenisert i 5 minutter og sentrifugert ved 14,000 rpm i 10 minutter ved 4 grader. Fem mikroliter supernatant ble injisert i delt modus i et forhold på 30:1. Bærergassen var N2 (99,999 prosent) ved 1 ml/min. Tilsetningsgassen (N2) var på 25 ml/min. Strømningshastigheten til H2 og luft var henholdsvis 30 ml/min og 300 ml/min. Avføringsprøver ble samlet på den 20. dagen av denne studien og umiddelbart lagret ved -80 grader.

2.6. Avføringsinnsamling, DNA-ekstraksjon og 16S rRNA-gensekvensering

Omtrent 200 mg av en fersk fekal prøve ble samlet i et 1,5 ml sterilt Eppendorf-rør fra per rotte og lagret ved -80 grader for senere DNA-preparering. DNA ble ekstrahert fra avføringen ved å bruke QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). Mengden av DNA ble bestemt ved å bruke et NanoDrop spektrofotometer (Thermo Electron Corporation); integriteten og størrelsen ble kontrollert ved 1,0 prosent agarosegelelektroforese. I henhold til konsentrasjonen ble DNA fortynnet til 1 ng/μL ved bruk av sterilt vann.

16S rRNA ble amplifisert ved å bruke en spesifikk primer (V4: 515F-806R) med strekkoden. Alle PCR-reaksjoner ble utført med Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Bland likt volum av 1 x belastningsbuffer (inneholdt SYB-grønn) med PCR-produkter og utfør elektroforese på 2 prosent agarosegel for påvisning. De lyse hovedstripene mellom 400 og 450 bp ble valgt for videre eksperimenter. PCR-produkter ble blandet i EU-tetthetsforhold. Deretter ble blanding av PCR-produkter renset med Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Tyskland).

Sekvenseringsbiblioteker ble konstruert ved bruk av TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit (Illumina, USA) etter produsentens anbefalinger og indekskoder ble lagt til. Bibliotekets kvalitet ble vurdert på Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) og Agilent Bioanalyzer 2100-systemet. Biblioteket ble sekvensert på en Illumina HiSeq 2500-plattform og 250 bp parede avlesninger ble generert.

2.7. Bioinformatikkanalyse

Strekkode- og primersekvensavskjæringen, sekvensmontering og datafiltrering i henhold til QIIME (V 1.7.0). Sekvenser med større enn eller lik 97 prosent likhet ble tildelt de samme OTU-ene. OTU-ene er merket som SILVA-etiketter. Alfa-mangfoldsindeksene som evaluerer rikdom av tarmmikrobielle fellesskap (ACE- og Chao1-målingene) og samfunnsmangfold (Shannon- og Simpson-målingene) ble beregnet ved hjelp av Qiime (versjon 1.9.1). Beta-diversitetsanalyse ble brukt til å undersøke de strukturelle variasjonene til de mikrobielle samfunnene ved bruk av UniFrac-avstand. Forskjeller mellom alle grupper ble testet av Tukey-testen og Wilcox-testen. Hovedkoordinatanalysen (PCoA) ble brukt for å forklare komposisjonsforskjellene mellom de fire gruppene ved å bruke R-pakker. Metoden for lineær diskriminantanalyseeffektstørrelse (LEfSe) er spesielt utviklet for biomarkørfunn og forklaringssekvenseringsdata. Og lineær diskriminantanalyse (LDA) ble brukt til å beregne effektstørrelsen til hver differensielt tarmmikrober og egenskapene assosiert med hver gruppe rotter. Korrelasjonsanalysen ble implementert ved å bruke R-pakker gcorrplot (versjon 1.1.463).

SCFA-data ble analysert ved å bruke ANOVA av SPSS 22.0.

3. Resultater og diskusjon

3.1. Fremstilling og kjemisk analyse av cistanche polysakkarider

Cistanches Herba brukes både som mat og medisin i Kina. Polysakkarider isolert fra det har tiltrukket seg stor oppmerksomhet på grunn av deres betydelige aktiviteter. I denne studien ble de fire delene av cistanche-polysakkarider (ZT, HM, MM og LM) oppnådd ved metoden med vannekstraksjon, alkoholutfelling og ultrafiltrering. Den kjemiske sammensetningen av fire deler av polysakkarider er vist i tabell 1.

Totalt sukkerinnhold i prøvene ved å bruke en standard glukosekurve. Resultatet viste at utbyttet av HM og LM var høyere enn MM. Polysakkarider viste forskjellige farmakologiske egenskaper, spesielt immunaktivitet. Studier har vist at monosakkaridinnholdet og type, molekylvekt, type substituentgruppe spiller en viktig rolle i aktivitetene til polysakkarider [15]. De forskjellige delene av monosakkaridsammensetningen til cistanche-polysakkarider var like, og mannose (Man), galakturonsyre (GalUA), glukose (Glc), galaktose (Gal) og arabinose (Ara) var de viktigste monosakkaridene.

Imidlertid var innholdet forskjellig blant de fire delene. Glukose og arabinose var hovedkomponentene i ZT og HM, mens glukose var hovedsukkerenheten i LM, dessuten ble det også påvist lite rhamnose og glukuronsyre (GlcUA) i disse fraksjonene.

De relative molekylvektene til prøvene ble undersøkt ved høyytelses størrelseseksklusjonskromatografi (HPSEC). I henhold til standardkurven for dektraner og retensjonstid i kolonnene, ble hovedtoppmolekylvektene i ZT observert ved 1,68 × 106 Da og 1,70 × 104 Da, i HM ble bestemt til å være 1,54 × 106, 2,06 × 105, og 4,81 × 104, i MM og LM ble bestemt til å være henholdsvis 1,09 × 104 og 2,05 × 104. Avlingene av dem var oppført i tabell 1 og utbyttet av MM var lavt og ikke nok for dyreforsøket. Tidligere studier har indikert de strukturavhengige effektene av cistanche-polysakkarider på forskjellige bioaktiviteter [16]. Ytterligere eksperimenter er fortsatt nødvendig, spesielt rensing, Fifin strukturell analyse bør brukes for struktur-aktivitetsstudien

3.2. Farmakokinetikkstudie

Farmakokinetikken til echinacoside ble undersøkt ved ultra-høyytelses væskekromatografi trippel quadrupol massespektrometri (UPLC og Xevo TQ-S) etter oral administrering av echinacosid. Gjennomsnittlig plasmakonsentrasjon-tidsprofiler for echinacoside ble vist i fig. 1. I henhold til medikament- og statistikkprogramvaren (DAS, versjon 2.0), passer farmakokinetikken til echinakosid til en modell med ett kammer, og den andre parametere i ZT-, HM- og LM-gruppene ble oppsummert i tabell 2, inkludert tiden for å nå maksimal konsentrasjon (Tmax), maksimal konsentrasjon (Cmax), areal under konsentrasjon-tidskurven (AUC) og gjennomsnittlig oppholdstid (MTR) ). En farmakokinetisk studie viste at gjennomsnittlig Cmax for echinakosid i ZT-, HM- og LM-gruppene ble funnet å være 646,4 ng/ml, 732,0 ng/ml og 898,4 ng/ml, som var 1,6, 1,8 og 2,2 ganger sammenlignet med kontrollgruppen (henholdsvis 406,8 ng/ml). Ved forbehandling med polysakkarider ble AUC(0-24 h) for echinacoside økt med henholdsvis 6,6 prosent, 36,7 prosent og 63,6 prosent i ZT-, HM- og LM-gruppene, sammenlignet med kontrollgruppen, som viste at polysakkaridene viste aktiviteten til å fremme absorpsjonen av et lite molekyl. Disse resultatene var ganske like at kitooligosakkaridene forbedret biotilgjengeligheten av fenyletanoidglykosider i Fructus Forsythia-ekstrakt [17] og polysakkaridene til Polygonum multiflorum forbedret de biofarmasøytiske egenskapene til 2, 3, 5, 4'-tetrahydroksy3-stilben{{{{3-8}}} O- -D-glukosid hos normale Sprague-Dawley-rotter [18]. Tarmmikrobiota inneholder en rekke medikamentmetaboliserende relaterte enzymer, og mekanismene til mikrobiomets former legemiddelfarmakokinetikk og farmakodynamikk er fortsatt ukjent [19]. Polysakkarider kan gi næring til tarmmikrobiotaen ved å øke immunsystemet, absorbere næringsstoffer og redusere veksten av patogener [20,21]. Selv om litteratur rapporterte at cistanche-polysakkarider kunne øke echinakosidmetabolitter (som akteosid) in vitro, fant vi ikke at de sameksisterende polysakkaridene har hatt nytte av echinakosid-konvertering til akteosid in vivo [10,11].

3.3. SCFA-innhold i rotteavføring

Tarmmikrobiota fermenterte polysakkarider, som produserer ulike bioaktive polymerer og metabolitter, slik som SCFAer [3]. Som hovedmetabolitter av polysakkarider ble SCFA analysert i avføringen. SCFA, inkludert eddiksyre, propionsyre og butyrat, er rapportert å ha gunstige effekter på glukose, kolesterol og lipidmetabolisme. Acetat er de viktigste SCFA-ene i tykktarmen og er et viktig substrat for kolesterolsyntese, propionat er et substrat for glukoneogenese i leveren og butyrat er det foretrukne energisubstratet til kolonocytter og har anti-inflammatorisk i tarmen [22,23].

Resultatene våre viste at acetat var de viktigste SCFA-ene som ble dannet i avføringen for alle grupper, etterfulgt av butyrat og propionat, mens konsentrasjonen av valerat og forgrenet SCFA (isobutyric acid og isovaleric acid) var lavere. Acetatet har vist seg å øke enzymaktiviteten i levervevet, noe som resulterer i bedre blodsukkerkontroll [24]. På den 20 dagen (fig. 2) hadde LM-gruppen et betydelig høyere nivå av acetat (pb 0,05), propionatandelen hadde en tendens til å bli redusert, og andelen butyrat hadde en tendens til å øke selv om endringen var ubetydelig i avføring sammenlignet med kontrollgruppen.

Imidlertid hadde HM-gruppen en betydelig lavere andel butyrat enn kontrollgruppen (pb 0.05). Innholdet av totale SCFAer mellom LM og HM var motsatt trend sammenlignet med kontrollgruppen, og bare LM-gruppen hadde en signifikant forskjell.

Mange faktorer påvirker nivået av SCFA i avføringen, inkludert sammensetningen og mengden av tarmmikrobiota, kostholdskilden og tiden det tar for mat å passere gjennom fordøyelseskanalen [22]. Akkumulerende studier viser at polysakkariders struktur, inkludert sammensetning av monosakkaridrester, grad av polymerisering, begge kan påvirke fermenteringsegenskaper og produksjon av SCFAs [25]. Fra resultatene våre kan vi konkludere med at cistanche-polysakkarider modulerer SCFA-produksjon og polysakkarider med forskjellige strukturer har forskjellige effekter.

3.4. Cistanche-polysakkarider induserte kjerneendringer i sammensetning og mangfold av tarmmikrobiota

Bakteriesammensetningen til fekale prøvene (n=4) ble undersøkt ved hjelp av en Illumina-høygjennomstrømningssekvenseringsteknikk. Biblioteket ble sekvensert på en Illumina HiSeq2500-plattform og 250 bp parede avlesninger ble produsert. De ble behandlet for taksonomisk identifikasjon og mangfoldsanalyse. Sjeldne refaksjonskurver (fig. 3a) viste at bakterieartsrikdom for hver prøve flatet ut ettersom prøvetakingsdybden økte, noe som indikerer at sekvenseringsinnsatsen var tilstrekkelig og at det totale mangfoldet i prøven ble fanget. Shannon-kurven (fig. 3b) viste at antallet unike bakteriearter økte etter hvert som antallet identifiserte sekvenser økte. Metning av Shannon-kurvene betyr at sekvenseringsdataene var nok til å dekke alle bakterieartene.

Alfa-diversitetsanalyse brukes til å måle mangfoldet i en prøve. Chao1-, ACE-, Shannon- og Simpson-diversitetsindekser ble beregnet ved Tukeys test for å beskrive alfa-diversiteten. Mangfoldsanalysen basert på ACE- og Chao 1-indekser avslørte samfunnsrikdommen til tarmmikrobiotaen på OTU-nivå. ACE- og Chao 1-indeksene var signifikant lavere i avføringsprøvene til LM-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (pb 0.05) (fig. 4a, b), noe som tyder på at artsrikdommen til tarmmikrobiotaen ble redusert ved LM-fôring. Mangfoldsanalysen basert på Shannon- og Simpson-indekser avslørte samfunnsmangfoldet i tarmmikrobiotaen. Det var ingen åpenbar endring i Shannon- og Simpson-diversitetsindeksene når de ble behandlet med cistanche-polysakkarider sammenlignet med kontrollgruppen.

Cistanche-polysakkarider induserte store endringer i taxa. I fire grupper var N98 prosent av OTU-ene dessuten relatert til phyla Bacteroidetes, Firmicutes og Proteobacteria. Den mest dominerende stammen var Bacteroidetes som bidro med 55.09 prosent, 57.89 prosent, 52.72 prosent og 69.{{20}}4 prosent av den fekale mikrobiotaen i kontroll, ZT, HM og LM-grupper, etterfulgt av Firmicutes, bidro med henholdsvis 41,39 prosent, 38.03 prosent, 42,15 prosent og 28,15 prosent (fig. 5a, b). Sammenlignet med kontrollgruppen, ble ZT-gruppen vist å resultere i svake effekter på den relative forekomsten av hovedfilene, bortsett fra at den lave forekomsten av Actinobacteria ble betydelig økt (MetaStat, pb 0,05). I HM-gruppen var Proteobacteria signifikant økt (pb 0,01). Dette indikerte at HM Cistanche polysakkarid kunne fremme berikelsen av proteobakterier for å påvirke metabolismen av stoffer hos rotter. I LM-gruppen økte forekomsten av Bacteroidetes, hvis viktigste bidragsytere var Prevotellaceae og Prevotellaceae_UCG-001 signifikant (pb 0,05) og forekomsten av Firmicutes, inkludert Peptococcaceae, reduserte signifikant (1p) signifikant. . Medlemmer av Prevotella og Bacteroides ble tidligere beskrevet som kostfibernedbrytere [26], som produserer metabolske sluttprodukter som succinat og acetat [27]. Slike funn bekreftet tidligere studier som viser at noen Prevotella spp. kan bryte ned komplekse plantepolysakkarider. En tidligere rapport viste også at de to dominerende bakteriedelingene, det økte forholdet mellom phyla Firmicutes/Bacteroidetes er assosiert med fedme [28]. Den lavere forekomsten av førstnevnte og den høyere forekomsten av sistnevnte i LM-gruppen antydet at LM kunne bidra til å miste kilo.

Av 72 påviste familier ble taxa top10 isolert og analysert (fig. 5c, d). Lachnospiraceae og Ruminococcaceae er to av de mest tallrike familiene som finnes i pattedyrtarmmiljøet og har vært assosiert med vedlikehold av tarmhelsen [29]. I denne studien har familier Bacteroidales_S24-7_gruppe (39,11 ± 6,04 prosent , 36,88 ± 4,44 prosent , 28,37 ± 4,01 prosent , 35,81 ± 7,91 prosent ), Prevotellaceae ( ± 0,81 ± 1,64 prosent , ± 1,64 prosent , ± 1,5 prosent). percent , 19.65 ± 8.97 percent , 21.05 ± 8.39 percent ), Lachnospiraceae (18.21 ± 5.20 percent , 15.09 ± 3.29 percent , 12.13 ± 7.14 percent , 13.12 ± 6.82 percent ), and Ruminococcaceae (9.64 ± 0.88 percent , 10.44 ± 2.45 percent , 11.27 ± 4,70 prosent, 8,19 ± 1,72 prosent) var dominerende i hver gruppe. S24-7-familien har blitt rapportert som inneholdt overflod av karbohydratnedbrytende enzymer [30]. Prevotellaceae viste en stigning og Lachnospiraceae viste en synkende tendens i polysakkaridgruppen sammenlignet med kontrollgruppen [31]. Det ble antatt at det ikke var tilsvarende cistanche polysakkarider aktive enzymer i Bacteroidales_S24-7_gruppen og Lachnospiraceae eller karbohydratbindende moduler av bakterier ved polysakkarider. Prevotella-slekter er rapportert i forbindelse med polysakkaridutnyttelsessteder og karbohydrataktive enzymer [32]. For å finne forholdet mellom bakterier og SCFA, ble Spearman korrelasjonsanalyse brukt. Noen slekter som Bacteroides, Prevotella og Lactobacillus i tarmmikrobiota spiller en viktig rolle i hydrolyseringen av polysakkarider til SCFAer [33]. Resultatene våre viste også at Bacteroidaceae korrelerte positivt og dominert mikrobiota produserte mer butyrat [34], mens Prevotellaceae korrelerte positivt og dominert mikrobiota produserte mer acetat. Lactobacillaceae og Ruminococcaceae dominerte mikrobiota produserte mer propionat (fig. 6).

Beta-diversitetsanalyse ble brukt til å undersøke de strukturelle variasjonene i tarmmikrobiotaen på tvers av prøvene ved bruk av UniFrac-avstandsmålinger. Forskjeller i Unifrac-avstandene ble analysert med Tukey og Wilcox-testen (fig. 7). Ved å bruke uniFrac uvektet analyse fant vi at LM fôrer mus klynger seg bort fra andre grupper. Et tilsynelatende klyngemønster ble identifisert for kontroll-, ZT-, HM- og LM-grupper.

Overfloden av disse mikrobielle ble differensielt modulert med polysakkaridbehandlinger. For å identifisere de spesifikke bakterielle taxaene i hver gruppe, ble sammensetningen av mikrobiotaen fra kontroll-, ZT-, HM- og LM-gruppene sammenlignet med metoden for lineær diskriminantanalyseeffektstørrelse (LEfSe). Linear Discriminant Analysis (LDA) brukes til å beregne effektstørrelsen for hver forskjellig rikelig funksjon. Terskelen for LDA-skåre er høyere enn de 4 som var på listen, noe som indikerer en høyere relativ fellesskapsoverflod i den tilsvarende gruppen enn i andre grupper. Ved å bruke denne metoden fant vi at 19 OTU-er var signifikant forskjellige i alle gruppene, nemlig 6 OTU-er i kontrollgruppen var høyere, bare 1 OTU i ZT-gruppen var høyere, 10 OTU-er i HM-gruppen var høyere og 2 OTUS i LM-gruppen var høyere enn andre grupper (fig. 8). Forekomsten av g_Prevotellaceae_ UCG_001 i LM ble økt betydelig (8,47 ± 1,9 prosent i LM, 0.40 ± {{21 }}.09 prosent i kontrollgruppen, pb 0.01). Resultatet stemte overens med rapporten om at Porphyra haitanensis og Ulva prolifera polysaccharides åpenbart kunne fremme spredningen av Prevotellaceae UGC-001 (pb 0,05) og Rikenellaceae RC9 (pb 0,01) [35].

4. Konklusjoner

Det er klart at det er en sammenheng mellom TCM kjemiske bestanddeler, tarmmikrobiota og visse metabolitter som er et resultat av tarmmikrobielle. Våre nåværende funn ga en metode for å studere echinacoside metabolisme synergier med forskjellige typer polysakkarider basert på tarmmikrobiota. Tarmmikrobiota kan metabolisere TCM og TCM kan påvirke veksten av tarmmikrobiota. På den ene siden, etter oral administrering av polysakkarider i tarmen, koder en rekke tarmmikrobioter for metabolske enzymer, som spiller en viktig rolle i nedbrytning av polysakkarider, og for å produsere bioaktive metabolitter. På den annen side har bidragene fra polysakkarider en viss innvirkning på balansen mellom tarmmikromiljøet i prosessen. Gjennom sammenligning av med eller uten polysakkarider fant vi at polysakkarider, selv om de ble fordøyd direkte av verten, potensielt fungerte som prebiotika, noe som førte til gunstige endringer i tarmmikrobiotaen ved å fremme veksten av probiotika. Cistanche-polysakkarider regulerte tarmmikrobiota-mangfoldet, øker gunstige bakterier og spesielt lavmolekylære polysakkarider forbedret veksten av Prevotella spp. Videre forbedret den forbedrede tarmmikrobiotaen absorpsjonen av echinacosid i Cistanche deserticola. Men årsaken er ikke helt klar, kan være et resultat av de kombinerte defektene i tarmmikrobiotaen, SCFAer og immunitet, og ytterligere forskning er nødvendig for en sykdomsmodell. Det er vanskelig å bevise effekten av prebiotika i sunne dyremodeller hvis mikrobiotasamfunn er stabilt og motstandsdyktig. Cistanche deserticola polysakkarider kan utvikles som probiotiske produkter for å regulere tarmmikrobiotaen og kan brukes på synergistisk metabolisme av små molekyler i fremtiden. Disse dataene vil hjelpe oss med å designe intervensjoner for å hindre sårbare grupper av mennesker i å forbedre helsen.

Erklæring om konkurrerende interesse

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt angående publisering av denne artikkelen.

Anerkjennelser

Forfattere er takknemlige for National Natural Science Foundation of China (tilskudd nr. 81830112 og 81904058)

Referanser
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Potential prebiotics and their transmission mechanisms: recent approaches, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, Tarmmikrobiota, vertshelse og polysakkarider, Biotechnol. Adv. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, De kritiske rollene til polysakkarider i tarmmikrobiell økologi og fysiologi, Annu. Rev. Microbiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Studier av bindingsegenskapene til tre polysakkarider med forskjellig molekylvekt og flavonoider fra maissilke (Maydis stigma), Carbohyd. Polym. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, Tarmmikrobiota -involverte mekanismer for å øke systemisk eksponering av ginsenosider ved å sameksistere polysakkarider i ginsengavkok, Sci. Rep. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Absorpsjon av Codonopsis pilosula saponiner ved sameksisterende polysakkarider lindrer tarmmikrobiell dysbiose med natriumsulfat -indusert kolitt hos modellmus, Biomed. Res. Int. 2018 (2018), 1781036 (18 sider).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum reduserer fedme hos mus ved å modulere sammensetningen av tarmmikrobiotaen, Nat. Commun. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Intestinal mikrobiota er involvert i de immunmodulerende aktivitetene til longan polysakkarid, Mol. Nutr. Mat Res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": en anmeldelse, Am. J. Chin. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Identifikasjon av echinacoside-metabolitter produsert av menneskelige tarmbakterier ved bruk av ultraytelsesvæske
kromatografi – kvadrupol time-of-flight massespektrometri, J. Agr. Food Chem. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Human gastrointestinal metabolism of Cistanches Herba vannekstrakt in vitro: klargjøring av den metabolske profilen basert på omfattende identifikasjon av metabolitter i magesaft, intestinal juice, human intestinal bakterier og tarmmikrosom, J. Agric. Food Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Kolorimetrisk metode for bestemmelse av sukker og relaterte stoffer, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Ny slimhinneimmunisering med polysakkarid-proteinkonjugater fanget i alginatmikrosfærer, J. Control. Utgivelse 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Sensitiv og forenklet påvisning av antibiotikapåvirkning på de dynamiske og allsidige endringene av fecal short -kjedefettsyrer, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Molecular modification of polysaccharides and resulting bioactivities , Compr. Rev. Mat. Sci. F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: en oversikt over dens kjemi, farmakologi og farmakokinetiske egenskaper, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Effekt av kitooligosakkarider på
tarmabsorpsjonene av fenyletanoidglykosider i Fructus Forsythia-ekstrakt, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, The influence of polysaccharides from Ophiopogon japonicus on 2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2- Z. Fu et al. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glukosid om biofarmasøytiske egenskaper in vitro og farmakokinetikk in vivo, Int. J. Biol. Macromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Precision medicine goes microscopic: engineering the microbiome to improve drug outcomes, Cell Host Microbe 26 (1) (2019) 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prospecting prebiotics, innovative evaluation methods, and their health applications: a review, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, Den internasjonale vitenskapelige foreningen for probiotika og prebiotika (ISAPP) konsensuserklæring om definisjonen og omfanget av prebiotika, Nat. Rev. Gastro. Hepat. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Colonic health: fermentation and short-chain fatty acids, J. Clin. Gastroenterol. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, gjennomgangsartikkel: kortkjedede fettsyrer i helse og sykdom, Aliment. Pharm. Ther. 12 (6) (1998) 499-507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Improvement of obesity and glucose tolerance by acetate in type 2 diabetic Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) rotter, Biosci. Bioteknologi. Biochem. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, In vitro fermentability of xylooligosaccharides and Xylo-polysaccharide fractions with different molecular weights by human fecal bacteria, Carbohyd. Polym. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Fiberutnyttende kapasitet varierer i Prevotella- versus Bacteroides-dominert tarmmikrobiota, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii er et tidligere heterotypisk synonym av Bacteroides chinchilla og har prioritet, Int. J. Syst. Evol. Micr. 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, Et fedme-assosiert tarmmikrobiom med økt kapasitet for energihøsting, Nature 444 (7122) (2006) 1027–1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Connections between the gut microbiome and metabolic hormones in early pregnancy in overweight and obese women, Diabetes 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Genomisk karakterisering av ukulturert Bacteroidales-familie S24-7 som bor i tarmene til homeotermiske dyr, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Fordelaktig effekt av butyratproduserende Lachnospiraceae på stress-indusert visceral overfølsomhet hos rotter, J. Gastro. Hepatol. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, De mangfoldige og omfattende plantepolysakkaridnedbrytende apparaturene til vommen og baktarmen Prevotella-arter: en faktor i deres allestedsnærværende? Syst. Appl. Microbiol. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Karbohydratenes rolle i tarmhelsen til griser, Anim. Mate. Sci. Tech. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Understanding the prebiotic potential of different dietary fibers using a in vitro continuous adult fermentation model (PolyFermS), Sci. Rep. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Effekt av to tangpolysakkarider på tarmmikrobiota hos mus evaluert ved Illumina PE250-sekvensering, Int. J. Biol. Macromol. 112 (2018) 796–802.